Bioquímica Analítica - Amostagem e Amostra, erros - PDF

BIOQUÍMICA ANALÍTICA 1  BIOQUÍMICA ANALÍTICA CONCEITOS E DEFINIÇÕES Bioquímica de amostras biológicas bioquímicos...

BIOQUÍMICA ANALÍTICA 1  BIOQUÍMICA ANALÍTICA CONCEITOS E DEFINIÇÕES Bioquímica de amostras biológicas bioquímicos 2  BIOQUÍMICA ANALÍTICA A MATERIA VIVA formada por BIOELEMENTOS Se a sua proporção é muito pequena são PRIMARIOS Pela sua abundancia são SECUNDARIOS OLIGOELEMENTOS Estabelecem LIGAÇÕES QUÍMICAS BIOMOLÉCULAS Formando de tipo de função AGUA são INORGÂNICO ESTRUTURAL SALES MINERALES ENERGÉTICA GLÚCIDOS LÍPIDOS são DINÂMICA ORGÂNICO PROTEÍNAS ACID.NUCLEICOS 3  BIOQUÍMICA ANALÍTICA ELEMENTOS QUÍMICOS 4  BIOELEMENTOS E BIOMOLÉCULAS Primarios Oligoelementos (C, H, O, N, P, S) (Ca, Na, K, I, Fe, etc) forman Biomoléculas podem ser Inorganicas Organicas como como Agua Simples S.minerais Glúcidos Lípidos Proteínas A. Nucleicos apresenta encontram-se como Propiedades Funções N2, O2 Precipitadas Dissolvidos físico- químicas biológicas (CaCO3) (Na+, Cl-) como como Elevada força de coesão Alto calor específico Disolvente Alto calor de vaporização Bioquímica Alta constante eléctrica Transporte Maior densidade no estado líquido 5  OS GLÚCIDOS ou HIDRATOS DE CARBONO GLÚCIDOS classificam-se Monossacáridos Oligosassacáridos Polissacáridos Glucoconjugados ligam-se por formando Ligações O-glucosídico son se clasifican Aldoses Cetoses Dissacáridos Homopolissacáridos Heteropolissacáridos Peptidoglucanos Glucoproteínas Glucolípidos exemplos exemplos exemplos exemplos GALACTOSE RIBULOSE Lactose Pectina GLUCOSE FRUCTOSE Sacarose Agar Agar RIBOSE Maltose Goma arábica DESOXIRRIBOSE Celobiose Vegetais Animais Reserva Amido Celulose Quitina Glucógeno Estructural 6  OS LÍPIDOS LÍPIDOS Classificam-se formados por Saturados Saponificáveis Ácidos gordos Insaponificaveis Insaturados Lípidos simples Lípidos complexos Acilglcéridos Ceras Fosfolípidos Glucolípidos Terpenos Esteroides Prostaglandinas Azeites Sebos Fosfoglicéridos Fosfoesfingolípidos Gangliósidos Cerebrósidos Esterois Hormonas esteroideas Hormonas Hormonas Suprarrenais Sexuais Carotenoides Colesterol Aldosterona Progesterona Vitamina A,E,K Cortisona Testosterona Reserva Estructural Membranas celulares Relação celular Vitamínica Estructural Regulação 7  PROTEÍNAS PROTEÍNAS ESTRUTURA FUNÇÕES CLASIFICAÇÃO distinguem-se 20 Aminoácidos Colageneo (segundo R) Contráctil Estructural Exp. unidos por Fibrosas Actina/Miosina ligação Enzimática Reserva Holoproteínas peptídica Albuminas Exp.. formando Defesa Transporte Globulares Péptidos ou Globulinas proteínas Hormonal Exp. Têm Nucleoproteínas Cromatina Organização Exp. estrutural Fosfoproteínas Caseína Éa Exp. Sequencia de Cromoproteínas Hemoglobina aminoácidos E. primaria Heteroproteínas Exp. Proteoglucanos -hélice definida por E. secundaria Glucoproteínas Conformação  FSH, TSH... Pragueamento Exp. E. terciaria Lipoproteínas HDL, LDL espacial Apenas em Proteínas E. quaternaria oligoméricas 8  ENZIMAS ENZIMAS ESTRUTURA FUNÇÃO CLASIFICAÇÃO pode ser Holoenzima Estrictamente Biocatalizadores Ligases Liases Transferasas formada proteica actuam Isomerases Hidrolases Oxidorreductases natureza Cofactor Apoenzima  Energía  velocidade de natureza activação reação Inorganica Organica chamados actuam como Coenzimas Cinética Temperatura Inibidores enzimática tipos por exemplo pH Concent. substrato Vitaminas Classificam-se em Reversiveis Irreversiveis Hidrossoluveis Lipossoluveis tipos (B, C) (A, D, E, K) Não competitivos Competitivos 9  OS ÁCIDOS NUCLEICOS Ac. fosfórico + Nucleósido (Açúcar pentose + Base nitrogenada) NUCLEÓTIDOS polimeros de A, G, C, T polimeros de A, G, C, U DNA ATP, cAMP, GTP,... RNA Funções varias (segundos mensageiros, energética,...) Níveis de empacotamento ARNm Ribozimas crescentes Conformação ARNr moléculas de RNA que em hélice A, B ou Z ARNt possuem a capacidade de atuar como catalisadores Em procariotas Em eucariotas Enrolamento Nucleosoma Função catalítica em superhélice Colar de Perolas Síntese de proteínas Fibra de cromatina Cromosoma ARNm leva a informação de como tem que ser a sequência da proteína bacteriano Laços radiais ARNt leva os aminoácidos necessários, ARNr é parte constituinte do organelo responsável pela leitura da sequência do mRNA para realizar o processo de tradução e síntese proteica. 