Validação de Metodologia PDF

BIOQUÍMICA ANALÍTICA I 1 2 3 4 6 7 VALIDAÇÃO ANALÍTICA dos constituintes de uma determinada amostra Demonstrar que a metodologia em causa dá resultados adequados e reprodutíveis, ainda qu...

BIOQUÍMICA ANALÍTICA I 1 2 3 4 6 7 VALIDAÇÃO ANALÍTICA dos constituintes de uma determinada amostra Demonstrar que a metodologia em causa dá resultados adequados e reprodutíveis, ainda que realizada por pessoas, em equipamentos e condições diferentes 8 VALIDAÇÃO ANALÍTICA 9 PARÂMETROS DA VALIDAÇÃO ANALÍTICA FIGURAS DE MÉRITO DO MÉTODO São avaliadas para confirmar ou não a adequabilidade 10 de todo o método desenhado. VALIDAÇÃO ANALÍTICA 11 VALIDAÇÃO ANALÍTICA objetivo objetivo Por exemplo: pH da fase móvel, diâmetro interno da coluna, Mudança da composição da FM 12 VALIDAÇÃO ANALÍTICA 13 VALIDAÇÃO ANALÍTICA Classificação dos métodos de acordo com a sua finalidade Ensaios necessários para a validação do método 14 15 Curva analítica: calibração com padrão externo 16 Curva analítica: calibração com padrão externo 17 Método baseado na curva analítica 18 19  Resposta do equipamento Concentração  Resposta do equipamento com o solvente puro 21 Concentração 23 24 25 26 27 28 29 30  Valor médio O valor real ou exato da maioria das grandezas físicas nem sempre é conhecido! Em uma série de medidas de uma grandeza, utilizando um mesmo instrumento: - ocorrem erros experimentais inerentes a qualquer processo de medida - A teoria demonstra que o valor que mais se aproxima do valor real da grandeza é a média aritmética dos valores ( Xm ), denominado valor médio. Se X1, X2, X3........XN forem valores encontrados para uma série finita de N medidas de uma mesma grandeza, temos: N é o número de N - é o número total medidas para o de medidas para a conjunto da amostra população ❖ Quando N for pequeno, Xm difere de  porque um pequeno número de dados pode não representar exatamente sua população 31 ❖ A diferença provável entre X e  decresce rapidamente à medida que o número de medidas que perfazem a amostra aumenta  n Ln (cm) DLn = (Ln - X) (cm) 1 5,7 0,0 2 5,8 + 0,1 3 5,5 - 0,2 4 5,6 - 0,1 5 5,5 - 0,2 6 5,7 0,0 Calculando-se a média aritmética 7 5,8 + 0,1 das medidas efetuadas tem-se 8 5,7 0,0 9 5,9 + 0,2 10 5,8 + 0,1 5,7 cm = valor mais provável N = 10 SLn = 57 cm Sn çDLnç = 1,0 cm para o comprimento da barra. XLn= 5,7 cm Esse desvio significa que o erro que se comete ao adotar o valor médio (= 5,7 cm) é de 0,1 cm. O valor real deve estar entre 5,6 e 5,8 cm. Dessa maneira, o comprimento da barra pode ser expresso como: L =( LL)o us ej aL= (5 , 70 , 1)c m 32 ANÁLISE ESTATÍSTICA Mesmo na ausência de erros determinados, se um analista faz uma mesma análise, haverá pequenas variações nos resultados. Isto é consequência dos chamados erros indeterminados. Ao submetermos estes erros a um tratamento estatístico podemos obter o valor mais provável e também a precisão de uma série de medidas. Admite-se que os erros indeterminados seguem a Lei da Distribuição Normal (Distribuição de Gauss) 33  (  A equação de uma curva gaussiana tem a forma: 1  1X− i  2  ) equação que contém apenas dois  Y= − exp 2 2  2  parâmetros, a média da população  e o desvio padrão da população, . onde Y = probabilidade de ocorrência de um dado valor Xi da variável X  = média da população e  = desvio padrão (Xi – ) é o desvio de Xi em relação a média Probabilidade de ocorrência de um dado resultado é igual à relação entre o número de casos em que o resultado ocorre e o número total de resultados observados. Ex. se em 20 determinações um dado resultado Xi ocorre 4 vezes então a probabilidade de ocorrência é: 4/20 = 0,20 = 20% 34  Os erros aleatórios contidos em resultados analíticos seguem uma distribuição gaussiana ou normal. 1 – a média da população  divide a curva de Curva normal padrão Gauss em duas metades simétricas 2 – O valor mais provável é a média aritmética de todos os valores 3 – Desvio positivos e negativos são igualmente prováveis 4 – Desvios pequenos são mais prováveis que desvios grandes 5 – Na ausência de erros determinados e para um número infinito de medidas a média da população m coincide com o valor verdadeiro Frequência relativa y de vários desvios da média versus Xv. o desvio em relação à média. 