Pràctica 1: Preparació de Material Biològic per a l'Observació PDF

PRÀCTICA 1: PREPARACIÓ DE MATERIAL BIOLÒGIC PER LA SEVA OBSERVACIÓ MATERIAL DE SEGURETAT PRÀCTIQUES o Guants de nitril o Bata de laboratori TIPUS OBSERVACIONS o Cèl·lules vives -> en suspensió en un medi de cultiiu o cèl·lules en cultiu (colorant per augmentar contrast no tòxic: blau de metilè) o Cè...

PRÀCTICA 1: PREPARACIÓ DE MATERIAL BIOLÒGIC PER LA SEVA OBSERVACIÓ MATERIAL DE SEGURETAT PRÀCTIQUES o Guants de nitril o Bata de laboratori TIPUS OBSERVACIONS o Cèl·lules vives -> en suspensió en un medi de cultiiu o cèl·lules en cultiu (colorant per augmentar contrast no tòxic: blau de metilè) o Cèl·lules mortes -> cal preservar l’estructura del teixit i conservar el màxim possible la morfologia i composició (donar contrast) o Diferenciar vives de mortes -> colorants com blau de tripa, que només poden travessar la MP de les mortes FIXACIÓ -> estabilització permanent dels teixits, impedint-ne l’autòlisi (just després de l’extracció del teixit) a) Fixació química: formaldehid (formol) -> inhibeix funcions dels enzims i endureix una mica b) Fixació física: congelació -> no desnaturalitza proteïnes, permet preservar activitat enzimàtica (tall amb criòstat) INCLUSIÓ I TALLAT -> enduriment de les mostres per obtenir-ne seccions molt primes que permetin el pas de la llum a) Parafina líquida -> endureixen per refredament b) Resina plàstica monomèrica -> endureixen per polimerització Primer cal deshidratar la mostra: 1. Rentar amb aigua per eliminar fixador 2. Deshidratar submergint en varies dissolucions d’alcohols de graduació creixent (70º, 80º, 90º, absolut) 3. Dissolvent orgànic (apolar), soluble en alcohol i parafina (xilè) -> dissol substàncies liposolubles i inactiva enzims Talls amb un micròtom (5 a 10 µm) i després pesquem mostres amb portaobjectes en bany d’aigua 30º Mostres fixades per congelació no cal per inclusió i tall amb criòstat TINCIÓ -> augmentar contrast (+comú: tinció histològica) Colorants normalment en medis aquosos -> desparafinar i rehidratar la mostra 1. Desparafinar -> submergir en xilè 2. Rehidratar -> submergir en concentracions decreixents d’alcohol (absolut, 90º, 80º, 70º) 3. Submergir en aigua Tinció doble amb hematoxilina i eosina -> diferenciar citoplasma del nucli 1. Cobrir tall amb hematoxilina 2. Rentar abundantment amb aigua corrent 3. Diferenciar (decolorar) amb alcohol-àcid clorhídric 4. Rentar amb aigua corrent 5. Cobrir amb xilé i després xilè-eucaliptol 119 MUNTATGE -> protecció dels talls amb un cobreobjectes Medi de muntatge ha de ser transparent i tenir el mateix índex de refracció que el vidre Resines sintètiques (DPX) no són hidrosolubles -> deshidratació de la mostra (alcohols i xilè, si no es pot deshidratar, goma aràbiga) Pràctica: o Fixació molt llarga que s’ha fet prèviament (fetges en formol) o Inclusió en parafina també s’ha fet prèviament o Per desparafinar s’han de fer 2 banys de 10 minuts en xilè (ja estarà fet) o Només 4 segons en alcohol-clorhídric o Residus tòxics (xilè, xilè-eucaliptol) al pot de residus orgànics 120