Bacterias Gram-positivas: Pared Celular (PDF)

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Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com Las bacterias Gram-positivas Pared celular bacteriana MANFRED ROHDE Centro Helmholtz de Investigación sobre Infecciones, HZI, Instalación Central de Microscopía, ZEIM, Braunschweig, Alemania ABSTRACTOEl capítulo sobre la pared celular de las bacterias Gram-positivas penetra la pared celular y la membrana citoplasmática, tiñendo así ofrece una breve reseña histórica sobre el descubrimiento de las paredes el citoplasma de las bacterias fijadas por calor. Después de la celulares de las bacterias Gram-positivas y sus constituyentes, así como los adición de yodo, se forma un complejo insoluble que es retenido métodos microscópicos aplicados para estudiar la envoltura celular de las por la pared celular bacteriana grampositiva tras la adición de un bacterias Gram-positivas. A continuación, se describen los diferentes bloques químicos que forman el peptidoglicano y la biosíntesis de las capas de decolorante como el etanol. Por lo tanto, las bacterias peptidoglicano y la alta renovación del peptidoglicano durante el crecimiento grampositivas aparecen casi moradas, mientras que las bacterias bacteriano. Se destacan los ácidos lipoteicoicos y los ácidos teicoicos de la pared gramnegativas retienen el colorante en menor medida o no lo como componentes principales de la pared celular. La caracterización de las retienen en absoluto y tienen que contrateñirse con un segundo cápsulas y la formación de vesículas extracelulares por parte de las bacterias colorante, safranina o fucsina, apareciendo rosadas o rojizas. Cabe Gram-positivas cierran la sección sobre las envolturas celulares, que tienen un destacar que algunas micobacterias mostraron un gran impacto en la patogénesis bacteriana. Además, se presenta la pared celular comportamiento de tinción indiferente cuando se tiñeron con especializada, compleja e inusual de las micobacterias. A continuación, se ofrece Gram, lo que sugiere que la pared celular de las micobacterias una breve visión retrospectiva del desarrollo de los exámenes con microscopio electrónico para estudiar las paredes celulares bacterianas. Se discuten diferentes podría ser de alguna manera diferente de los otros dos tipos. En técnicas y métodos de microscopio electrónico aplicados para examinar las las décadas siguientes, se hizo evidente que las paredes celulares/ envolturas celulares bacterianas, con la idea de que la mayoría de los métodos envolturas celulares son más diversas y que la tinción de Gram por Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. ilustrados deberían estar disponibles en un laboratorio de microscopio sí sola a menudo podía conducir a interpretaciones erróneas de la electrónico bien equipado y orientado a las ciencias de la vida. Además, se composición de la pared celular. describen métodos criogénicos recientemente desarrollados y en su mayoría bien Antes de principios de la década de 1950, cuando no se conocía la establecidos, como la congelación a alta presión y la congelación por sustitución composición química de las paredes celulares bacterianas, se especuló... (HPF-FS) y las criosecciones de bacterias vitrificadas hidratadas (CEMOVIS, criomicroscopía electrónica de secciones vítreas). Por último, se presentan métodos criogénicos modernos, como la criotomografía electrónica (CET) y la Recibió:13 de septiembre de 2018,Aceptado:17 de septiembre de 2018, criomicroscopía FIB-SEM (microscopía electrónica de barrido con haz de iones Publicado:24 de mayo de 2019 focalizado), que solo están disponibles en instituciones especializadas, pero que Editores:Vincent A. Fischetti, The Rockefeller University, Nueva York, NY; en la actualidad representan los mejores métodos y técnicas disponibles para Richard P. Novick, Skirball Institute for Molecular Medicine, NYU Medical estudiar las paredes celulares de las bacterias grampositivas en condiciones Center, Nueva York, NY; Joseph J. Ferretti, Department of Microbiology & cercanas a las naturales con gran detalle y alta resolución. Immunology, University of Oklahoma Health Science Center, Oklahoma City, OK; Daniel A. Portnoy, Department of Molecular and Cellular Microbiology, University of California, Berkeley, Berkeley, CA; Miriam Braunstein, Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina-Chapel Hill, Chapel Hill, NC, y Julian I. Rood, Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Monash ANTECEDENTES HISTÓRICOS University, Melbourne, Australia En 1884, el bacteriólogo danés Hans Christian Gram desarrolló Citación:Rohde M. 2019. La pared celular bacteriana Gram-positiva. Espectro un procedimiento de tinción para ver las bacterias teñidas microbiológico7(3):GPP3-0044-2018.documento:10.1128/ especificación bajo el microscopio óptico (1 ). Su método de tinción, hoy microbiológica.GPP3-0044-2018. llamado simplemente tinción de Gram, discriminaba entre una Correspondencia:Manfred Rohdemanfred.rohde@helmholtz- hzi.de pared celular bacteriana Gram-positiva y Gram-negativa. © 2019 Sociedad Estadounidense de Microbiología. Todos los derechos reservados. Introdujo un tinte, el violeta de genciana, que ASMscience.org/MicrobiolSpectrum 1 Rohde Se ha demostrado que la quitina o la celulosa, polímeros que Este desarrollo fue acompañado por invenciones técnicas, proporcionan estructuras rígidas a otros organismos, también especialmente métodos criogénicos en los que las bacterias se podrían ser el material de construcción de la pared celular fijan físicamente en lugar de químicamente, y abrió un nuevo bacteriana. En 1951, se realizaron experimentos con un material horizonte en la comprensión de las paredes celulares bacterianas. insoluble en fenol deCorynebacterium difteria (2 ) reveló la Cabe mencionar que incluso hoy en día están surgiendo nuevas glucosamina y el ácido diaminopimélico como componentes de la metodologías que impulsan los estudios morfológicos hacia pared celular bacteriana que están asociados con polisacáridos. El bacterias vitrificadas y sin teñir en un estado completamente examen químico de las capas de la pared celular de los hidratado y, por lo tanto, en un estado cercano a la naturaleza. estreptococos destacó la presencia de aminoácidos y hexosaminas Cabe destacar que los principales avances en la metodología de en el extracto de la pared celular, así como de ramnosa como microscopía electrónica requirieron un largo período de invención componente principal en las bacterias Gram-positivas (3 ,4 ). Los y prueba antes de que la técnica se introdujera en el mercado. Por análisis sistemáticos de varias bacterias Gram-positivas ejemplo, la microscopía electrónica tridimensional (3D) se identificaron las hexosaminas glucosamina y ácido murámico desarrolló unos 30 años después de la invención de la TEM. La como componentes principales junto con tres aminoácidos invención y el desarrollo precomercial de la criotomografía predominantes, a saber, d-alanina, lisina o ácido diaminopimélico electrónica (CET) se produjeron otros 30 años después. Debido al y ácido glutámico. Para entonces, también se reconoció una rápido desarrollo del rendimiento de las computadoras y al unidad basal básica típica en las paredes celulares de las Gram- progreso del software especializado en la actualidad, se puede positivas en la que la glucosamina y el ácido murámico están estimar que las nuevas técnicas de obtención de imágenes se unidos con tres aminoácidos a través de un enlace peptídico (5 ,6 ). introducen más rápido. Por ejemplo, la introducción del haz de Las bacterias gramnegativas expresan la misma unidad basal. iones crioenfocado (crio-FIB) combinado con un microscopio Numerosos análisis de otras bacterias revelaron que cada género electrónico de barrido (crio-FIB-SEM) como un nuevo enfoque o especie bacteriana suele caracterizarse por un patrón distintivo cercano a la naturaleza se vendió unos años después de la de aminoácidos, aminoazúcares y azúcares conectados a la unidad primera aparición de los FIB-SEM para muestras biológicas basal básica. Se creía que estas diferencias deberían proporcionar convencionales embebidas en resina. un patrón valioso para discriminar entre géneros/especies bacterianas (7 ,8 ). En los años siguientes se reconocieron otros compuestos de la pared celular de las bacterias Gram positivas, LA PARED CELULAR BACTERIANA como los ácidos teicoicos (AT), que son fosfatos de poliribitol (9 ) y Las bacterias son organismos en su mayoría unicelulares que se ácido lipoteicoico (LTA). Además, se encontró que numerosas pueden encontrar en una amplia variedad de entornos. Por lo tanto, proteínas estaban unidas a la pared celular. las paredes celulares bacterianas merecen una atención especial porque (i) proporcionan la estructura esencial para la viabilidad Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. Los métodos de tinción de bacterias para exámenes con bacteriana al protegerlas contra el entorno a menudo hostil, (ii) están microscopio óptico tienen limitaciones, ya que la resolución no es lo compuestas de componentes únicos que no se encuentran en ningún suficientemente alta como para revelar detalles estructurales. Con la otro lugar de la naturaleza, (iii) son responsables de la forma de las llegada de los microscopios electrónicos de transmisión (MET) en la bacterias, (iv) proporcionan un freno para los