PDF Tema 1 Técnicas Instrumentales de Análisis

TEMA-1-TECNICAS.pdf sandra_bovi Técnicas Instrumentales de Análisis 2º Grado en Bioquímica y Biología Molecular Escuela Superior de Tecnología y Ciencias Experimentales Universidad Jaume I de Castellón Reservados todos lo...

TEMA-1-TECNICAS.pdf sandra_bovi Técnicas Instrumentales de Análisis 2º Grado en Bioquímica y Biología Molecular Escuela Superior de Tecnología y Ciencias Experimentales Universidad Jaume I de Castellón Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 TEMA 1: INTRODUCCIÓN. PROCESO ANLÍTICO 1. INTRODUCCIÓN AL ANÁLISIS INSTRUMENTAL EN BIOQUÍMICA → Composición: biomoléculas (agua, polisacáridos, aa, proteínas) y bioelementos (C, H, N, O, S, Fe, Ca…) → La relación que tienen esas composiciones: cromosomas (ác.nucleicos + proteínas) y lipoproteínas (lípidos + proteínas) → Transformaciones de las relaciones: aa → glucosa; glúcidos → ác.grasos → Regulación de esos procesos: velocidad de una transformación y activación/inhibición de rutas metabólicas - NECESITAMOS TÉCNICAS INSTRUMENTALES→ para cumplir con los objetivos → La instrumentación y las técnicas de laboratorio permiten estudiar, indirectamente, los procesos moleculares que tienen lugar en el interior de los seres vivos 2. PROCESO ANALÍTICO: manera de enfrentarse al problema - Todos los pasos tienen la misma importancia: 1) Existencia de un problema: pasar de algo general a algo más específico → Poner en relación distintas disciplinas a la vez → Te dicen algo general (alimentación) y de ahí lo específico (analizar plasma) 2) Definición de los objetivos analíticos: → Naturaleza del objeto: estudio in vivo o diseccionar, o vamos a tener el plasma o hay que hacerlo in vitro… → Cualitativa: presencia/ausencia→ aunque sea muy poco ya vas fuera → Cuantitativa: necesitas saber cuanto→ inicialmente x y ver si en el experimento de después hay más, menos o lo mismo/parecido → Disponibilidad de la muestra y orden de concentración: tenemos una gota o un tubo; en x unidad → Matriz: en agua, en plasma, orina, suero… Cómo de compensada está→ muestra super pura o hay que purificar… → Mono o multicomponente: analizar una, muchas… → Temporalidad → Nombre muestras: hay dos, tres… → Importa integridad: coger un poco de la muestra, para que quede un poco disponible por si el proceso no se puede revertir y tenemos que hacer más 3) Selección del procedimiento: elegir la técnica porque hay muchas→ elegir el procedimiento óptimo → Precisión: RSD (%) → Exactitud: error absoluto/relativo sistemático → Sensibilidad: sensibilidad de calibración o analítica → Límite de detección: mínima cantidad detectable (si está por debajo no puedes detectar) → Intervalo de concentración: rango de linealidad → Selectividad: coeficiente de selectividad, prueba de selectividad Técnica no selectiva: si tenemos una mezcla en la alícuota, todos responderían a la prueba y no obtendríamos resultado de algo específico → Cuesta del equipamiento (inversión), coste por muestra, tiempo de análisis relacionado con requisitos de personal y comodidad; aspectes de seguridad, necesidad de formación especial de los operadores; productividad 4) Muestreo: requiere pensar mucho y saber bien que queremos detectar. → Etapa crítica: Muestra mala ←→ Resultado malo ←→ Protocolos 1 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 Representatividad: al final el resultado de la muestra, si esta no es representativa, no dará respuesta inicial Evitar alteraciones en la muestra (analito-matriz) Integridad de la muestra durante el transporte y almacenamiento (evitar alteraciones para que sea una buena muestra) → Estado físico de la muestra: dificultad cuando son muestras sólidas Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. IMPORTANTE: protocolos para muestreo → Etiquetado: super importante para identificar bien la muestra → Ej: muestras de sangre: ya está todo monitorizado Punción venosa, arterial o cutánea: diferente composición Sangre total, plasma, suero (pone lo que tienes que mesurar): queremos solo el suero o solo el plasma… Adición de anticoagulantes: no coagula y disponemos de la sangre total Adición de conservantes → Ej. orina: evitar que se descompongan o se creen compuestos que no queremos Refrigeración/congelación