6 – Na presença de um erro determinado a forma da curva normal é a mesma, mas Apresenta uma distribuição simétrica dos dados em apresenta-se deslocada, de modo que a média torno da média de um conjunto infinito de dados. da população não coincide com o valor verdadeiro Esse espalhamento dos dados em uma faixa resulta diretamente da acumulação de todas as incertezas aleatórias envolvidas nos ensaios. 35  Intervalo de confiança Intervalo de confiança: Intervalo ao redor da média determinada experimentalmente, no qual se espera que a média da população µ esteja contida com um certo grau de probabilidade; desde que haja uma boa estimativa de “  ”. Para a média de N medidas: t de Student  Ferramenta estatística usada para representar IC e para Teste comparação de resultados Teste “t” de Student  Desenvolvido por W. S. Gosset (Student) em 1908 para compensar as diferenças existentes entre “” e “x” , além de levar em conta que “s” é simplesmente uma aproximação de . Intervalo de confiança da média (IC)  para N réplicas  Intervalo de confiança Na maioria das situações encontradas em análises químicas, o valor verdadeiro da média  não pode ser determinado, porque um número imenso de medidas (aproximadamente infinito) seria necessário. Com a estatística, entretanto, podemos estabelecer um INTERVALO ao redor da média determinada experimentalmente, no qual se espera que a média da população m esteja contida com um certo grau de probabilidade. Intervalo de confiança: Intervalo ao redor da média determinada experimentalmente, no qual se espera que a média da população µ esteja contida com um certo grau de probabilidade; desde que haja uma boa estimativa de “  ”. Para a média de N medidas: Teste t de Student  Ferramenta estatística usada para representar IC e para comparação de resultados Teste “t” de Student  Desenvolvido por W. S. Gosset (Student) em 1908 para compensar as diferenças existentes entre “” e “x” , além de levar em conta que “s” é simplesmente uma aproximação de .  Intervalo de confiança e Limite de confiança Intervalo de confiança da média (IC)  para N réplicas Uma série de CURVAS NORMAIS DE ERRO. Em cada uma delas, a frequência relativa está representada em forma de gráfico em função da quantidade Z que é o desvio da média dividido pelo desvio padrão da população. Áreas sob uma curva gaussiana para vários valores As áreas sombreadas mostradas em cada gráfico estão Os números contidos nas áreas sombreadas representam o contidas entre os valores de -z e +z, que são indicados à percentual da área total sob a curva, que está incluída entre esquerda e à direita das curvas os valores de z. Z=± 0,67 Z=± 1,28 Z=± 1,64 Como mostrado na curva (a), 50% da área Para as curvas (b) e (c), vemos que 80% da área total estão contidos entre - da curva gaussiana estão localizados entre 1,28 e +1,28 e 90% estão localizados entre -1,64 e +1,64 - 0,67 e + 0,67 Relações como estas permitem-nos definir uma faixa de valores ao redor de um resultado medido entre os quais é provável que o valor verdadeiro esteja inserido com um certo grau de probabilidade, desde que tenhamos uma estimativa razoável de  38  Se temos um resultado x a partir de um conjunto de dados, com um desvio padrão de , podemos considerar que, em 90 de 100 vezes, a média verdadeira  estará contida no intervalo x ±1,64 O nível de confiança é de 90% e o intervalo de confiança varia de -1,64 a +1,64. z=± 2,58 z=± 1,96 Se fizermos uma única medida x a partir de uma distribuição  conhecida, podemos dizer que a média verdadeira deve estar inserida no intervalo x ± z, com uma probabilidade dependente de z. Essa probabilidade é de: 90% para z=1,64; Encontramos uma expressão geral para o intervalo de confiança 95% para z=1,96 e para a média verdadeira que está baseada na medida de um valor 99% para z=2,58 único de x Raramente estimamos a média verdadeira a partir de uma única medida. Em vez disso, usamos a média experimental de N medidas como uma estimativa melhor de . 