ligandos y las proteínas década de 1930 y el desarrollo paralelo de métodos de preparación para la adherencia a las células huésped, (v) exponen sitios receptores para muestras biológicas, la obtención de imágenes con microscopio para fármacos o virus, (vi) representan los sitios más importantes para electrónico de secciones ultrafinas de bacterias incrustadas se el ataque de antibióticos, (vii) proporcionan estructuras para la convirtió en el método de elección para estudiar las paredes celulares distinción y variación inmunológicas, y (viii) pueden causar síntomas de bacterianas en detalle a altas resoluciones (10 –13 ). Con esta enfermedad en animales y humanos. metodología, fue posible por primera vez discriminar entre las estructuras de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas en base a Química de la estructura principal de la pared celular bacteriana diferencias morfológicas en una imagen. En primer lugar, los La columna vertebral principal de la pared celular bacteriana es el protocolos de preparación de microscopía electrónica desarrollados peptidoglicano, también llamado mureína, que consiste en unidades para células o tejidos eucariotas también se aplicaron a las bacterias. lineales repetidas del disacárido.NORTE-acetilglucosamina (NAG) unida La era más fructífera comenzó cuando los protocolos de inclusión se aNORTE-Ácido acetilmurámico (NAM). Los disacáridos están personalizaron para bacterias y se pusieron a disposición nuevos tipos entrecruzados a través de cadenas de aminoácidos pentapeptídicas, a de resinas de inclusión, por ejemplo, las resinas Lowicryl para inclusión menudo flexibles, que forman una estructura en forma de malla (17 ). a baja temperatura, que permitieron la introducción del método de Químicamente, el peptidoglicano consiste en enlaces β-1,4 alternados. disminución progresiva de la temperatura (14 –16 ). Este NORTE-acetilglucosamina (GlcNAc; NAG) yNORTE-ácido acetilmurámico (MurNAc, NAM, 2 ASMscience.org/MicrobiolSpectrum  La pared celular bacteriana grampositiva una variante de GlcNAc con unaD-lactato unido al C-3 por un cine oyo-serina en algunas raras excepciones. El segundo enlace éter). La terminación de una cadena de peptidoglicano se aminoácido está ocupado en su mayor parte por unD-ácido logra en el extremo reductor mediante un residuo de 1,6- isoglutámico (D-iGlu). EnNeumonía por estreptococoesteD-iGlu anhidroMurNAc, en el que el C-1 y el C-6 de la cadena principal del se amida para producir unD-isoglutamina (18 ). El carbono γ de azúcar están unidos a través de un enlace éter. La apariencia del D-iGlu está unido al tercer aminoácido. Este aminoácido en la inusual 1,6-anhidroMurNac se utiliza para determinar el final de tercera posición del tallo peptídico tiene la mayor diversidad las cadenas. Los tallos peptídicos están unidos covalentemente a entre las bacterias. En general, se puede resumir que en la las cadenas de glicano con un enlace amida al carbono carboxílico mayoría de las bacterias Gram-negativas y algunas bacterias de la cadena principal.D-grupo lactilo de MurNAc. Una Gram-positivas, como en los bacilos y las micobacterias, esta característica distintiva del peptidoglicano es que los glicanos se tercera posición está ocupada por el inusual aminoácidomeso- conservan en todas las especies bacterianas, mientras que el tallo ácido diaminopimélico. Por el contrario, en la mayoría de las del péptido a menudo se modifica y es diverso, y contieneD demás bacterias Gram-positivas suele ser unyo-lisina (ver -aminoácidos. Unyo-La alanina se encuentra generalmente en la Figura 1 ). El tallo peptídico finalmente termina en dosD- primera posición del tallo pentapeptídico del grupo lactilo de alaninas, aunque diferentesD-Los aminoácidos también se MurNAc, que puede ser reemplazado por gli- pueden encontrar en este lugar (17 ). FIGURA 1La estructura principal de la pared celular bacteriana, el peptidoglicano; se muestran las dos cadenas de glicano (en negro). Los tallos peptídicos se representan en negro (lado izquierdo) y el segundo tallo peptídico, en azul. Observe la reticulación NH (en rojo) a través de los dos aminoácidos inusuales, el ácido m-diaminopimélico (m-Dap, en rojo) y la presencia deD-alanina en los tallos peptídicos. Se muestran dos tallos peptídicos más (verde y rosa) que pueden interactuar para generar la siguiente reticulación entre las cadenas de glicano. Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. ASMscience.org/MicrobiolSpectrum 3 Rohde En resumen, una característica distintiva de las bacterias Gram- positivas son las diferencias observadas en los tipos de enlaces cruzados en los que los péptidos se conectan al peptidoglicano. Hoy en día se pueden distinguir más de 100 quimiotipos y sus diferencias se basan en diferentes unidades de enlace y sustituyentes en la cadena peptídica (19 ). Debido a su estructura química única, el saco de peptidoglicano forma un polímero grande que se puede aislar y observar incluso con un microscopio óptico (verFigura 2 ). La FIGURA 2Imagen TEM tomada a un voltaje de aceleración de 80 kV de un sáculo diferencia entre las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas es de peptidoglicano deE. coliDespués de hervir durante 3 h en SDS al 10 %, el sáculo el espesor de la capa de peptidoglicano que rodea la membrana en forma de malla se tiñó negativamente con acetato de uranilo acuoso al 1 %, se citoplasmática. Las bacterias Gram-positivas presentan una capa secó al aire y se observó en un microscopio electrónico de transmisión normal. de hebras de peptidoglicano que puede alcanzar un tamaño de entre 30 y 100 nm o incluso más grueso, mientras que las bacterias Gram-negativas tienen una capa de sólo unos pocos nanómetros (verFigura 3 ). Mientras que el químico FIGURA 3Representación esquemática de las paredes celulares de las bacterias Gram-negativas y Gram- positivas. Una característica de las paredes celulares de las bacterias Gram-negativas es la presencia de dos membranas, la membrana citoplasmática y la membrana externa. Entre estas membranas se encuentra el espacio periplásmico, en el que se encuentra una capa muy fina de peptidoglicano; los lipopolisacáridos están unidos a la membrana externa, y las porinas están insertadas en la membrana externa. Una capa gruesa de peptidoglicano y la falta de una membrana externa son las principales características de las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas; en lugar de lipopolisacáridos, las bacterias Gram-positivas tienen ácido lipoteicoico y ácido teicoico localizados en la pared celular. El espacio periplásmico no se muestra ya que la existencia de dicho periplasma en las bacterias Gram-positivas aún se está estudiando. Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. 4 ASMscience.org/MicrobiolSpectrum  La pared celular bacteriana grampositiva Aunque se conoce la composición del peptidoglicano y la familia unido a otro UDP unido a la membrana citoplasmática que de proteínas que lo componen en varias bacterias diferentes, la funciona como un lípido de transporte. Este complejo se llama disposición general de estos componentes en las paredes lípido I y se encuentra en la cara citoplasmática interna de la celulares de las bacterias Gram-positivas no está completamente membrana. La unión covalente del segundo precursor UDP- resuelta. En el caso de las bacterias Gram-negativas, se ha NAG forma el complejo lipídico de transporte lípido II. demostrado con CET que densidades individuales muy delgadas, Entonces, por ejemplo, en el caso deEstafilococo aureus, Un que probablemente representan cadenas de glicano, recorren puente cruzado peptídico se une al tercer aminoácido del circunferencialmente el eje largo de la célula bacteriana (20 ). Por pentapéptido, que consta de cinco residuos de glicina. A el contrario, la disposición 3D del peptidoglicano en bacterias continuación, todo el complejo de lípido II se voltea sobre la Gram-positivas aún está en discusión (21 ). A lo largo de los años membrana citoplasmática hacia el lado extracelular por una se han propuesto tres modelos. El primer modelo sugiere que las flipasa. El proceso bioquímico preciso del mecanismo de cadenas de glicano corren circunferencialmente alrededor del eje volteo aún no se comprende por completo. El lípido II se largo como en las bacterias gramnegativas. Este modelo se incorpora al peptidoglicano en crecimiento naciente mediante denomina modelo "circunferencial" o "en capas" (22 ). En el proteínas de unión a penicilina (PBP) en el lado extracelular de segundo modelo, se supone que las cadenas de glicano corren la membrana. Este tercer paso implica, primero, una perpendiculares a la pared celular bacteriana en una red transglicosilación y, segundo, una reacción de hexagonal, por lo que esto se llama modelo "perpendicular" o "de transpeptidación realizada por las PBP para incorporar nuevos andamiaje" (23 ,24 ). Este modelo se propuso sobre la base de glicanos con péptidos flexibles en la capa de peptidoglicano estudios de resonancia magnética nuclear aplicando un existente (18 ,26 –31 ). Para obtener información detallada fragmento sintético de 2 kDa del peptidoglicano formado a partir sobre las reacciones químicas y las enzimas involucradas en de NAG-NAM (pentapéptido)-NAG-NAM (pentapéptido). La este proceso, consulte la revisión de Teo y Roper (18 ). resonancia magnética nuclear reveló que este fragmento forma una