Laboratoire 4 Recombinaison, liaison et cartographie génétiques PDF

Laboratoire 4 Recombinaison, liaison et cartographie génétiques Le labo 4 est une extension du labo 3 qui étudiait les croisements entre la souche sauvage de Sordaria fimicola et l'un de ses mutants à ascospores grises ou beiges. Dans le labo 3, la possibilité que les deux loci géniques associés aux...

Laboratoire 4 Recombinaison, liaison et cartographie génétiques Le labo 4 est une extension du labo 3 qui étudiait les croisements entre la souche sauvage de Sordaria fimicola et l'un de ses mutants à ascospores grises ou beiges. Dans le labo 3, la possibilité que les deux loci géniques associés aux couleurs grises et beige soient liées n'a pas été considérée, car un seul locus à la fois était évalué. Dans le labo 4, vous évaluerez simultanément les deux loci de sorte que vous devez considérer la possibilité que les deux peuvent se trouver sur le même chromosome (liaison génétique). Le présent document de travail fut adapté de A study of Gene Linkage and Mapping Using Tetrad Analysis in the Fungus Sordaria fimicola (Glase, J.C., 1995). RÉSULTATS D'APPRENTISSAGE ATTENDUS Théorie Comprendre la signification et les implications des concepts de marqueurs génétiques, de liaison génétique et de cartographie génétique Comprendre la signification et les implications de la liaison génétique et du principe de Mendel de l’assortiment indépendant des allèles Expliquer les caractéristiques de Sordaria fimicola qui en font un modèle approprié dans les études génétiques Comprendre comment la méiose et les enjambements chromosomiques se traduisent par différents arrangements d'ascospores dans les asques Expérience pratique et analyse des données Acquérir de l'expérience sur les stades du cycle de vie des champignons et sur les méthodes « stériles » de manipulation des micro-organismes Calculer la distance génétique entre un gène et le centromère d’un chromosome Utiliser le test du khi carré pour évaluer la qualité de l'ajustement entre les valeurs observées et les valeurs attendues pour tester la liaison génétique entre deux marqueurs ou loci génétiques Accéder et parcourir une base de données génomique pour trier et récupérer l’information pertinente à des gènes d'intérêt INTRODUCTION Au labo 3, vous avez inoculé un croisement entre la souche mutante avec spores grises (gt+) et la souche mutante des spores beiges ou tans (g+t) de Sordaria fimicola. La présente section fournit l’information pour comprendre et analyser les résultats de ce croisement. Un rappel du test du khi carré est également fourni puisque vous aurez utiliserez ce test statistique pour évaluer si les gènes gris et beige sont liés ou non. Test du khi carré Le test du Khi carré est souvent utilisé en génétique pour comparer les résultats expérimentaux avec ceux prédits à partir d’un modèle théorique. Par exemple, si nous avons une série de dénombrements de génotypes pour une population, alors nous pouvons comparer ces valeurs expérimentales aux valeurs prévues par le modèle de Hardy-Weinberg. Nous concluons que la population ne respecte pas l'équilibre de Hardy-Weinberg si la probabilité que les valeurs observées puissent dériver de l’équation de Hardy-Weinberg est inférieure à un seuil critique. Le niveau de signification fréquemment utilisé est =0.05, c'est-à-dire que les valeurs observées ont moins d'une chance sur vingt d'être dérivées à partir de l’équation de Hardy-Weinberg. Pour calculer cette probabilité, nous utiliserons une statistique qui est le khi carré ou 2. Si Oi est l'ensemble des valeurs observées, et Ei l'ensemble des valeurs prédites, alors Considérons les échantillons suivants. Alors la valeur 2 est estimée telle que décrite dans le tableau ci-dessous. Notez que le degré de liberté (df) pour le test du khi carré est n-1 où n est le nombre de classes. Dans cet exemple, il y a trois génotypes et le degré de liberté est donc de deux. Genotype Observed Expected (O-E)2/E AA 30 33 0.27 Aa 55 49 0.73 aa 15 18 0.50 