Histologie PDF - Introduction, préparation et techniques d'étude des tissus

Histology in research I - Introduction et préparation de ‫תתקינים‬ Hiérarchie du vivant Cellules : ~ 100 trillions dans le corps humain, 200 types différents Tissues : groupe de cellules organisées pour un but commun -​ Epithelium -​ Connective -​ Muscle -​ Nervous Organes : groupe de...

Histology in research I - Introduction et préparation de ‫תתקינים‬ Hiérarchie du vivant Cellules : ~ 100 trillions dans le corps humain, 200 types différents Tissues : groupe de cellules organisées pour un but commun -​ Epithelium -​ Connective -​ Muscle -​ Nervous Organes : groupe de tissus “ “. 80 organes différents. Organ systems : groupe d’organes “ “. Organisme : tous les organ systems réunis “ “. Anatomie = comment le corps est construit Physiologie = comment le corps fonctionne Histologie = étude des structures microscopiques des tissus En histologie, on a besoin d'un tissu, et d’un microscope (no shit Sherlock). Magnification = zoom Resolution = focus/macro Eye resolution = 100 um (pas quand t’es myope comme moi lolilol) contre 0.2 um pour un microscope. Virtual microscopy : technique qui génère des images numériques haute résolution d'échantillons histologiques, permettant leur visualisation et analyse sur ordinateur. ​Ce qu’on peut voir au microscope optique : Nucleus, Nucleolus, Mitochondria, Lysosome, Microvilli, Cilia, Stereocilia. Un noyau hétérochromatique (plus foncé) fait référence à un noyau cellulaire contenant de l'hétérochromatine, qui est une forme de chromatine dense et moins active. L'hétérochromatine est généralement associée à des régions du génome qui sont moins exprimées ou inactives. En revanche, la chromatine euchromatique est plus relâchée et active, permettant une transcription des gènes. Le microscope électronique permet d’observer des plus petits éléments comme l’appareil de golgi, les chloroplastes, les mitochondrions, et le RE. Histology slides : Slide preparation - étapes 1.​ Fixation : Stabilisation des tissus en les immergeant dans un fixateur pour préserver leur structure et empêcher la dégradation.​ 2.​ Embedding : Enrobage du tissu dans une matrice solide pour faciliter la coupe en fines sections.​ 3.​ Microtome sectioning : Découpe du tissu inclus en sections très fines à l’aide d’un microtome.​ 4.​ Flattening : Placement des coupes sur un bain d’eau tiède pour les détendre et les lisser avant leur transfert sur une lame de verre.​ 5.​ Staining (coloration) : Application de colorants spécifiques pour différencier les structures cellulaires et faciliter l’observation microscopique.​ Fixation : ❖​ Préserve les structures biologiques, interrompt les processus dynamiques, évite l'autolyse (processus par lequel les cellules se décomposent et se dégradent naturellement après la mort ou la destruction des tissus) et la décomposition bactérienne, conserve les tissus dans leur état naturel et fixe les composants cellulaires. ❖​ Méthodes : -​ Formol (40 % de formaldéhyde v/v) : provoque un crosslinking - processus chimique dans lequel des liaisons covalentes sont formées entre les chaînes polypeptidiques des protéines. Cela crée un réseau tridimensionnel qui stabilise la structure des protéines. -​ Congélation : plus rapide et meilleure préservation des lipides, mais les lames (slides) sont de qualité inférieure et de courte durée.  ❖​ Ne fixera pas les ions, petites molécules (glucose, ATP) et les lipides. Ce qui est fixé : -​ Nucléoprotéines : complexes d’acides nucléiques et de protéines -​ Protéines qui composent le cytosquelette et autres protéines qui leur sont liées -​ Protéines extracellulaires -​ Complexes de protéines avec des phospholipides, qui construisent les membranes. Ce qui ne l’est pas : -​ Petites protéines -​ Petits acides nucléiques, comme l’ARNt -​ Graisses neutres, comme les gouttelettes de graisse présentes dans les cellules graisseuses -​ Petits ions -​ De petits métabolites, comme le glucose Différentes macromolécules se décomposent parfois en raison du pH de la solution de fixation. Le collagène, par exemple, est partiellement dégradé, tout comme les protéoglycanes et les GAG, qui se trouvent dans la matière extracellulaire. Les protéoglycanes et les GAG ne subissent pas de fixation et ne sont maintenus dans les normales histologiques que si leur concentration initiale dans le tissu était particulièrement élevée, comme dans le matériel extracellulaire du tissu cartilagineux. Embedding : ❖​ Durcissement de l'échantillon pour permettre de futures coupes, non nécessaire pour les échantillons congelés. ❖​ Méthodes : -​ Paraffine : solvant