hélice dextrógira con una periodicidad de tres NAG-NAM por Recambio de peptidoglicano vuelta de hélice. Los dos primeros aminoácidos pueden adoptar El primer informe que describe la renovación de la pared un número limitado de conformaciones (24 ). Estudios de celular bacteriana se refería a la bacteria Gram-positiva. microscopía de fuerza atómica (AFM) con sáculos suavemente Bacillus megateriumy fue publicado hace más de 50 años (32 ). interrumpidos deBacillus subtilisEstablecieron el llamado modelo Más tarde, experimentos de pulsos perseguidos demostraron de cable enrollado, en el que los haces de hebras de glicano con precursores de pared celular marcados radiactivamente forman fracciones más gruesas de alrededor de 50 nm que que todas las bacterias Gram-positivas estudiadas, así como recorren la célula (25 ). Cabe señalar que nunca se ha considerado las Gram-negativas, llevan a cabo un recambio de pared un modelo con cadenas de glicano que corren paralelas al eje celular (33 –36 ). El modelo de crecimiento del peptidoglicano Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. largo, porque no estaba claro cómo un sáculo de este tipo podría en bacterias Gram-positivas implica un crecimiento de adentro alargarse. Además, el modelo de cable enrollado no se considera hacia afuera en el que el peptidoglicano recién sintetizado se en la actualidad, ya que la CET no mostró ninguna estructura entrega a la cara de la membrana citoplasmática de la capa de similar a un cable en la capa gruesa de peptidoglicano. Estas peptidoglicano en una forma relajada. Con la polimerización y observaciones anteriores podrían haberse basado en el hecho de la reticulación, el peptidoglicano se mueve hacia el exterior de que el peptidoglicano aislado se recolectó hirviendo bacterias, se la pared celular y se estira debido a la alta presión de abrió con una celda de prensa francesa, se diluyó en agua y se turgencia dentro de la célula bacteriana (37 ). Una vez que los secó al aire sobre mica antes de realizar la imagen AFM. peptidoglicanos estirados al máximo en las capas externas comienzan a envejecer, son posteriormente hidrolizados por autolisinas (38 ). Se estimó que alrededor del 50% de la masa Síntesis bioquímica de la capa total de la pared celular se renueva en una generación. Esto de peptidoglicano habría sido una pérdida masiva de recursos para las bacterias, La síntesis del peptidoglicano es un mecanismo de tres pasos, y se especuló que los componentes hidrolizados de la pared que se localiza en tres lugares dentro de una bacteria. La vía celular podrían ser reciclados por las bacterias. De hecho, se secuencial de la ligasa Mur está involucrada en la biosíntesis descubrió que este era el caso de las bacterias Gram-negativas del peptidoglicano. Los primeros pasos de la síntesis comoEscherichia coli,y las vías bioquímicas se entienden bien ( comienzan en el citoplasma bacteriano, donde se forman los 39 ,40 ). No quedó claro si las bacterias grampositivas también precursores unidos al pirofosfato de undecaprenilo (UDP), reciclarían el material de la pared celular. Se descubrió que se como el UDP-NAM-pentapéptido (UDP-NAM) y el UDP-NAG. En podían detectar grandes cantidades de fragmentos de pared el segundo paso, el UDP-NAM se celular en un medio de crecimiento de ASMscience.org/MicrobiolSpectrum 5 Rohde bacterias grampositivas cultivadas comoBacilo, Lactobacillus, unidades repetidas, o residuos de fosfato de glicerol o fosfato Listeria,yEstafilococopresiones (39 ). De esta manera, se estableció de ribitol. Estructuralmente, WTA y LTA exponen propiedades una renovación robusta de los componentes de la pared celular, con carga altamente negativa debido a los múltiples grupos de pero recién hace poco se demostró que esto se correlaciona con fosfato en la estructura y grupos con carga menos positiva altas tasas de reciclaje de dichos compuestos. A principios de la debido a los residuos de d-alanina insertados. LTA muestra década de 2010 se demostró que las bacterias Gram-positivas diferencias relativamente bajas en las estructuras de reciclan el material hidrolizado de la pared celular, al igual que diferentes bacterias, mientras que WTA es extremadamente E. coli,Aunque los pasos clave y los aspectos particulares de las versátil en sus grupos estructurales. No se entiende bien por vías involucradas son menos conocidos, mientras que los qué las bacterias Gram-positivas producen tanto LTA y WTA al ortólogos deE. coliSe encontraron enzimas involucradas en el mismo tiempo. Por ejemplo, LTA se puede eliminar, pero solo proceso bioquímico del reciclaje de la pared celular en varias si las bacterias se cultivan por debajo de 30 °C, mientras que bacterias Gram-positivas (41 ). Curiosamente, nuevas WTA es prescindible enB. subtilisyS. aureusen condiciones de observaciones sugieren que el reciclaje de la pared celular se laboratorio (46 ). La eliminación conjunta de LTA y WTA es letal activa cuando las bacterias Gram-positivas alcanzan la transición a porque ambas ya no pueden compensarse entre sí (47 ,48 ). la fase estacionaria de crecimiento, no en la fase de crecimiento Por lo tanto, la WTA y la LTA tienen que cumplir funciones exponencial, lo que explica por qué se detectaron constituyentes vitales y, de hecho, paraS. aureusSe ha demostrado que la de la pared celular hidrolizados masivos en la fase exponencial. pérdida de WTA da como resultado una menor colonización e Además, se ha informado que en las bacterias Gram-positivas el infección enen vivoExperimentos en el modelo de endocarditis reciclaje de la pared celular es un paso crucial para la de conejo (49 ). Según las estructuras químicas, los LTA se supervivencia en la fase estacionaria y/o en una fase de reposo o agrupan en al menos cinco tipos de LTA. A pesar de su papel persistencia para las bacterias patógenas (39 ,42 ). Además, debe en la infección, en los últimos años se han establecido otras tenerse en cuenta aquí que el proceso de entrega de funciones importantes de los TA: (i) Los WTA y los LTA pueden peptidoglicano recién sintetizado al lado interno de la pared proteger contra el estrés ambiental (50 ); (ii) LTA protege celular e hidrolización de peptidoglicano "más viejo" en el exterior contra moléculas dañinas como péptidos antimicrobianos y de la pared tiene que estar en un equilibrio dinámico antibióticos catiónicos (curiosamente, en la estructura de LTA extremadamente fuertemente regulado para asegurar el se inserta una d-alanina que es responsable de la protección) ( crecimiento y la división de la célula bacteriana. Si este equilibrio 51 –53 ); (iii) WTA y LTA son los principales mecanismos de se altera de alguna manera y se desprende más peptidoglicano control de las actividades enzimáticas, especialmente para las más viejo del exterior de la pared celular del que se puede autolisinas y las concentraciones de cationes en la capa de entregar al lado interno de la capa de peptidoglicano recién peptidoglicano (54 ); (iv) WTA es responsable de la unión al sintetizado, la capa se vuelve más delgada, con la consecuencia de receptor y a las superficies en la patogenicidad (49 ); (v) LTA Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. que toda la célula bacteriana puede ser lisada por la presión de dirige la colocación correcta de la maquinaria de división turgencia intracelular. Además, los antibióticos como la penicilina celular (50 ,55 ); (vi) WTA actúa como receptor de fagos (56 ); y y las cefalosporinas podrían unirse mejor a las PBP e inhibir aún (vii) WTA y LTA median la formación de biopelículas y su unión más la entrega de peptidoglicano recién sintetizado, lo que da a dispositivos médicos (57 ). como resultado una capa de peptidoglicano aún más delgada (43 ). La biosíntesis de LTA y WTA se lleva a cabo por diferentes vías, a pesar de que LTA y WTA presentan similitudes en su estructura. Se sabe que laS. aureus El sistema necesita al menos 12 genes ÁCIDO LIPOTEICOICO Y ÁCIDO TEICOICO DE PARED para la síntesis de la estructura principal de poli-Rbo-P (poliol COMO COMPONENTES PRINCIPALES ribitol fosfato) por parte de WTA. En cambio, solo tres genes DE LA PARED CELULAR participan en la síntesis de la estructura principal de poli-Gro-P TA, que representa un importante polímero de la pared celular y se (poliol glicerol fosfato) por parte de LTA (58 ). Para la modificación encuentra en muchas bacterias Gram-positivas, fue descrito por primera de las cadenas principales, intervienen numerosos otros genes en vez en 1958 (44 ,45 ). En la actualidad, los TA encierran dos polímeros la incorporación, por ejemplo, de d-alanina o hexosas. La síntesis abundantes de la pared celular bacteriana: (i) los LTA, que están anclados a de WTA se lleva a cabo enS. aureusen cinco pasos. Curiosamente, través de dominios lipídicos en la membrana citoplasmática, y (ii) los TA de la vía de síntesis de WTA comparte el UDP como transportador pared (WTA), que están unidos covalentemente en las capas de lipídico común. Como se mencionó anteriormente, el UDP también peptidoglicano. Los TA consisten en una familia diversa de glicopolímeros está involucrado en los primeros pasos de la síntesis de de la superficie celular bacteriana definidos químicamente como polioles peptidoglicano. La mayoría de los genes involucrados están unidos a fosfodiésteres. organizados en grupos de genes. 