Total 100 100 1.50 Par convention, nous utilisons le niveau de probabilité 0.05 comme valeur critique. Si la valeur X2 calculée est inférieure à la valeur 0.05, nous acceptons l'hypothèse nulle. Dans l'exemple cidessus, la valeur X2 calculée est de 1.50 et elle est inférieure à la valeur de P de 0,05, soit 5,991. Nous acceptons alors l'hypothèse nulle selon laquelle les données correspondent ou sont compatibles avec l'équilibre de Hardy-Weinberg. Tableau de la distribution du X2 Df 0.5 0.10 0.05 0.02 0.01 0.001 1 0.455 2.706 3.841 5.412 6.635 10.827 2 1.386 4.605 5.991 7.824 9.210 13.815 3 2.366 6.251 7.815 9.837 11.345 16.268 4 3.357 7.779 9.488 11.668 13.277 18.465 5 4.351 9.236 11.070 13.388 15.086 20.517 Le tableau ci-dessous montre la répartition des phénotypes dans un échantillon de la population de papillons tigrés de Scarlett. L'hypothèse nulle est que la population est dans les proportions de Hardy-Weinberg, et l'hypothèse alternative est que la population n'est pas dans les proportions de Hardy-Weinberg. Est-ce que la répartition phénotypique de la population des papillons tigrés de Scarlett est compatible avec l'équilibre de Hardy-Weinberg? Complétez le tableau et expliquez votre calcul et votre raisonnement. Phenotype Whitespotted (AA) Intermediate (Aa) Little spotting (aa) Total Observed number 1469 138 5 1612 Expected number _____ _____ _____ (O-E)2/E _____ _____ _____ _____ Insérez et justifiez vos données et votre conclusion. Hypothèse des gènes liés Considérons la figure 1. Puisque des paires de chromosomes homologues s'alignent indépendamment l'une de l'autre lors de la métaphase I de la méiose, deux arrangements sont possibles (paire 1 et paire 2). Supposons que les chromosomes clairs pour les deux paires proviennent d'un parent et que les chromosomes noirs proviennent de l'autre parent. Pour un grand nombre de cellules subissant la méiose, la moitié des cellules montreront l’arrangement A et l’autre moitié l’arrangement B. Figure 1. Illustration de la disposition indépendante des deux paires de chromosomes homologues (paires 1 et 2) par rapport au plan équatorial lors de la métaphase I de la méiose. Les couleurs claires et noires illustrent l'origine parentale des chromosomes. Si les deux gènes responsables de la coloration des spores sont situés sur la même paire de chromosomes homologues, ils seront conjointement transmis vu leur liaison physique le long du même chromosome. Dans la figure 2A, le chromosome homologue de droite provient du parent ayant des spores beiges (un allèle t et un allèle g+) tandis que l'homologue de gauche provient du parent avec des spores grises (un allèle t+ et un allèle g). Si les deux gènes sont liés et qu'il n'y a pas de croisement (Figure 2A), seuls des asques PD seront produits. Sur la figure 2B, un enjambement chromosomique se produit entre le locus du gène des spores beiges et son centromère. Sur la figure 2C, l’enjambement se situe entre les loci des deux gènes. Dans les deux cas, les asques T sont produits. Notez que le placement des loci des gènes gris et beige à la figure 2C est arbitraire et n'implique rien sur leur emplacement réel. Figure 2. Prédiction des types d’asques selon l'hypothèse des gènes liés pour les gènes des couleurs d’ascospores grise et beige. Note: Les chromosomes noirs proviennent de la lignée avec les spores grises, tandis que les chromosomes clairs proviennent de la lignée avec les spores beiges. Si un chiasma ou un enjambement peut se former entre deux chromatides, rien n’empêche la formation d’un enjambement double, triple ou d’ordre supérieur. En outre, étant donné qu'il existe deux paires de chromatides, il est possible que plus de deux chromatides soient impliqués dans des enjambements. Un double enjambement entre deux chromatides est représenté à la figure 2E. Les figures 2D et F montrent des enjambements doubles impliquant quatre chromatides. Notez que certains enjambements multiples (Figure 2E et F) sont génétiquement indétectables, car ils produisent des