organique avec un point de fusion bas. 2 avantages : La paraffine est liquide à 60 °C et solide à température ambiante. Par conséquent, il est possible d’insérer le tissu dans le matériau liquide, sans causer beaucoup de dommages, et de travailler avec le matériau solide à température ambiante. Peu chère. ​ Fixation : Les tissus sont d'abord fixés pour préserver leur structure. ​ Déshydratation : L'eau est retirée des échantillons, généralement par des bains d'alcools de concentration croissante. La déshydratation s’effectue en transférant progressivement les tissus dans des solutions avec des concentrations croissantes d’alcool, jusqu’à 100%. Le processus est basé  sur les propriétés amphipathiques de l’alcool, qui se dissout à la fois dans l’eau et les solvants organiques. Enfin, le tissu est transféré dans une solution organique, telle que le xylène. ​ Infiltration : Les tissus déshydratés sont immergés dans de la paraffine fondue, permettant à celle-ci de pénétrer dans les espaces intercellulaires. ​ Moulage : Les échantillons infiltrés sont placés dans des moules et refroidis pour solidifier la paraffine, formant ainsi un bloc. -​ JB-4 : polymère dur permettant des coupes plus fines. La méthode de travail avec JB-4 est légèrement différente de celle avec la paraffine, et les étapes de déshydratation peuvent être sautées. -​ Une autre méthode, plus rapide, consiste à congeler le tissu immédiatement après son retrait du corps. La congélation est utilisée à la fois pour fixer le tissu et pour le durcir. Cette méthode est très rapide et est principalement utilisée pour examiner les biopsies pendant la chirurgie, ou lorsque vous souhaitez examiner des molécules qui ne subissent pas de fixation chimique, mais les dispositifs résultants sont moins clairs que ceux de fixation chimique et d’empreinte de paraffine, et leur durée de vie est plus courte. ❖​ Déshydratation : élimination de l'eau de l'échantillon pour permettre la pénétration de la paraffine. Sectionning : Microtome ​ On coupe l'échantillon en tranches très fines (8um pour la paraffine et 1um pour le JB-40). Le tissu examiné doit être coupé en fines tranches, dont l’épaisseur ne dépasse pas 10 um Flattening : ​ On place l'échantillon sectionné dans de l’eau chaude. Rehydration : À ce stade, la matière organique (paraffine) dans laquelle le tissu est soumis est échangée avec de l’eau, afin de préparer le tissu à la coloration. L’incision est transférée au xylène, qui dissout la paraffine, puis dans des solutions avec des concentrations d’alcool progressivement décroissantes, jusqu’à l’eau, dans un processus opposé à la déshydratation. Staining : ​ Pour pouvoir distinguer les différentes structures. On utilise la méthode de H&E (hematoxylin and Eosin) staining. Les substances acides, qui sont teintes en couleur basique, sont appelées basophiles (amateurs de base), tandis que les substances basiques de couleur acide sont appelées acidophiles (amateurs d’acide) ou éosinophiles (amateurs d’éosine). H&E La coloration histologique habituelle est la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). Cette peinture utilise deux couleurs qui diffèrent par leurs propriétés. L’hématoxyline est une couleur de base, tandis que l’éosine est acide. Par conséquent, chacune des couleurs a une affinité différente pour les différents composants du tissu. L’hématoxyline colore les composants acides (tels que les acides nucléiques et les ribosomes) en bleu-violet, et l’éosine colore les composants de base (tels que le cytoplasme, les mitochondries et les fibres de collagène) en rose-rouge. Les substances acides, qui sont teintes en couleur basique, sont appelées basophiles (amateurs de base), tandis que les substances basiques de couleur acide sont appelées acidophiles (amateurs d’acide) ou éosinophiles (amateurs d’éosine). Vital stains Agents colorants utilisés pour colorer de manière sélective les cellules ou les tissus vivants sans leur causer de dommages importants ni leur mort. Good to observe : nucleus, cytoplasm, and sometimes specific organelles, depending on the type of dye used, goblet cells (‫)תאים בלעניים‬. Trichrome = AZAN : Un groupe de méthodes de coloration conçues pour indiquer l’emplacement du tissu conjonctif et de ses fibres de collagène, aidant à distinguer le tissu conjonctif dense du tissu musculaire lisse. La coloration est basée sur l’utilisation de trois couleurs qui diffèrent par le poids moléculaire et la taille des particules. Par conséquent, la perméabilité des couleurs varie entre les différents composants du tissu. Good to observe : collagen fibers (blue or green), muscle