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Descripción General del Análisis de Plantas Transgénicas

• Se usan varias líneas de evidencia para evaluar si las plantas son transgénicas y si el transgén de interés se expresa exitosamente.
• Plantas originales de un experimento de transformación se llaman generación T0.
• Las plantas T0 se cruzan o auto polinizan, produciendo progenie T1, y así sucesivamente.
• Es fundamental comprender la composición genética, las características bioquímicas y fenotípicas de las nuevas plantas.

Análisis de Plantas Transgénicas

• Se debe confirmar que los transgenes están completamente integrados en el genoma y cuántas copias están presentes.
• Se usan diferentes técnicas de análisis de DNA, como PCR, qPCR, análisis de transferencia Southern y secuenciación de DNA.
• Se espera que el DNA transgénico se herede en la progenie.
• Es crucial caracterizar la expresión genética que a menudo se estima mediante RT-PCR, qRT-PCR y análisis de transferencia Northern.
• Se busca saber cómo se traduce el recombinante intacto a proteínas, medible cuantitativamente con ELISA, o semicualitativamente con análisis de transferencia Western.

PCR para la Corroboración de Plantas Transgénicas

• Si las plantas sobreviven a la selección de antibióticos y expresan un gen informador, se podría realizar una PCR en eventos T0 e ir directamente al análisis de la expresión génica y ensayos posteriores.
• La técnica PCR regular se realiza para amplificar el gen marcador o el gen de interés para evaluar si está presente en la muestra.
• La ventaja de la PCR es que no necesita mucha muestra y es fácil obtener ADN de diferentes plantas para la PCR.

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

• Es un ensayo bioquímico que utiliza anticuerpos y cambios de color mediados por enzimas para detectar la presencia de antígenos (proteínas, péptidos, hormonas) o anticuerpos en una muestra.
• La técnica ELISA tiene alta sensibilidad y especificidad
• Utiliza reacciones entre anticuerpos y antígenos altamente específicos.

Análisis de datos ELISA

• El proceso de análisis de datos de ELISA es un proceso de dos pasos:
  • Preparación y análisis de un conjunto de datos / estándar de muestras conocidas. Esta serie de datos de absorbancia conocidos, que representan las concentraciones, se utilizan para crear una curva estándar.
  • Preparación de los datos de las muestras "desconocidas". Para cada medición obtenida, la curva estándar se utiliza para encontrar la concentración de sustancia correspondiente.
• El análisis de datos se realiza usando una herramienta bioinformática como Labware LIMS.
• Se calcula una relación molar de analito en muestras y controles, no solo se mira la curva para decir sí o no.
• Se realiza la validación de datos para asegurar la integridad de los resultados.

Tipos de ELISA

• ELISA directo: El anticuerpo está conjugado con la enzima. Se usa solo un anticuerpo. Se usa para detectar el antígeno.
• ELISA indirecto: El anticuerpo se une a la enzima, no al antígeno. El anticuerpo se une al antígeno y luego se utiliza un anticuerpo marcado con enzimas para detectar el anticuerpo, seguido de la adición de un sustrato para permitir la formación de color. Se usa para detectar la presencia de anticuerpos en una muestra.
• ELISA sándwich: El anticuerpo se une al antígeno y luego se utiliza un anticuerpo marcado con enzimas para detectar el antígeno. El anticuerpo se une al antígeno y luego se utiliza un anticuerpo marcado con enzimas para detectar el anticuerpo, seguido de la adición de un sustrato para permitir la formación de color. Se usa para detectar la presencia de antígenos en una muestra.

Tecnología de Silenciamiento Genético

• El silenciamiento genético a menudo se considera similar a los "knockdown" de genes.
• Cuando los genes se silencian, su expresión se reduce. Cuando los genes son eliminados (knockdown), se borran del genoma del organismo y no tienen expresión.
• Se considera un mecanismo de eliminación de genes, ya que los métodos para silenciar genes, como RNAi, CRISPR/Cas9, o siRNA, reducen la expresión de un gen en al menos un 70%, pero no lo eliminan por completo.

Tecnología de Silenciamiento Genético

• Los métodos que usan el silenciamiento génico se consideran mejores que los genes inactivados porque permiten estudiar genes esenciales que son necesarios para que los modelos animales sobrevivan la alteración genética.
• Proporcionan una visión más completa sobre el desarrollo de enfermedades, ya que las enfermedades se asocian con genes que tienen una expresión reducida que ocurre en el curso de la vida de un organismo.

Técnicas de Silenciamiento Genético

• Transcripcional
  • Silenciamiento de transposones
  • Metilación de DNA dirigida por RNA
  • Impronta genómica
• Post-transcripcional
  • Interferencia de RNA (RNAi)
  • Silenciamiento de RNA
  • Terminación "Nonsense"
• Meiótico
  • Transfección
  • Silenciamiento meiótico de DNA no apareado

Silenciamiento de Transposones

• Es un producto de modificaciones de histonas que impiden la transcripción de un área particular de DNA.
• El silenciamiento transcripcional de los transposones es crucial para el mantenimiento de un genoma.
• El salto de los transposones genera inestabilidad genómica.