39 Intervalo ao redor da média determinada experimentalmente, no qual se espera que a média da população µ esteja contida com um certo grau de probabilidade; desde que haja uma boa estimativa de “  ”. Usa-se o teste t de Student como ferramenta estatística Para a média de N medidas: para representar IC e para comparação de resultados t depende : do nível de confiança desejado. do número de graus de liberdade presente no cálculo de . 40 Grau de liberdade é, em estatística, o número de determinações independentes (dimensão da amostra) menos o número de parâmetros estatísticos a serem avaliados na população. 41 42  Comparação COMPARAÇÃOdeDEresultados RESULTADOS A comparação dos valores de um conjunto de resultados “com o valor verdadeiro” ou “com os valores de outros conjuntos de resultados” permite verificar a exatidão e precisão do método analítico, ou definir qual dos 2 métodos é o mais adequado (melhor) para o ensaio em questão. Existem 2 métodos muito usados para comparar resultados: ❖ teste t de Student ❖ teste da razão de variâncias (teste F)  Teste tTeste de Student t de Student Uma ferramenta estatística utilizada com muita frequência para expressar intervalos de confiança e para a comparação de resultados de “experiências” diferentes. Usado para amostras pequenas. Comparar a média de uma série de resultados com um valor de referência e exprimir o nível de confiança associado ao significado de comparação. Também usado para testar a diferença entre as médias de dois conjuntos de resultados.  Teste t de Student (x − ) n t= s  = valor verdadeiro  Caso – Comparando um resultado medido com um valor conhecido Exemplo: Uma amostra de carvão foi adquirida como sendo um Material Padrão de Referência certificado pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) dos Estados Unidos, contendo 3,19%pp de enxofre. Está a ser testado um novo método analítico para verificar se o valor conhecido pode ser reproduzido ou não. Os valores medidos são 3,29; 3,22; 3,30 e 3,23%pp de enxofre, dando uma média de 3,26 e um desvio-padrão de 0,04. Esta resposta concorda com o valor fornecido pelo NIST? Calcule o valor de “t” e compare com o valor de “t tabelado”. (x − ) n t= s Se o valor calculado de “t” é maior que o valor de “t tabelado” no nível de confiança de 95%, os dois resultados são considerados diferentes.  Caso 2 - Comparação entre as médias de duas amostragens Quando um novo método analítico está a ser desenvolvido é comum comparar-se a média e precisão do novo método com as do método de referência. x1 − x 2 n1n2 x1 = média1 t= sP = desvio padrão agrupado sp n1 + n2 x 2 = média 2 t calculado > t tabelado (95%) → diferença (n − 1) s + (n − 1) s 2 2 s = 1 1 2 2 significativa → resultados são p n +n −2 considerados diferentes 1 2 É necessário que não haja uma diferença significativa entre as precisões dos métodos  aplica o teste F antes de usar o teste t.  Teste F Teste F Usado para comparar as precisões de dois grupos de dados, como, por exemplo, os resultados de dois métodos de análise diferentes ou resultados de dois laboratórios diferentes. 2 s F= A 2 s B O maior valor de s é sempre colocado no numerador, o que faz com que o valor de F seja sempre maior do que a unidade. F calculado > F tabelado → a diferença é significativa  Comparação da Precisão Teste F Caso 3 - Comparação diferenças individuais Usamos dois métodos diferentes para fazer medidas simples em várias amostras diferentes. Os dois métodos fornecem a mesma resposta “dentro do erro experimental”? Para cada amostra, ambos os resultados são similares, porém não são idênticos. Para verificar se existe uma diferença significativa entre os dois métodos realizaremos o teste t.  Caso 3 - Comparação diferenças individuais Desvios da medida (d) di = Xi – X ( d i − d ) 2 sd = n −1 d tcalculado = n sd t calculado > t tabelado (95%) → diferença tabelado = 2,228 → há menos do que 95% de significativa → resultados são chance de que os dois resultados sejam considerados diferentes diferentes 52 53 Exemplo: A análise de uma amostra de calcita gerou percentagens de CaO de 55,95; 56,00; 56,04; 56,08 e 56,23. O último valor parece anómalo; deve ser mantido ou rejeitado considerando um nível de confiança de 95%? 54