fibers and cytoplasm (red or pink), and nuclei (black or purple). For AZAN (type de trichrome) : noyaux et globules rouges (rouges), muscle (orange-rouge), collagène (bleu). Elastic stain Good to observe : elastic fibers in tissues, often used for examining blood vessels, seen in dark purple or black. Silver stain Good to observe : diverses fibres telles que les fibres réticulaires, vues en noir/brun foncé.. PAS: Conçu pour mettre en évidence la présence de sucres (molécules de sucre ou résidus de sucre dans les macromolécules, comme les glycoprotéines). Ainsi, la coloration est utilisée pour démontrer la présence de la membrane basale, des dépôts de mucus et de glycogène dans les cellules et du glycocalyx à la surface des cellules. La coloration PAS est basée sur la capacité de Schiff à réagir avec les groupes aldéhydes et à donner une couleur magenta. Good to observe : carbohydrates and carbohydrate-rich structures, such as glycogen, mucin, and basement membranes. It typically colors them magenta or bright pink. Can also color goblet cells which have sugar in them. Artifacts : Anomalies ou éléments indésirables qui apparaissent dans une image, un échantillon ou une observation scientifique, souvent en raison des méthodes de préparation, de traitement ou d'analyse. Ils peuvent masquer ou déformer la véritable structure ou la signification des données observées. Stages Artifact Fixation Changes in volume- tissue tears Halting a dynamic process Embedding Loss of water-soluble materials Loss of organic soluble materials Microtome Two dimensional images sectioning Plane of section Flattening Folds Staining Different staining methods- emphasis on one aspect, and effacement of others Types artifacts Artifacts prévisibles : ils sont courants et souvent liés à des étapes spécifiques du processus de préparation. Ils comprennent : ​ Artifacts de fixation :  -​ Changements de volume et déchirures tissulaires : les fixateurs comme le formol arrêtent les processus cellulaires et préservent la structure, mais peuvent altérer le volume tissulaire, provoquant potentiellement des déchirures. -​ Interruption du processus : l'arrêt des processus dynamiques dans les cellules, comme le cycle cellulaire, peut entraîner un état artificiel, « gelé ». ​ Artifacts d'embedding : -​ Perte de matières organiques et hydrosolubles : les processus de déshydratation et d'enrobage peuvent entraîner la perte de composants hydrosolubles, comme de petits ions et molécules, en particulier si de la paraffine est utilisée. ​ Artifacts de microtome sectioning : -​ Aspect bidimensionnel : lorsque les tissus sont découpés, ils sont réduits à de fines sections bidimensionnelles, qui peuvent ne pas capturer la structure spatiale complète (c’est en 2D car très fin au lieu de 3D). -​ Plan de coupe : l'angle de coupe peut conduire à des formes et des structures trompeuses dans le tissu observé. ​ Artifacts de flattening : -​ Pliages : pendant l'aplatissement, les tissus peuvent développer des plis ou des rides qui imitent les structures naturelles ou obscurcissent les détails sous-jacents. ​ Artifacts de coloration : -​ Highlights incohérents : différentes techniques de coloration mettent en évidence certains aspects du tissu, en minimisant ou en masquant éventuellement d'autres. Par exemple, H&E peut mettre en évidence les noyaux mais pas les détails du tissu conjonctif, tandis que d'autres colorations peuvent se concentrer sur les tissus conjonctifs. Artefacts imprévisibles : ces artefacts sont moins courants et plus difficiles à anticiper. Ils peuvent survenir en raison d'irrégularités dans la manipulation, des conditions environnementales ou d'erreurs aléatoires à n'importe quelle étape de la préparation. Coupes 1.​ Jejunum - small intestine (H&E)  2.​ Colon - PAS On peut voir à droite beaucoup de Goblet cells colorées en foncé car elles sont riches en sucre. Ici, on peut bien distinguer la basement membrane car elle est riche en sucres. 3.​ Estomac - H&E Cellules très roses -> cellules éosinophiles -> cellules basiques. Bien qu’elles sécrètent du liquide acide dans l’estomac, les cellules sont remplies de cytoplasme et, étant très actives et donc ayant besoin de beaucoup d’énergie, elles sont remplies de mitochondries, les deux éléments étant basiques. 4.​ Adipocytes - H&E Cellules graisseuses, en blanc. 5.​ Liver - H&E and vital stains On peut voir qu’il est très dense car beaucoup de noyaux apparents. On trouve aussi beaucoup de macrophages, que l’on peut seulement observer avec la technique de vital stain car cellules vivantes. En violet : les macrophages, ici visibles grâce àvital stain.