10 Cromosoma linear  IMPORTÃNCIA E ÂMBITO DE APLICAÇÕES  Cobre a maior parte de todas as áreas da atividade humana Determinação de produtos nocivos Agrotóxicos PAHs Controlo de Diagnóstico Dioxinas Qualidade …. Clínico Oncologia Alimentar Cardiologia Ambiental Neurodegenerativas Medicamentos …. …. BIOQUÍMICA ANALÍTICA Investigação Indústria Alimentar Saúde Cosmética Ambiente Farmacêutica Materiais Petrolífera Economia …. circular Valorização de sub-produtos Biomassa …. 11 O PAPEL DA BIOQUÍMICA ANALÍTICA Interdisciplinaridade BIOQUÍMICA ANALÍTICA A localização central da Bioquímica Analítica no diagrama representa sua importância e a abrangência de sua interação com muitas outras disciplinas Relações entre a Bioquímica Analítica, outras áreas da Química e outras ciências 12 13  BIOQUÍMICA ANALITICA Qualitativa Quantitativa 14 CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS ANALÍTICOS Análise Análise Qualitativa Quantitativa Reações de: Métodos Métodos Neutralização Clássicos Instrumen- Precipitação (químicos) tais Complexação Redox Cromato- gráficos Via húmida Espectrofoto- Eletro- Termo- métricos analíticos analíticos Gravimetria Volumetria 15 Métodos de análise quantitativa ANÁLISE QUÍMICA/BIOQUÍMICA MÉTODOS CLÁSSICOS (wet chemistry) @identificações em geral / presença de impurezas Envolve reacções químicas, dissolução, extracção e estequiometria; Pode apresentar elevada exactidão, se correctamente realizada Usual em pequenos laboratórios Podem ser muito elaboradas e demoradas Equipamentos usados: aparelho de pH, balança analítica … 16 17 18 MÉTODOS INSTRUMENTAIS elevada precisão e exactidão nos resultados / sensibilidade aos avanços da electrónica e informática Usa essencialmente equipamento sofisticado, podendo envolver reacções químicas É geralmente mais rápida Mas pode não ser mais sensível nem mais precisa Muito usada na identificação e quantificação de traços 19 CLASSIFICAÇÃO 20 Lipids on MARS?! 21 O que faria para saber a causa? FLUXOGRAMA DO PROCESSO ANALÍTICO Uma análise quantitativa típica envolve uma sequência de etapas, mostrada no fluxograma Fluxograma mostrando as etapas envolvidas numa análise quantitativa 23  Procedimento Analítico da Análise Bioquímica ETAPAS DO PROCESSO ANALÍTICO Definição do Repensar Problema Otimização do Método Seleção do Método Amostra- Transformação gem Amostra Aquisição de Tratamento de Dados Dados Operações prévias Método Analítico Avaliação dos Resultados RESULTADOS 24 ETAPAS DA ANÁLISE BIOQUÍMICA 25 ETAPAS DO PROCESSO ANALÍTICO 26  ETAPAS DO PROCESSO ANALÍTICO  Obter amostra representativa A amostragem envolve a obtenção de uma pequena quantidade de amostra “representativa” Os planos de amostragem fazem parte integrante do controlo de qualidade 27  ETAPAS DO PROCESSO ANALÍTICO Multiplicidade da amostra ❑ Amostras simples ❑ Amostras duplicadas ❑ Amostras triplicadas 28  ETAPAS DO PROCESSO ANALÍTICO  Definir réplicas  Número de repetições (processo de extracção e análise)  As réplicas aumentam a qualidade dos resultados - aumentam o grau de confiança A validação pode diminuir o número de ensaios a realizar 29 ETAPAS DO PROCESSO ANALÍTICO 30 31 32 33  FILTRAÇÃO CENTRIFUGAÇÃO AJUSTE pH  Preparar a amostra A amostra deve ser uniforme ▪ moagem / homogeneização podem ser necessárias ▪ armazenagem / higroscopicidade – podem implicar a determinação após secagem 34  Dissolver as amostras Maioria das análise é feita na fase líquida Mas nem todos os analitos apresentam solubilidades semelhantes Problemas de discriminação (solubilidade) e insolubilidade Pode exigir novos passos no processo analítico – ignição / decomposição / fusão / oxidação / redução / derivatização 35 DISSOLUÇÃO DAS AMOSTRAS 36 Preparação da Amostra Redução do tamanho Mistura para homogeneização Secagem das partículas Dissolução da Amostra 37 38 Remoção de interferentes A falta de seletividade pode exigir o uso de sofisticadas técnicas de separação (cromatografia / extração em fase sólida / SPME) 39  Medidas e controlo de fatores instrumentais Calculo dos