asques PD ou NPD. Ces types d’enjambements multiples nous amènent à sous-estimer les distances sur une carte génétique. Cependant, comme la probabilité d’enjambements multiples est faible et parce que les enjambements multiples produisent en moyenne des nombres égaux d’asques PD et NPD, cette complication ne change pas nos prédictions pour le croisement entre les lignées à spores grises et beiges. En plus des asques PD et NPD, vous verrez une variété d’asques T, certains avec les quatre phénotypes de spores et certains avec seulement deux phénotypes dans un arrangement 2:2:2:2 ou 2:4:2. Cependant, il existe certaines restrictions sur les types d'asques à deux phénotypes qui sont possibles. Noir (g+t+) et gris (gt+) seulement ou noir (g+t+) et beige (g+t) seulement ne sont pas possibles (dans un arrangement 4:4 ou non 4:4) parce que ces arrangements ne respectent pas le nombre initial d'allèles présents dans le croisement entre les mutants gris (gt+) et beige (g+t). De même, incolore (gt) et gris (gt+) seulement ou incolore (gt) et beige (g+t) seulement ne sont pas possibles (dans un arrangement 4:4 ou non 4:4) parce que ces arrangements ont des ratios d’allèles différents que ceux présents chez les deux lignées parentales gris (gt+) et beige (g+t). En résumé, les asques à deux phénotypes ne peuvent inclure que les phénotypes tan (g+t) et gris (gt+) ou incolores (gt) et noirs (g+t+). En conclusion, si deux gènes sont liés, nous nous attendons à obtenir des asques PD et T, mais seulement une petite proportion d’asques NPD. La prédiction de l'hypothèse des gènes liés peut donc s’énoncer tel que suit : Si les gènes pour les couleurs de spores grise et beige étaient liés, alors les deux gènes ne devraient pas ségréguer de manière indépendante et la fréquence des asques PD devrait être supérieure à la fréquence des asques NPD. PROCÉDURES EXPÉRIMENTALES PARTIE 1 Éclatement des périthèces (similaire à la procédure complétée dans le laboratoire 3) 1. Lavez vos mains et nettoyez et désinfectez votre espace de travail à l'aide du flacon pulvérisateur fourni. 2. Récupérez le pétri du croisement entre les mutants gris et beige que vous avez inoculé lors du labo 3. 3. Prenez une lame de microscope propre et ajoutez une goutte d'eau à chacune de ses deux extrémités. 4. Avec un cure-dent, prélevez délicatement (pas besoin de creuser dans l'agar) 10 à 15 périthèces (ces structures reproductrices ressemblent à des grains de poivre) dans la zone où les hyphes des deux souches se chevauchent (Figure 3). Si vous transférez trop de périthèces sur votre lame de microscope, il sera plus difficile d'appuyer sur la lamelle et d'éclater les périthèces sans casser la lamelle. Figure 3 Les périthèces contenant des asques hybrides résultant de croisements entre les deux souches inoculées sont particulièrement abondants dans les zones encerclées. Les périthèces sont également abondants à la périphérie des boîtes de pétri, mais des taux plus élevés d'avortement des spores sont observés dans cette région, possiblement en raison d'une densité plus élevée du mycélium fongique causant l'épuisement des nutriments et une interférence avec la synthèse et le dépôt de pigments dans la paroi cellulaire des ascospores. 5. Transférez les périthèces recueillis dans l'une des deux gouttes d'eau sur de votre lame à microscope, puis répétez la procédure pour transférer d’autres périthèces dans l'autre goutte d’eau. Utilisez le même cure-dent pour disperser délicatement les périthèces dans l'eau. 6. Placez une lamelle sur chaque goutte d'eau contenant les périthèces recueillis. Pour éviter que des bulles d'air ne soient piégées sous la lamelle, placez un bord de la lamelle sur l'échantillon et abaissez-la délicatement à l'aide d'un cure-dent. 7. Utilisez un cure-dent ou le bout avec efface d'un crayon pour presser doucement sur chaque lamelle afin de rompre l’enveloppe des périthèces et libérer la rosette interne d'asques (Figure 9). Utilisez le microscope et l'objectif 10x pour vérifier l’étalement des asques et, au besoin, préparez d’autres périthèces. PARTIE 2 Décompte et catégorisation des ascospores 1. Voici quelques trucs pour identifier les phénotypes des spores observées en microscopie optique : a. Abaissez l'intensité lumineuse afin de bien percevoir les différences de couleur; b. Ajustez la mise au point fine afin d’obtenir une meilleure résolution des spores; c. Évitez les asques immatures (leurs spores ont un aspect granulaire et montrent généralement une couleur pâle mal définie). 