6 ASMscience.org/MicrobiolSpectrum  La pared celular bacteriana grampositiva (58 –61 ). Por otra parte, la síntesis de LTA comienza directamente sintetizados y ensamblados en la membrana citoplasmática y a partir del fosfatidilglicerol, que se encuentra en la membrana luego extruidos o secretados a través de la pared celular hacia el citoplasmática. La síntesis se inicia en el glicolípido, que también exterior (63 ). sirve como ancla de membrana para LTA. Por lo tanto, no se Dado que el componente principal de la cápsula es el agua, no necesita ningún precursor activado por nucleótidos como UDP. es fácil preservar dichos polisacáridos poliméricos en un estado Una vez más, entre diferentes bacterias Gram-positivas, existen natural para la observación mediante microscopio electrónico. Un amplias diferencias en la cantidad de genes involucrados, las método de elección es introducir una especie de andamiaje dentro longitudes de las moléculas de LTA y WTA y la modificación de las de las capas de la cápsula para evitar el colapso mediante fijación cadenas principales sintetizadas. Para obtener información más química y deshidratación. Como se ha descrito explícitamente detallada sobre la biosíntesis de WTA y LTA, recomiendo varias veces en este capítulo, las muestras completamente encarecidamente las revisiones de Brown et al. (58 ) y Percy y hidratadas y vitrificadas proporcionan la mejor visión cercana a la Gründling (62 ). naturaleza de las dimensiones de una cápsula bacteriana dada. Sin En resumen, nuevos estudios arrojarán luz sobre las embargo, la incorporación de lisina como un componente cargado relaciones estructurales y funcionales de los diferentes tipos positivamente, que reacciona mediante fuerzas de van der Waals de LTA y WTA y su impacto en la división celular, las superficies con las cargas negativas de la capa de la cápsula de los celulares bacterianas y la interacción con los receptores del polisacáridos, proporciona un método razonable para preservar la huésped, y deberían permitir la identificación de nuevos ultraestructura capsular en secciones ultrafinas. Para una receptores en la interacción bacteria-huésped. Además, se visualización rápida de las cápsulas en un TEM, la cápsula se seguirá desarrollando el papel de LTA en la inducción de puede teñir con nanopartículas de oro recubiertas de catiónicos efectos inmunoestimulantes. En particular, debería abordarse (nanopartículas de oro recubiertas de lisina).S. pneumoniaeSe ha la cuestión del tropismo celular, ya que las diversas diferencias demostrado que la fijación con formaldehído al 1% refuerza aún observadas en las estructuras químicas de LTA y WTA entre más la estructura de la cápsula, mientras que la fijación con bacterias Gram-positivas podrían revelar evidencia de que glutaraldehído da como resultado la pérdida de la estructura de la estas moléculas juegan un papel importante en las reacciones cápsula (64 ). Las partículas de oro unidas alrededor de la bacteria de reconocimiento del tropismo celular. muestran indirectamente la presencia de la cápsula y sus dimensiones (verFigura 4 ). Para cortes ultrafinos, las bacterias se incuban con acetato de lisina. En el segundo paso, la lisina unida CÁPSULA reacciona con rojo de rutenio, que posteriormente se precipita con La cápsula representa la capa más externa de la pared celular tetróxido de osmio. Los precipitados formados en las capas de una bacteria grampositiva. Está formada por un polímero capsulares brindan un respaldo razonable para la conservación de gelatinoso compuesto de polisacáridos o polipéptidos, o las cápsulas en varias bacterias Gram-positivas, lo que permite Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. ambos, y rodea a toda la bacteria con una capa gruesa.Bacilo medir las dimensiones de las cápsulas o obtener imágenes de las antracis,Por ejemplo, está compuesto de polímeros.D-ácido mismas.en vivocápsulas expresadas en sangre u órganos (52 ) (ver glutámico, mientras que la cápsula de los estreptococos del Figura 5 ). grupo A está formada por ácido hialurónico, un polímero repetido de disacáridos compuesto de D-ácido glucurónico, yNORTE-acetilo-D-glucosamina. En una cápsula adecuada, el polímero está firmemente unido a la VESÍCULAS EXTRACELULARES pared celular, mientras que si el polímero está unido de forma DE BACTERIAS GRAMPOSITIVAS laxa, la estructura suele denominarse capa viscosa, que no Las vesículas extracelulares formadas por bacterias Gram-negativas se tiene un patrón repetido. Las principales funciones de las conocen desde la década de 1960, mientras que los informes sobre cápsulas en las bacterias patógenas son (i) la protección contra vesículas extracelulares de bacterias Gram-positivas aparecieron por la fagocitosis por neutrófilos o macrófagos debido a la primera vez a principios de la década de 1990 (65 ,66 ). Todo el proceso superficie capsular lisa y las cargas negativas altamente de formación de vesículas extracelulares se conoce hoy en día como expresadas, (ii) la prevención de la lisis bacteriana mediada vesiculogénesis (67 ). Una razón para la falta de estudios de vesículas por el complemento y (iii) la contribución a los determinantes extracelulares de bacterias Gram positivas podría ser que se creía que de virulencia. Además, la composición de la cápsula es tales vesículas simplemente no podían generarse, debido a la gruesa responsable de diferentes serotipos, que se observan capa de peptidoglicano en tales bacterias. Ningún modelo decente fue particularmente en ciertas especies de estreptococos. En el capaz de explicar mecánicamente la formación y el paso a través de caso de los neumococos, los diferentes polisacáridos de la una malla de peptidoglicano tan gruesa en ese momento. cápsula se utilizan como antígenos de vacunas. La cápsula es ASMscience.org/MicrobiolSpectrum 7 Rohde FIGURA 4Visualización de cápsulas bacterianas Gram-positivas.A)Las nanopartículas de oro catiónicas (nanopartículas de oro de 15 nm recubiertas de lisina) marcan la cápsula gruesa deNeumonía por estreptococodespués de la fijación con formaldehído al 1% a pH bajo (estrellas). (B)La crio-FESEM en condiciones cercanas a las naturales revela la gruesa capa de cápsula deS. pneumoniaeMarcado con estrellas blancas. El espesor es comparable al de la cápsula etiquetada en (A); las muestras se congelaron con nitrógeno, se fracturaron por congelación a –105 °C, se grabaron por congelación a –105 °C durante 30 segundos y se recubrieron con oro/paladio por pulverización catódica.DO)Para secciones ultrafinas, las cápsulas se pueden conservar con el protocolo de inclusión de lisina-rutenio-osmio rojo (ver referencia52 ). Después de incrustarlo en resina LRWhite,Estreptococo suisEstá rodeado por una densa capa de cápsula (estrellas blancas). Las vesículas extracelulares de las bacterias gramnegativas a menudo El tamaño de las vesículas varía de 20 a 500 nm y se observan mejor se denominan vesículas de membrana externa (OMV), ya que se con un microscopio electrónico de transmisión (TEM) con tinción generan al desprenderse de las vesículas de las membranas externas ( negativa o con un microscopio electrónico de barrido (SEM) por 68 ,69 ). Por el contrario, las vesículas extracelulares de las bacterias emisión de campo (FESEM). En 2009, el primer informe sobre las MV de grampositivas suelen denominarse vesículas de membrana (MV). Se ha S. aureusSe publicó el estudio. El estudio encontró que las MV eran informado que las MV extracelulares sirven como vehículo de carga más o menos idénticas a las OMV descritas de las bacterias Gram- para el ADN, el ARN, los factores de virulencia, los negativas, con la excepción de que las MV presentan un tamaño de inmunomoduladores y las adherencias para las bacterias patógenas. vesícula mayoritariamente más pequeño de hasta aproximadamente Por lo tanto, se considera que las MV extracelulares desempeñan un 200 nm en comparación con las OMV (72 ). Cabe destacar que los MV papel importante en la patogénesis de los patógenos gramnegativos ( deS. pneumoniae yListeria monocytogenesson considerablemente 70 ,71 ). Ambos tipos de vesículas extracelulares tienen en común que más pequeñas que las de otras bacterias Gram-positivas, lo que están formadas por una bicapa lipídica que forma un lumen interno en sugiere que las bacterias sintetizan y regulan las MV de diferentes Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. el que se encuentran las cargas variables. maneras (72 –74 ). FIGURA 5Buena conservación de las cápsulas estreptocócicas bajoen vivocondiciones. (A)Cápsulas estreptocócicas (Estreptococo pyogenesadministradas por vía intravenosa) se conservan bien (estrellas negras) en el bazo bajoen vivocondiciones en el modelo de ratón incluso después de la fijación con glutaraldehído y formaldehído, deshidratación con acetona e incrustación en resina epoxi y corte ultrafino.B)Ampliación de otra bacteria que muestra una cápsula bien conservada (estrellas negras). Lo más probable es que las proteínas de la sangre hayan cubierto y conservado la cápsula y evitado su pérdida durante la fijación con aldehído. 