Metilación de DNA Dirigida por RNA

• Los elementos transposables constituyen una proporción sustancial de la mayoría de los genomas de plantas.
• Debido a que son potencialmente mutagénicos, los transposones están controlados por mecanismos que los reconocen y silencian epigenéticamente.
• Los RNA desencadenantes pueden inducir la metilación del DNA a través de siRNA producidos mediante el procesamiento de estas transcripciones.
• Una vez activada, la histona H3K9 y la metilación del DNA tienen la función de promover la producción de RNA aberrante, tal vez por la RNA polimerasa IVa (PolIVa).
• La transcripción aberrante se transporta a un centro de procesamiento en el cuerpo de Cajal dentro del nucleolo, donde se hace de doble hebra por RNA Polimerasa dependiente de RNA 2 (RDR2).
• El dsRNA es procesado por DICER-LIKE 3 (DCL3) en pequeños RNA de interferencia (siRNA), que se incorporan a un complejo silenciador inducido por RNA (RISC) en asociación con Argonauta 4 (AGO4).
• Este complejo se dirige nuevamente al DNA en asociación con PolIVb, donde promueve modificaciones tanto en la histona como en el DNA. Estas modificaciones a su vez promueven la producción de RNA aberrante.

Impronta Genómica (Genomic Imprinting)

• La impronta genómica es un fenómeno epigenético que hace que los genes se expresen de una manera específica del padre de origen.

Descubrimiento de la Interferencia de RNA

• Se descubrió que dsRNA inyectado en C. elegans puede activar un mecanismo de silenciamiento de genes.
• La interferencia de RNA (RNAi) afecta la expresión génica a través del proceso post-transcripcional.
• El RNAi es un mecanismo de defensa contra los virus y puede controlar la transcripción de genes.

Publicaciones Utilizando RNAi

• Se han realizado miles de estudios para comprobar el potencial de RNAi para investigación biológica y médica.
• RNAi se utiliza para identificar la función de genes.
• RNAi se utiliza para estudiar la patogénesis de enfermedades.

Mecanismo de Acción de los RNAi

• Los RNAi se inducen por RNA de doble hebra (dsRNA).
• El dsRNA se corta en pequeños RNA de interferencia (siRNA) por la enzima Dicer.
• Los siRNA se unen a un complejo proteico llamado complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC).
• El RISC utiliza siRNA como una guía para identificar y unirse a RNA mensajero (mRNA) complementario.
• El RISC escinde el mRNA complementario, evitando la traducción del mRNA en proteínas.

Mecanismo de Acción de los RNAi

• La introducción de dsRNA da como resultado la reducción de la expresión del gen diana mediante la degradación del mRNA.
• Se pueden utilizar moléculas de RNAi para silenciar genes específicos o secuencias de DNA.
• El RNAi se ha utilizado para crear modelos de animales y plantas con genes silenciados.
• RNAi se ha utilizado para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento de enfermedades.
• El uso de RNAi en el tratamiento de enfermedades se llama terapia de oligonucleótidos.

Silenciamiento de Genes

• El silenciamiento de un gen endógeno debido a la presencia de un transgen o virus homólogo.
• La co-supresión puede ocurrir a nivel transcripcional o postranscripcional.

Efectos de la expresión de ARN sentido y antisentido de CHS en la pigmentación de flores en Petunia hybrida

• Plantas de petunia (Petunia hybrida) diseñadas para albergar copias transgénicas adicionales del gen de pigmentación floral, chalcone sintasa (CHS), proporcionaron información sobre los mecanismos de silenciamiento génico dependientes de la homología en las plantas.
• Estas plantas fueron modificadas para sobreexpresar CHS con el objetivo de intensificar la coloración púrpura de las flores.
• Sin embargo, las flores de estas plantas modificadas expresaron una gama dramática de pigmentación, que incluye púrpura intenso, patrones de púrpura y blanco, y flores que eran completamente blancas.

Sistema CRISPR-Cas9

• Las secuencias CRISPR se observaron por primera vez en bacterias y luego en Arqueas.
• Los investigadores descubrieron que el sistema CRISPR-Cas9 sirve como una defensa inmune adaptativa contra virus invasores.
• Muchas bacterias y la mayoría de las arqueas capturan pequeñas secuencias del DNA viral para crear una biblioteca de segmentos de DNA del vírusa, o matrices CRISPR.
• Cuando los procariotas se exponen al mismo virus, se utilizan matrices CRISPR para transcribir pequeños segmentos de RNA que ayudan a reconocer los invasores virales y, posteriormente, destruir el DNA viral con Cas9 o una endonucleasa similar.

Sistema CRISPR-Cas9

• CRISPR-Cas9 se usa comúnmente en el laboratorio para eliminar el DNA e insertar una nueva secuencia de DNA en su lugar.
• Para lograr esto, los investigadores primero deben crear un pequeño fragmento de RNA llamado RNA guía, con una secuencia corta llamada secuencia guía, que se une a una secuencia objetivo específica en el DNA genómico.
• La guía de RNA también puede asociarse con Cas9.
• El RNA guía y la proteína Cas9 se administran a una célula de interés donde el RNA guía identifica la secuencia de DNA objetivo y Cas9 la divide.

3 Tipos de Nucleasas Cas9

• Cas9 de tipo salvaje (WT Cas9): puede romper un sitio específico del dsDNA, lo que resulta en ruptura de doble cadena (DSB) y activación de la maquinaria de reparación. Se puede emplear para:
  • inserciones y/o eliminaciones.
  • mutaciones de reemplazo precisas.
• Cas9D10A: Corta solo una hebra de DNA. Solo presenta actividad de nickasa. Especificidad objetivo cuando los loci son objetivo de emparejado complejo. Cas9 diseñado para generar mellas (nicks) de DNA adyacente.
• dCas9 (Deficient Cas9): Nucleasa deficiente Cas9. Inactiva la actividad de escisión, pero no evita la unión del DNA. Herramienta de silenciamiento o activación genética.