resultados analíticos e avaliação RESULTADOS Resultados estatística dos resultados  Calcular os resultados Raramente a análise dá uma resposta direta / pode exigir reta de calibração ou análise de dados (estatística avançada) A maioria dos programas de aquisição inclui tratamento de dados 40  Estimar a confiança no resultado ❑ um resultado analítico sem estimativa do nível de confiança tem um valor reduzido os erros podem ser determinados / estimados através da realização de réplicas A validação do método permite determinar as suas limitações e condições de aplicação 41 exatidão 42  ETAPAS DO PROCESSO ANALÍTICO SELEÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO Quantidade de amostra disponível Quantidade relativa do analito Quantidade de amostra 43 44 Geralmente esta segunda medida completa a análise, e classificamos os métodos analíticos de acordo com a natureza dessa medida final 45 46 47  CONCEITOS ESPECÍFICOS E IMPORTANTES DA BIOQUÍMICA ANALÍTICA ANÁLISE ANALITO AMOSTRA Mecanismo pelo qual são São os constituintes de Porção representativa da obtidas informações químicas interesse da amostra que serão matéria que se pretende ou físicas a respeito dos determinados. analisar constituintes de uma amostra ou da própria amostra. AMOSTRAGEM MATRIX MEDIDA Processo de coletar uma São todos os outros Determinação experimental de pequena massa de um material componentes da amostra na uma propriedade química ou cuja composição represente qual o analito está contido, física do ANALITO a ser exatamente o todo do material excluindo os componentes a determinado. que está sendo amostrado. serem determinados. PROCEDIMENT TÉCNICA MÉTODO O Princípio químico ou físico que Aplicação de uma técnica para Conjunto de proposições que pode ser usado para analisar a determinação de um analito detalham a maneira correta de uma amostra. específico em uma matriz como aplicar determinado específica método. 48  PROTOCOLO INTERFERÊNCIA VALIDAÇÃO Conjunto de orientações que Espécie que causa um erro na Representa a comprovação de detalham determinado análise pelo aumento ou que os métodos estão procedimento que deve ser diminuição da quantidade que apropriados para os seus seguido para a aceitação da está sendo medida. devidos usos análise. ESPECIFICIDADE LINEARIDADE GAMA DE TRABALHO /SELECTIVIDAD Capacidade do método em Corresponde à faixa do maior Capacidade do método de detectar o analito de interesse ao menor nível que possa ser gerar resultados linearmente na presença de outros determinado com precisão e proporcionais à concentração componentes da matriz exatidão do analito, enquadrados em faixa analítica especificada RÉPLICAS São as porções de um material, que possuem o mesmo tamanho e que são tratadas por um procedimento analítico ao mesmo tempo e da mesma forma ANALISAM-SE AMOSTRAS E DETERMINAM-SE SUBSTÂNCIAS 49 50 TRATAMENTO DOS RESULTADOS ANALÍTICOS Exatidão e precisão 51 ALGARISMOS SIGNIGFICATIVOS 52 ALGARISMO ALGARISMOS SIGNIGFICATIVOS é 53 é 54  ALGARISMOS SIGNIGFICATIVOS do resultado de um CÁLCULO 55 56 57 Números conhecidos Quantidades determinadas pelo analista experimentalmente Número infinito de Possuem uma incerteza ALGARISMO algarismos significativos associada 58  ERROS NA ANÁLISE QUANTITATIVA NUNCA SÃO COMPLETAMENTE ELIMINADOS MAS SIM MINIMIZADOS. PARA PENSAR... Toda medida é influenciada por muitas incertezas, que se combinam para produzir uma dispersão dos resultados.  Uma vez que as incertezas nas medidas nunca podem ser completamente eliminadas, os dados de medidas podem nos fornecer apenas uma estimativa do valor “verdadeiro”. 59  Erro absoluto: E = xi − xverdadeiro x −x Erro relativo: E= i verdadeiro x100% x verdadeiro 60 ERROS DE UMA MEDIDA - EXEMPLOS 61 MÉDIA OU VALOR MÉDIO 62 DESVIO ou ERRO APARENTE EXATIDÃO E PRECISÃO 63 64 65 66 TIPOS DE ERROS NA ANÁLISE QUANTITATIVA 67 1. ERROS INSTRUMENTAIS CAUSAS: imperfeições nos instrumentos de medida, instabilidade rede elétrica,... 2. ERROS de MÉTODO CAUSAS: comportamento físico-químico não ideal dos sistemas Erros de método - deteção no design da experiência; FENOLFLATEÍNA 3. ERROS PESSOAIS CAUSAS: resultam das limitações pessoais / falta de experiência do analista 74