8 ASMscience.org/MicrobiolSpectrum  La pared celular bacteriana grampositiva La generación, translocación y secreción son los principales problemas no resueltos sobre las vesículas monocelulares, considerando que necesitan ser liberadas a través de la gruesa capa de peptidoglicano hacia el medio ambiente. Se han reportado o discutido tres modelos hipotéticos: (i) las vesículas se generan a partir de la membrana citoplasmática en un proceso comparable al desprendimiento de las vesículas monocelulares de la membrana externa y luego son empujadas por la presión de turgencia interior a FIGURA 6Formación de vesículas de membrana en la superficie de través de las capas de peptidoglicano. Esto sugiere que el tamaño de Estreptococo pyogenesSerotipo M1 obtenido mediante FESEM después las vesículas monocelulares es pequeño ya que el diámetro está de la fijación química con aldehídos, deshidratación con acetona, regulado por la exclusión conocida del tamaño de partícula de la capa secado en punto crítico y recubrimiento por pulverización catódica con de peptidoglicano dada para una bacteria específica. (ii) las enzimas oro/paladio. modificadoras de la pared celular son liberadas o transportadas por las vesículas monocelulares, facilitando así la transmigración a través de las capas de peptidoglicano posiblemente al perder la malla en el sitio UNA PARED CELULAR ESPECIALIZADA de viaje. (iii) El transporte se produce a través de canales en la capa, lo EN LAS MICOBACTERIAS que sugiere que las MV son extremadamente flexibles en su Las micobacterias se clasifican como bacterias Gram-positivas, morfología, es decir, no siempre son vesículas esféricas, y pueden aunque también se las conoce como bacterias acidorresistentes liberarse a través de canales mucho más pequeños que el tamaño real debido a la alta densidad de lípidos en la pared celular, lo que de las MV esféricas que se encuentran en el medio ambiente (72 ). Por impide una tinción de Gram precisa. Por lo tanto, la tinción se lo tanto, se necesitan más investigaciones para aclarar la enigmática realiza con tinción de Ziehl-Neelsen. La complejidad de las paredes liberación de MV a través de las capas de peptidoglicano de las celulares de las micobacterias es una característica distintiva que bacterias Gram-positivas. La CET podría servir como el método de no se encuentra en otras bacterias. Tres macromoléculas elección para aclarar la transmigración a través de la capa de principales —peptidoglicano, arabinogalactano y ácidos micólicos peptidoglicano, ya que las bacterias se congelan instantáneamente e — son los componentes básicos de la pared celular de las incluso los eventos rápidos se pueden fijar. Sin embargo, la búsqueda micobacterias. La estructura de la pared celular de las de tales eventos en tomografías puede llevar mucho tiempo. micobacterias se describió en los años 1960 y 1970, y la Sin embargo, cada vez hay más evidencia de que las MV de las microscopía electrónica jugó un papel importante en la bacterias Gram-positivas juegan un papel importante en la descripción de las estructuras morfológicas inusuales de la pared patogénesis, ya que paraS. aureusSe ha informado de que las MV celular. El modelo aceptado actualmente de la pared celular se contienen PBP, que pueden bloquear la actividad de los basa en estudios que identificaron el complejo micolilo- Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. antibióticos β-lactámicos. Además, también se detectó el arabinogalactano-peptidoglicano como la estructura central de las regulador global MsrR, que está involucrado en la resistencia a la micobacterias (77 ). Esta disposición única que incluye lípidos y meticilina.S. aureusMV. Las MV pueden considerarse caballos de proteínas es responsable de la barrera de permeabilidad Troya involucrados en la transmisión de genes de resistencia entre característicamente importante y eficiente de la pared celular bacterias Gram-positivas (75 ). Además, se han encontrado varias micobacteriana, particularmente contra fármacos, y proporciona toxinas en los MV, como la listerolisina O enL. monocytogenesy la base para la potente patogenicidad de las micobacterias (ver neumolisina enS. pneumoniae.Ambas toxinas inducen la Figura 7 ). Debido a la presencia de una gran cantidad de lípidos formación de poros en las células huésped y, por lo tanto, son en la pared celular, los estudios anteriores se enfrentaron a la factores de virulencia importantes para la colonización y la dificultad de extraer los lípidos durante el protocolo de invasión.73 ,74 ). También se han descrito MV en estreptococos del deshidratación. Por lo tanto, durante mucho tiempo se cuestionó grupo A y su contenido se ha caracterizado en detalle (véaseFigura si los lípidos formaban una bicapa lipídica en la pared celular, 6 ). En resumen, no solo se detectaron proteínas asociadas a la como sugirió Minnikin en 1982 (77 ), y sugirió una membrana virulencia, como la proteína M1, la estreptolisina O y la serina asimétrica a la que los ácidos micólicos están unidos proteasa HtrA, sino que también se identificaron numerosas covalentemente como una lámina interna. La presencia de dicha proteínas metabólicas que residen en el citoplasma bicapa lipídica fue confirmada por estudios de fractura por estreptocócico, así como proteínas expuestas a la superficie, congelación, que definieron claramente un segundo plano de incluidas proteínas de superficie sin anclaje, lípidos y ARN. fractura, que es típico de una bicapa lipídica. Estos hallazgos Además, se demostró la participación del regulador de dos respaldaron la hipótesis de una segunda bicapa fuera de la componentes asociado a la virulencia CovRS, y la pérdida de CovRS membrana citoplasmática, a pesar de que estos estudios se resultó en una mayor formación de vesículas (76 ). realizaron con corinebacterias (78 ,79 ). ASMscience.org/MicrobiolSpectrum 9 Rohde FIGURA 7Representación esquemática de la pared celular de una micobacteria. Es característica una fina capa de peptidoglicano y arabinogalactano, a la que se adhieren grandes cantidades de ácidos micólicos. Un compuesto inusual es el lipoarabinomanano, que se adhiere a la membrana citoplasmática. En la parte más externa, los glicolípidos se unen a los ácidos micólicos; el transporte se facilita mediante porinas insertadas. La membrana externa de la micobacteria no se incluye en el esquema, ya que la presencia de dicha membrana externa aún está en discusión. Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. Sin embargo, la existencia de una bicapa fuera de la membrana fuera de la pared celular, lo que indica que las micobacterias citoplasmática fue muy criticada porque la bicapa propuesta expresan una membrana externa similar a la de las bacterias nunca se identificó claramente en secciones ultrafinas debido a Gram negativas. En segundo lugar, no se encontró evidencia preparaciones de incrustación que producen artefactos, como la de una membrana asimétrica; en cambio, se postuló una fijación química y la deshidratación con acetona. En cambio, se membrana simétrica y un espacio periplásmico adicional (79 ). detectó una zona más o menos translúcida, una capa externa, que Además, está claro que los lípidos extraíbles desempeñan un probablemente representa lípidos y ácidos micólicos, que divide la papel dominante en la integridad y las propiedades de la pared celular micobacteriana en una estructura de triple capa membrana micobacteriana. compuesta por la membrana citoplasmática, la pared celular y la El peptidoglicano micobacteriano se sintetiza como se observa capa externa (ver Figura 8 ). Esta zona translúcida está cubierta en otras bacterias, en el citoplasma, utilizando UDP y luego se da por una capa muy fina que se puede teñir y que consiste en vuelta sobre la membrana citoplasmática y se inserta en la red de cápsula y proteínas adheridas. La sustitución por congelación peptidoglicano en crecimiento por la acción de hidrolasas y PBP. reveló imágenes más o menos similares, aunque la pared celular Sin embargo, las micobacterias muestran una serie de diferencias parecía más delgada (80 –82 ). Se logró un gran avance en la en comparación con las bacterias modelo: (i) el peptidoglicano elucidación de la estructura de la pared celular externa de las micobacteriano está extremadamente entrecruzado, (ii) los micobacterias con imágenes cercanas a la naturaleza aplicando entrecruzamientos se basan en hasta el 80% del peptidoglicano secciones crio-ultrafinas y CET de muestras completamente total en entrecruzamientos peptídicos 3-3 en lugar de los hidratadas y vitrificadas (83 ). Estos estudios revelaron cambios entrecruzamientos peptídicos 4-3 encontrados en otras bacterias, importantes en el modelo actual. En primer lugar, se detectó una y (iii) la estructura principal del peptidoglicano muestra bicapa lipídica que cubría la modificaciones como glicolilaciones de NAM y ami- 10 ASMscience.org/MicrobiolSpectrum  La pared celular bacteriana grampositiva podría ser el método de elección actual, aunque la CET tiene algunos inconvenientes y restricciones, especialmente cuando se deben obtener imágenes de bacterias con un ancho de más de 0,4 a 0,5 μm. Los nuevos métodos de microscopía óptica de súper resolución, como la depleción de emisión estimulada, la microscopía de localización fotoactivada, la microscopía de iluminación estructurada y la fluorescencia de reflexión interna total, eran muy prometedores, pero un avance se vio obstaculizado por las limitaciones al obtener imágenes de estructuras FIGURA 8Aspecto típico de una estructura de triple capa de la pared celular micobacteriana deMicobacteria aviumesp. inmunomarcadas con fluorescencia. La expresión de etiquetas de paratuberculosisDespués de la inclusión especial, se aplicó el fluorescencia o