2. Utilisez un code abrégé pour catégoriser la séquence des spores dans chaque asque. Par exemple, l'asque illustré à la Figure 6 peut être représentée comme TTBBBBTT (de l’extrémité arrondie vers l’extrémité étroite; analyse d’octades) ou, puisque tous les phénotypes de spores sont en double en raison de la division mitotique suivant la méiose, simplement TBBT (analyse de tétrades). 3. Chaque équipe doit classer un minimum de 75 asques pour assurer une taille d'échantillon adéquate. Entrez les données individuelles dans le tableau 1. La section suivante fournit de plus amples informations sur la façon de remplir le tableau 1. Rappel: (1) les asques PD sont 4 gris: 4 beiges ou l’inverse; (2) les asques NPD sont 4 incolores: 4 noires ou l’inverse; et (3) les asques T sont toutes les autres séquences 2:2:2:2 ou 2:4:2 avec des combinaisons phénotypiques de spores grises et beiges ou incolores et noires. PARTIE 3 Analyse des données Chaque groupe catégorise un minimum de 75 asques et résume ses résultats dans le tableau 1. Tableau 1. Données obtenues du croisement entre les lignées mutantes de Sordaria fimicola à spores grises et beiges. (Note: C = spores claires, N = spores noires, B = spores beiges, G = spores grises.) Phénotypes (p. ex. CCGG) PD, NPD ou T? Gène pour couleur grise Génotype *Ajoutez des lignes supplémentaires au besoin. Spores Spores non recombinantes (#) recombinantes (#) Gène pour couleur beige Spores non Spores recombinantes (#) recombinantes (#) Gènes liés ou non liés Le critère à utiliser pour décider si les deux gènes pour les couleurs des spores sont liés ou non est l’indépendance de leur assortiment ou ségrégation. Comme nous l'avons vu précédemment, si les gènes codant pour les couleurs beige et grise sont dissociés, on s'attend à un nombre égal d’asques de type ditype parental (PD) et d'asques de type ditype non-parental (NPD). Écrivez les hypothèses nulle et alternative pour le test du khi carré à effectuer afin d'évaluer la liaison ou la non-liaison entre les loci géniques gris et beige de S. fimicola. Insérez votre réponse. Complétez le tableau ci-dessous en utilisant uniquement les données de votre équipe. Quelle est la valeur critique du khi carré pour une probabilité de 0.05? (tableau de distribution du khi carré de distribution de khi carré) Quelle est la valeur de khi carré que vous avez obtenue pour vos données? Les résultats de votre équipe corroborent-ils l'hypothèse liée ou non liée? Type d’asques PD NPD Total Valeur observée Valeur prédite (O-E)2/E Insérez et justifiez vos réponses. Remplissez ce tableau en utilisant les résultats combinés pour l'ensemble de votre section. Est-ce que les résultats de votre section entière corroborent l'hypothèse liée ou non liée? Les conclusions basées sur les résultats de votre équipe sont-elles cohérentes avec celles de l'ensemble de votre section? Type d’asques PD NPD Total Valeur observée Valeur prédite (O-E)2/E Insérez et justifiez vos réponses. Cartographie génétique Reportez-vous aux résultats combinés de votre section de laboratoire pour remplir le tableau ci-dessous et estimer la distance en unités cartographiques entre le gène de la couleur grise des ascospores et le centromère du chromosome sur lequel il se trouve. Répétez l'exercice pour la distance entre la couleur beige et son centromère. Les résultats sont-ils comparables aux résultats publiés? ASCOSPORES Gène pour la couleur grise Gène pour la couleur beige Recombinantes Nonrecombinantes Total Insérez vos réponses