proteínas de fluorescencia, como las proteínas método de osmiotiocarbohidrazida (TCH)-osmio; este método fluorescentes verdes, podrían alterar laen vivoactividades conserva los lípidos mucho mejor que otros métodos porque biológicas hasta cierto punto, lo que da lugar a localizaciones después del primer paso de tetróxido de osmio, el TCH se une al inexactas dentro de la célula bacteriana. Si el lector está interesado osmio unido a la muestra y, en el segundo paso de osmio, más en profundizar en este tema, recomiendo la literatura sobre la osmio se une al TCH, estabilizando así los lípidos. Además, las proteína MreB (involucrada en el proceso de división bacteriana) de bacterias se incluyeron aplicando el método de reducción los últimos años. Dependiendo del método de imágenes de alta progresiva de la temperatura hasta -50 °C y, a continuación, las bacterias se incluyeron en la resina hidrófoba Lowicryl HM20; este resolución aplicado, se pueden hacer diferentes suposiciones protocolo permite definir claramente la estructura de triple capa sobre su distribución, disposición y localización enB. subtilisSe de la célula micobacteriana, que se pierde en la mayoría de los realizaron experimentos para ver si MreB forma hélices en la célula demás métodos de inclusión, a pesar de los protocolos basados bacteriana (89 ). en crio. CM, membrana citoplasmática; CW, pared celular; OL, Se han llevado a cabo varios intentos para dilucidar la capa externa; OM, membrana externa. ultraestructura de las paredes celulares de las bacterias grampositivas. En las primeras imágenes TEM de bacterias incrustadas y cortadas dación deD-ácido glutámico ymeso-ácido diaminopimélico (84 –88 ultrafinas, el esquema de preparación incluía la fijación química con ). Además, el peptidoglicano micobacteriano está rodeado por una aldehídos, la introducción de metales pesados, la deshidratación con capa de arabinogalactano, un disacárido, que tiene polímeros de acetona/etanol y la incrustación en resinas adecuadas. Todos estos arabinano largos unidos. Cabe destacar que algunos galactanos pasos de preparación debían realizarse para hacer frente al entorno permanecen libres de polímeros de arabinano y, lo más "hostil" creado por el microscopio electrónico, es decir, el alto vacío y el importante, los extremos de la cadena de arabinano están bombardeo con electrones de alta energía que provocan el ramificados. Estos extremos ramificados son los socios de unión calentamiento de la sección. Por lo tanto, es obvio que estos Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. para las largas cadenas de carbono del ácido micólico. Estos tratamientos podrían no dar como resultado una conservación ácidos grasos incorporados son responsables de la capa cerosa adecuada de la pared celular nativa. Para superar algunos de estos extremadamente gruesa de las micobacterias y hacen que la efectos perjudiciales en la preparación de bacterias, se introdujeron pared celular micobacteriana sea en su mayor parte impermeable, métodos criogénicos, como la sustitución por congelación o las lo que contribuye a la patogenicidad. Para conocer las reacciones secciones crioultrafinas hidratadas. Con la llegada de las técnicas de y las enzimas detalladas involucradas en el proceso, consulte la congelación a alta presión, la conservación de las estructuras de la revisión de Jankute et al. (84 ). pared celular bacteriana se llevó aún más lejos en la dirección de condiciones cercanas a la naturaleza. Hoy en día, la CET es el mejor método para realizar imágenes en un estado hidratado, vitrificado y TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA congelado de las bacterias (90 ). Sin embargo, los inconvenientes de APLICADAS AL ESTUDIO DE LA MORFOLOGÍA DE esta técnica son que solo está disponible en ciertos institutos y LAS ENVOLTURAS CELULARES DE BACTERIAS necesita una infraestructura sofisticada y tiempo para realizar un GRAMPOSITIVAS análisis en profundidad. El futuro mostrará si el nuevo Desde principios de los años 50, la TEM se ha utilizado para micromaquinado crio-FIB-SEM avanzará en el desciframiento de los estudiar la morfología y la ultraestructura de las paredes detalles ultraestructurales de la pared celular bacteriana, ya que las celulares de las bacterias grampositivas. Sorprendentemente, bacterias examinadas están en su estado completamente hidratado y todavía hoy se necesita un método único que permita estudiar físicamente congeladas, superando el problema de la fijación química los detalles ultraestructurales de todas las diferentes bacterias con aldehídos. Esta técnica permite la observación de láminas grampositivas en condiciones cercanas a las naturales con un (aproximadamente microscopio electrónico. El nuevo CET ASMscience.org/MicrobiolSpectrum 11 Rohde Se cortan de la bacteria láminas de un espesor de entre 10 y 20 nm, lo Aunque son delgadas, podrían cubrir algunos detalles que permite acceder a pequeños detalles ultraestructurales. También ultraestructurales de interés cuando se observan a grandes aumentos. cabe mencionar que otras técnicas, como la difracción de rayos X y la Sorprendentemente, no existen imágenes de alta resolución de la litografía de rayos X, no han tenido éxito porque la pared celular pared celular de las bacterias grampositivas. Sin embargo, la FESEM ha bacteriana no es cristalina. También se ha implementado el AFM, pero sido muy útil para estudiar las interacciones de las bacterias patógenas con este método solo se puede obtener una imagen de la superficie de con las células huésped. una muestra y, por lo tanto, solo se pudo obtener información Las siguientes subsecciones ofrecen una descripción general de la ultraestructural limitada. mayoría de los métodos de microscopía electrónica que se aplican La misma restricción es válida para el microscopio electrónico de barrido. Con para estudiar las estructuras superficiales bacterianas. Si el lector está la llegada del microscopio electrónico de barrido fino (FESEM), fue posible interesado en protocolos detallados, consulte libros de texto estudiar las estructuras bacterianas con un aumento muy alto (hasta 400.000 especializados en métodos de microscopía electrónica. veces) y una resolución muy alta. Sin embargo, los microscopios FESEM nunca han podido proporcionar la cantidad de detalles ultraestructurales observados Recubrimiento o sombreado de metales pesados con los microscopios electrónicos de barrido en secciones ultrafinas. Esto se debe Cuando se examinaron muestras biológicas por primera vez con un simplemente a que el microscopio electrónico de barrido fino (FESEM) solo revela microscopio electrónico de transmisión, se hizo evidente que el contraste la topografía de la superficie de una célula bacteriana. Cabe destacar que el del material biológico es fundamental y que era necesario desarrollar microscopio electrónico de barrido fino (FESEM) no permite distinguir entre métodos para aumentar el contraste de las imágenes obtenidas con bacterias grampositivas y gramnegativas (véaseFigura 9 ). Además, las muestras microscopio electrónico de transmisión. Uno de los primeros métodos FESEM deben recubrirse para que sean conductoras. Este llamado recubrimiento aplicados fue el recubrimiento con metales pesados (91 ,92 ). Apareció una por pulverización catódica suele ser el último paso en un protocolo de línea de sombra detrás de las estructuras expuestas cuando se realizó el preparación de SEM. Las muestras suelen recubrirse por pulverización catódica recubrimiento de metal en un ángulo determinado. Si se conocían el ángulo con una fina película de 5 a 8 nm de oro, oro, paladio o platino. Aunque estas de recubrimiento y la longitud medida de la sombra resultante, se podía capas son muy calcular la altura de la estructura. FIGURA 9FESEM de muestras fijadas con aldehído, deshidratadas con acetona, secadas en punto crítico y recubiertas con oro/paladio mediante pulverización catódica.A)Escherichia coli (Gram- negativo), (B)Acinetobacter baumannii (Gram-negativo), (DO)Estreptococo pyogenes (Gram-positivas) y (D)Enterococcus faecium (Gram-positivas). Dado que FESEM solo revela las estructuras superficiales y no información del interior de las bacterias, FESEM no distingue entre bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. 12 ASMscience.org/MicrobiolSpectrum  La pared celular bacteriana grampositiva En años anteriores, el recubrimiento de metal se convirtió en el método de elección para la descripción ultraestructural de estructuras de pared celular con patrones regulares, llamadas capas S, adheridas a la pared celular bacteriana (44 ,93 –95 ). Tinción negativa El método de recubrimiento de metal tiene restricciones cuando se deben obtener imágenes de macromoléculas o complejos proteicos. Para tales fines, se consideró la idea de incrustar macromoléculas en sales de metales pesados como Na-K-fosfotungstato y, más tarde, acetato de uranilo y otros. FIGURA 11Imagen típica de una bacteria Gram positiva incrustada Las ventajas de la tinción negativa son múltiples: es (i) convencional,neumonía por estreptococo,después de la fijación con confiable y repetible, (ii) rápida, (iii) evita el aplanamiento de aldehído, contrastando con tetróxido de osmio y acetato de uranilo, las macromoléculas en la película de soporte cuando se seca al deshidratación e inclusión en resina epoxi. En secciones ultrafinas, la aire, (v) estabiliza la proteína en el haz de electrones y región de ADN suele estar agregada y forma un área translúcida (vi) permite determinar la forma y la estructura cuaternaria de un dentro de la célula bacteriana. Las capas gruesas de peptidoglicano complejo enzimático con una resolución de alrededor de 1,3 nm. son estructuras oscuras sin rasgos distintivos. CM, membrana Además, el uso de diferentes sales de metales pesados da como citoplasmática; CW, pared celular. resultado contrastes más altos o más bajos (96 –98 ). Cabe destacar que los virus teñidos negativamente y las enzimas más grandes abrieron la puerta a la microscopía 3D y al procesamiento Después de eso, los estudios morfológicos de las paredes celulares de imágenes a partir de la década de 1970 (99 ,100 ). La tinción bacterianas comenzaron a florecer. Las secciones ultrafinas tienen un negativa fue el método de elección cuando se analizaron los espesor de alrededor de 50 a 80 nm, lo que significa que una sola sacculos o tapas polares de peptidoglicano aislados (68 ). Sin bacteria que mide 1 μm de longitud se puede cortar en casi 15 embargo, la tinción negativa no es adecuada para diferenciar secciones. Una vez más, uno se enfrentaba directamente con el entre bacterias Gram-negativas y Gram-positivas (verFigura 10 ). problema del bajo contraste de las muestras biológicas. Por lo tanto, los primeros protocolos de inclusión generalmente incluían la fijación Incrustaciones convencionales con aldehídos; el contraste con metales pesados como el tetróxido de En la década de 1950, se introdujo la técnica de inclusión para osmio, el rojo de rutenio y el acetato de uranilo; y la deshidratación analizar los detalles ultraestructurales de las bacterias (10 ) porque con acetona/etanol dependiendo de la resina utilizada para la las bacterias intactas no eran adecuadas para estos estudios. Por lo inclusión. En ese momento, las resinas epoxi o metacrilato eran las Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. tanto, era necesario realizar cortes ultrafinos de las bacterias para más utilizadas y la polimerización se realizaba a 60 a 70 °C. Hoy en día, acceder a las estructuras morfológicas internas. Con la invención hay muchas resinas diferentes disponibles, y cada clase de resina de los ultramicrótomos, fue posible obtener cortes ultrafinos de ofrece una imagen ligeramente diferente de la ultraestructura muestras biológicas, facilitando así los estudios detallados de las bacteriana incrustada, dependiendo del protocolo de inclusión (ver paredes celulares bacterianas (véaseFigura 11 ). Figura 12 ). En FIGURA 10Imágenes TEM de bacterias teñidas negativamente. (A)Escherichia coli (Gram- negativas) y (B)Estreptococo gordonii (La tinción negativa con acetato de uranilo acuoso al 1% no puede discriminar entre bacterias Gram-negativas y Gram-positivas porque no se pueden resolver los diferentes espesores de peptidoglicano. ASMscience.org/MicrobiolSpectrum 13 Rohde Comenzó a principios de la década de 1980, cuando Mayer y Brüggeller aplicaron por primera vez la vitrificación de agua en muestras biológicas para estudios microscópicos electrónicos (104 ) y Dubochet et al. (105 –107 ). Anteriormente, la fracturación por congelación se introdujo en la década de 1960 (108 ). Fracturación por congelación y grabado por congelación Uno de los primeros métodos criogénicos aplicados fue la criofracturación y el grabado por congelación. Las muestras se congelan en nitrógeno y, de este modo, el agua de las muestras se lleva a su estado vitrificado. A continuación, las muestras se fracturan, a veces se graban y, posteriormente, se recubren con metal o carbono FIGURA 12Comparación de la inclusión en diferentes resinas o ambos. A partir de esta muestra, se produce una réplica que muestra de inclusión.A)Estafilococo áureoincrustado en resina de baja la topografía de la superficie. La profundidad de las estructuras viscosidad (LV). (B)S. aureusincrustado en resina LRWhite. topográficas depende del tiempo de grabado (109 ,110 ). Por lo S. aureusSe fijó, se tiñó con osmio y acetato de uranilo durante la general, durante la criofracturación, la línea de fractura se encuentra deshidratación con etanol y se embebió en la resina epoxi LV, un en la región hidrófoba de una membrana, es decir, en la membrana reemplazo para la resina Spurr ampliamente utilizada, y la resina citoplasmática bacteriana, exponiendo así proteínas transmembrana o acrílica aromática LRWhite. Ambos protocolos muestran características similares, a saber, una membrana citoplasmática (CM) claramente unidas a la membrana. Solo en raras ocasiones una línea de fractura definida y un peptidoglicano con dos zonas distintas, la zona de la atraviesa la pared celular o se encuentra dentro de la misma. Las áreas pared interna oscura (IWZ) y la zona de la pared externa (OWZ), que es que quedan expuestas dan una matriz más o menos sin características más translúcida en apariencia. La resina LRWhite conserva la OWZ o, como en las fracturas cruzadas, muestran una red polimérica que no mucho mejor en comparación con la resina LV. Además, el citoplasma se puede resolver más. Estos hallazgos no lograron producir nuevos de ambas células bacterianas tratadas de manera idéntica se ve conocimientos considerables sobre la pared celular de las bacterias bastante diferente. LRWhite ha demostrado ser una resina confiable Gram-positivas (111 ). para estudiar ultraestructuras bacterianas. Además, la contratinción de secciones ultrafinas antes del examen Congelación a alta presión y congelación por sustitución TEM influye en la apariencia de los detalles ultraestructurales en El desarrollo de la sustitución por congelación de muestras las secciones. Estos protocolos revelaron inequívocamente las congeladas rápidamente, que fue paralelo a la invención de la diferencias visibles entre las paredes celulares de las bacterias inclusión a baja temperatura de resinas como la serie Lowicryl de Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. Gram-positivas y Gram-negativas. En la mayoría de las secciones resinas de metacrilato, comenzó en la década de 1980 (14 , 16 ). ultrafinas, la pared celular Gram-positiva aparece como una Las bacterias se congelan rápidamente en propano líquido o etano estructura amorfa y, dependiendo de la resina y el protocolo de y luego se transfieren rápidamente a un medio de sustitución que inclusión aplicado, se pueden detectar algunos detalles contiene osmio y/o acetato de uranilo en acetona. estructurales, como el espacio periplásmico en las paredes Sorprendentemente, se demostró que un cierto contenido de celulares Gram-positivas (101 ,102 ). Debe quedar claro aquí que agua en acetona (hasta un 4%) dio como resultado una visibilidad estos protocolos de incrustación son propensos a inducir mucho mejor de las membranas (112 ). Las muestras se conservan artefactos en las muestras y, por lo tanto, influyen en la durante 2 días a –80 °C, se calientan hasta –50 °C y luego a –20 °C interpretación de los detalles ultraestructurales observados (103 ). y se dejan durante 1 día en cada paso. La siguiente incrustación se Sin embargo, estos métodos sirvieron como base para la mayoría puede realizar con resinas de baja temperatura, como resinas de las descripciones de la ultraestructura bacteriana y están Lowicryl, o las muestras se llevan a temperatura ambiente y se ampliamente disponibles en casi todas las unidades de incrustan con resinas convencionales (81 ,103 ,113 ). Durante la microscopía electrónica de ciencias de la vida. sustitución, las bacterias se tiñen y se deshidratan, lo que da como resultado una conservación visiblemente mejor de los detalles Métodos criogénicos ultraestructurales. La mayoría de las bacterias sustituidas por Los métodos de inclusión convencionales carecen de la precisión congelación en secciones ultrafinas son reconocibles por el hecho necesaria para investigar detalles ultraestructurales minúsculos de que no se puede observar ninguna región de ADN distintiva, debido a los posibles efectos adversos de los fijadores químicos, la mientras que en la inclusión convencional, el ADN se agrega introducción de metales pesados y la deshidratación durante la principalmente y forma la región de ADN translúcida típica en el preparación. El desarrollo de métodos criogénicos medio de la célula bacteriana (verFigura 13 ). 