accompagnées de vos calculs et explications. Test d’un modèle génétique Les valeurs publiées des distances gène-centromère sont respectivement de 27 et 33 unités cartographiques pour les gènes des couleurs beige et grise des ascospores de S. fimicola (Olive, 1956). Puisque le nombre de spores, qu'elles soient non recombinantes ou recombinantes, dépend du nombre d'asques que vous avez observés (taille réelle de votre échantillon), vous devez utiliser les asques (et non les ascospores) comme catégories dans le test du khi carré. Par exemple, si la distance gène-centromère est de 27 unités cartographiques et sachant qu’un enjambement chromosomique cause la recombinaison chez la moitié des ascospores, on peut s'attendre à ce que 54% des asques résultent d’un enjambement chromosomique. Vos valeurs observées seront le nombre réel des asques résultant d’un enjambement chromosomique. Pour les valeurs prévues selon le modèle, le nombre total d'asques observés doit être respectivement multiplié par 0.54 et 0.46 pour les asques prévus avec et sans croisement génétique. Reportez-vous aux résultats combinés de votre section de laboratoire pour remplir le tableau ci-dessous. ASQUES Gène pour la couleur grise Gène pour la couleur beige Observés et associés à un enjambement chromosomique Observés et non associés à un enjambement chromosomique Prévus et associés à un enjambement chromosomique Prévus et non associés à un enjambement chromosomique Vous allez maintenant référer aux valeurs publiées en unités cartographiques pour prédire les fréquences des asques PD, NPD et T en supposant que les gènes des couleurs beige et gris sont non liés. Si la distance entre le locus beige et son centromère est de 27 unités cartographiques, alors la fréquence des divisions méiotiques (ou asques) résultant d’un enjambement entre le locus beige et son centromère est égale à 0.54. Par conséquent, la fréquence des divisions méiotiques ou asques sans enjambement pour ce gène sera de 0.46 (1.00 – 0.54). Si la distance entre le locus gris et son centromère est de 33 unités cartographiques, alors la fréquence des divisions méiotiques ou asques résultant d’un enjambement entre le locus gris et son centromère est égale à 0.66. De même, la fréquence des divisions méiotiques ou asques sans enjambement pour le gène gris serait de 0.34 (1.00 – 0.66). La fréquence prédite des asques sans aucun enjambement (c'est-à-dire les asques PD et NPD) serait la suivante: Puisque des gènes non liés subissent un assortiment indépendant de leurs allèles, la moitié des asques générés en l’absence d'un enjambement correspondrait à PD, et l'autre moitié à NPD. Par conséquent : Fréquence prédite des asques PD = fréquence prédite des asques NPD = 0.16/2 = 0.08. Un seul enjambement entre le gène et son centromère ou un enjambement unique simultané entre les deux gènes et leurs centromères produirait tous des asques T. Par conséquent, la fréquence prédite des asques T serait la somme des produits des probabilités indépendantes de ces trois événements : Reportez-vous aux résultats combinés de votre section pour tester le modèle génétique ci-dessus en effectuant le test du khi carré et en supposant que les gènes des couleurs beige et gris sont non liés. Effectuez un test du khi carré pour comparer les nombres observés des asques PD, NPD et T avec les nombres prédits à partir des distances génétiques publiées. Les résultats expérimentaux obtenus par les étudiants de votre section sont-ils cohérents avec les données précédemment publiées? Type d’asques Ditype parental (PD) Ditype nonparental (NPD) Tétratype (T) Valeur observée Valeur prédite (O-E)2/E Montrez vos calculs pour une des valeurs prédites. Expliquez et justifiez votre raisonnement. Réalisez un diagramme illustrant la carte génétique des loci des couleurs grise et beige des ascospores chez S. fimicola. Votre diagramme doit résumer l’ensemble des résultats obtenus lors du laboratoire 4. Insérez votre carte génétique et vos conclusions (maximum 5-10 lignes).