14 ASMscience.org/MicrobiolSpectrum  La pared celular bacteriana grampositiva Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. FIGURA 13Comparación de estreptococos del grupo G congelados a alta presión, incrustados de manera convencional y sustituidos por congelación.A y B)Sección transversal y longitudinal de una bacteria convencional incrustada en división. Nótese la prominente región translúcida de ADN y la ausencia de cualquier material adherido al exterior de la pared celular bacteriana. (C y D)Sección transversal y longitudinal de bacterias congeladas a alta presión y sustituidas por congelación. No se detecta ninguna región de ADN translúcida y el citoplasma bacteriano aparece como una estructura uniforme en toda su extensión. También se conserva algo de material adherido a la cara externa de la pared celular bacteriana. Actualmente, existen cientos de protocolos de sustitución que La presión es un potente crioprotector físico porque reduce se personalizan para satisfacer las necesidades de las muestras considerablemente el punto de congelación del agua y permite biológicas examinadas y abordar el propósito del estudio, por vitrificar muestras más gruesas. Los equipos disponibles ejemplo, para estudios ultraestructurales o estudios de actualmente congelan muestras a unos 200.000 kPa. A esta localización citoquímica inmunitaria. La congelación por presión, se pueden congelar muestras de hasta 200 μm sin que se sustitución se impulsó aún más con la congelación a alta presión formen cristales de hielo (108 ,114 –116 ). La combinación de estos de bacterias. Este método se desarrolló en la década de 1960 (108 dos métodos se considera actualmente la mejor aproximación ). A temperatura ambiente se alcanza una congelación adecuada para los estudios ultraestructurales de bacterias cuando no es de las bacterias con velocidades de enfriamiento de más de 10.000 posible acceder a CET. Un resultado de tales estudios es la Kelvin/segundo para vitrificar el contenido de agua en la muestra. aparición antes mencionada de un perímetro ASMscience.org/MicrobiolSpectrum 15 Rohde espacio plasmático en bacterias Gram-positivas (79 ,117 ,118 ). El cañón de galio se introdujo en la década de 1990, en particular para Sin embargo, las observaciones del CET han suscitado las ciencias de los materiales. El cañón de iones se utiliza para fresar el preguntas sobre estos supuestos. material de una muestra, que luego se obtiene mediante el haz de electrones con detectores adecuados, a menudo llamados detectores Crio-secciones de bacterias vitrificadas de electrones retrodispersados. A esto le sigue el siguiente paso de hidratadas y Cryo-FIB-SEM corte, el paso de obtención de imágenes, y así sucesivamente. Este Aunque la congelación a alta presión y la sustitución por congelación proceso también se conoce como seccionamiento de caras de bloques han sido pasos hacia condiciones cercanas a las naturales, no hay duda en serie. De este modo, se genera una serie de secciones que se de que los detalles ultraestructurales y la organización de las pueden alinear y procesar posteriormente con el software adecuado macromoléculas aún están cambiando hasta cierto punto. Esto ocurre para revelar las estructuras 3D de las regiones obtenidas mediante porque se espera que la sustitución del agua vitrificada y la imágenes. El uso del fresado con haz de iones se extendió más tarde a introducción de metales pesados durante el proceso de sustitución muestras biológicas incrustadas en plástico, como bacterias, células para la tinción de componentes bacterianos, incluso cuando se realiza eucariotas y tejidos (124 ,125 ). Ya en 2006 se inventó una versión en condiciones de frío, cambien las estructuras nativas. Para realizar criogénica de FIB-SEM y se probó para cortar bacterias vitrificadas observaciones realmente cercanas a las naturales, el contenido de congeladas con molienda iónica (126 ,127 ). Poco después, la crio-FIB- agua de las muestras debe vitrificarse para garantizar un estado SEM se introdujo en las ciencias de la vida y ahora está optimizada completamente hidratado, y las muestras deben observarse en el para imágenes 2D y 3D. Los estudios destacaron el hecho de que el estado de congelación vitrificada a continuación. fresado con haz de iones es un método libre de artefactos sin ninguna – 80°C. Las secciones crio-ultrafinas hidratadas cumplen estos dos compresión para cortar muestras biológicas vítreas congeladas criterios (verFigura 14 ). completamente hidratadas (128 ,129 ). Hoy en día, la técnica es tan Se introdujo la expresión CEMOVIS (criomicroscopía electrónica avanzada que se pueden extraer láminas de un grosor de entre 20 y 30 de secciones vítreas) para este criométodo.119 ). La técnica de nm de las bacterias vitrificadas, transferirlas a un crio-TEM y obtener cortar secciones crio-ultrafinas a –110 °C o menos es muy exigente imágenes en condiciones vitrificadas. Esta invención moderna permite y solo la han implementado algunos laboratorios para estudiar las realizar CET en dichas láminas y realizar un análisis 3D de las láminas paredes celulares bacterianas (117 ,118 ,120 ). Como ocurre con recortadas. Para ello, se aplica la siguiente técnica moderna de casi todos los métodos, el corte crio-ultrafino de bacterias tiene obtención de imágenes mediante microscopio electrónico, es decir, sus inconvenientes, como las marcas de cuchilla y las CET. compresiones. Por ejemplo, las fuerzas que actúan durante el proceso de corte, es decir, la compresión en la dirección de corte, Tomografía crioelectrónica pueden ser perjudiciales para la conservación de las paredes La CET, también llamada criotomografía electrónica, revela estructuras celulares o las membranas lipídicas (121 –123 ). Es muy deseable dentro de una célula bacteriana en condiciones esencialmente Descargado de https://journals.asm.org/journal/spectrum el 21 de octubre de 2024 por 161.18.202.198. un método que supere el adelgazamiento de las bacterias sin cercanas a la naturaleza. La reconstrucción 3D con un TEM se puede introducir ninguna compresión en la muestra. Imágenes de doble lograr con un enfoque tomográfico. Para esto, la muestra se inclina haz con un SEM (FIB-SEM) con un cañón de iones conectado generalmente entre -70° y +70° alrededor de un eje. Cada paso de (enfoque inclinación de 1 o 2 grados se registra para recopilar un conjunto de datos 3D. El conjunto de datos se alinea y se calcula el tomograma, un mapa de densidad. Dado que está disponible una vista 3D, se puede FIGURA 14Microscopía crioelectrónica de una sección ultrafina vítrea escanear a través de cada corte en el tomograma y se pueden ver las (CEMOVIS)Estreptococo pyogenes.Obsérvese que la membrana estructuras en ese corte específico. La base para la CET se conoce citoplasmática (CM) muy bien conservada y algunos detalles desde principios de la década de 1960, pero se tuvo que inventar el estructurales se pueden detectar en las capas de peptidoglicano de la pared celular (CW, puntas de flecha) en comparación con la apariencia progreso técnico para los crio-TEM, como la automatización de los oscura de las paredes celulares en bacterias incrustadas microscopios electrónicos, el filtrado de energía de electrones, la convencionales (comparar conFigura 11 ). introducción de cámaras de dispositivos de acoplamiento de carga lenta de alta sensibilidad para registrar imágenes, crio-TEM de 300 kV, placas de imágenes y placas de fase para registrar señales muy bajas ( 130 –135 ). Uno de los principales inconvenientes es la “mala” relación señal-ruido en las imágenes CET; por lo tanto, una vez más, la falta de contraste en las imágenes es un problema que se tuvo que solucionar. El CET es perfectamente adecuado para bacterias que no tengan un grosor superior a unos 300 a 400 nm y para estudiar 16 ASMscience.org/MicrobiolSpectrum  La pared celular bacteriana grampositiva Ultraestructuras bacterianas en condiciones cercanas a las La microscopía óptica correlativa y la microscopía electrónica están uniendo naturales. Si es necesario obtener imágenes de bacterias más fuerzas en un enfoque de microscopía óptica y electrónica correlativa en el gruesas, el método más prometedor es cortar láminas de la que las estructuras marcadas con fluorescencia se pueden hacer visibles y muestra mediante crio-FIB-SEM. Dado que la imagen en CET se luego estudiar con CET a alta resolución en condiciones vitrificadas. Por lo genera únicamente por la densidad del material biológico en sí, la tanto, la microscopía óptica y electrónica correlativa abre otro nuevo campo mayoría de las imágenes se realizan en configuraciones de obtención de imágenes en el que las estructuras de interés marcadas razonablemente poco enfocadas para obtener contraste en las con fluorescencia, incluso las estructuras móviles en la célula bacteriana, se imágenes. Por lo tanto, la capa de peptidoglicano se ve en la pueden seguir mediante imágenes en vivo, congelar instantáneamente en mayoría de los casos como una estructura sólida sin más detalles. un momento determinado y luego obtener imágenes de alta resolución Por ejemplo, la bicapa de membrana no se representa como lo mediante CET en condiciones cercanas a las naturales. han demostrado las imágenes de incrustación convencionales. Sin embargo, al cambiar y ajustar las condiciones de la imagen, la membrana externa y la membrana citoplasmática deE. colieran REFERENCIAS 1. 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Bioquímica Biophys Acta8:510–519http://dx.doi.org/10.1016/0006 paredes celulares de las bacterias grampositivas en condiciones - 3002(52)90082-6. cercanas a las naturales y, sin duda, nos ayudará a comprender 5. Cummins CS, Harris H.1956. La composición química de la pared celular en mejor la micromorfología del peptidoglicano junto con sus algunas bacterias Gram-positivas y su posible valor como carácter taxonómico.J componentes unidos. En particular, la discusión sobre un espacio Gen Microbiol14:583–600http://dx.doi.org/10.1099/00221287-14 - 3-583. periplásmico en las bacterias grampositivas comparable al de las 6. Trabajo E.1957. Bioquímica de la pared celular bacteriana.Naturaleza179:841– bacterias gramnegativas debería resolverse mediante métodos 847http://dx.doi.org/10.1038/179841a0. criogénicos. Se espera que se hagan visibles estructuras nuevas e 7. Cummins CS, Harris H.1958. Estudios sobre la composición de la pared imprevistas, que no se han visto antes. 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