Agentes antibacterianos/Agentes antimicóticos Reducen la descomposición química Solubilizan constituyentes urinarios que puedan precipitar Evitan oxidación de compuestos inestables 5) Preparación de la muestra: → Reducción de muestra laboratorio: de algo grande, reducir la muestra para utilizar en laboratorio → Estado físico: cuidado con la contaminación de la muestra líquida o sólida Interferencias: en algunos casos hay que eliminarlos dependiendo de la selectividad de nuestra herramienta de muestreo. Si hay algún reactivo que desenmascare la presencia de esa interferencia, haciendo que no moleste en la preparación, no hará falta eliminarlo → Pre-concentración: composición de la matriz puede anular completamente la muestra objetivo→ diluir para que no pase, conseguir concentración óptima 6) Mesura: → Técnica absoluta → Técnica comparativa: calibración Normalmente se utilizan estas técnicas→ se necesitan patrones de referencia que nos den una señal y con esto saber la concentración → S/N 7) Evaluación de los datos: cuando ya tenemos datos → Datos primarios: se ven como concentración → señal que nos da nuestro instrumento → Información estructural / Identificación (IR, MS): espectrofotometría de masas para ver la estructura, como es la muestra… → Cuenta con automatización: Validación software / método (ver en el software si se valida o no) 8) Conclusiones: solución problema 9) Informe: completo, claro, fiable (trazabilidad, exactitud) 2 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA - Subetapas = f(estado físico, matriz. analito, técnica) - Medida masa/volumen: muy importante el peso si queremos hacerlo de manera muy exacta (al final siempre vamos a hacer una determinación cuantitativa) - Disolución/disgregación muestras sólidas - Extracción Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. - Purificación - Reacciones químicas: para mejorar respuestas… - Ej. → Ratones sometidos a una dieta alta en grasa y fructosa, tambien añadiendo polifenoles para ver si esta dieta retrasaba el desarrollo de la enfermedad del hígado graso La extracción se guarda en un baño frio para mantener la temperatura baja y que no se nos escalfe y se mantenga la integridad de la muestra para obtener las reacciones que queremos - Objetivos de la preparación de la muestra: 1) Obtención de la muestra de laboratorio (reducción): reducir un tamaño d muestra muy grande para poder utilizarla en el laboratorio → Homogeneidad/medida: sólidos Trituración Homogeneización Reducción tamaño 2) Compatibilizar con técnica de medida → Enorme variabilidad: TIPO DE ANALITOS: tenemos que mirar que analito nos interesa, que características tiene… Orgánico volátil: - Destilación - Volatilización: atrapamiento (criogénico, adsorbente…) Orgánico no volátil: extracción con disolvente Inorgánico: - Extracción con líquidos - Disolución (ácidos, bases) → MUESTRAS SÓLIDAS: Ataque progresivo: si nos interesa determinar analitos inorgánicos - Disolución (H₂O): podemos disolver toda la muestra - Digestión (Ácido/Base): si no se disuelve en agua → Calor (placa, manta, MW, Bunsen) → Recipiente abierto (pérdida volátiles): como nos interesa lo inorgánco y no los volátiles, nos da igual perderlos PERO hay que tener cuidado porque puede estar pre-concentrado → Recipiente cerrado (control T/P): Si nos preocupa la pérdida de volátiles, Fusión alcalina (crisol, sal alcalina, calefacción intensa): cuando el otro no es posible 3 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 Extracción selectiva (*EDTA, Hache, *NH4Ac,...): no siempre hace falta disolver toda la muestra para analizarla Ej. Método Kjeldahl: digestión ácida - Nos permite calcular el contenido proteico en cualquier alimento - Se basa en una digestión del nitrógeno orgánico con ácido sulfúrico y un catalizador de cobre. Todo el nitrógeno se transforma en amonio - El amonio se deja reaccionar con sosa y se destila obteniendo amoniaco - El amoniaco se valora con ácido clorhídrico. Dependiendo del ácido clorhídrico que se haya consumido, podemos llegar al amoniaco que hemos obtenido, con este al amonio que hemos obtenido y con este al nitrógeno orgánico que hemos obtenido. - La cantidad total de nitrógeno orgánico se puede relacionar con el contenido proteico → MUESTRAS LÍQUIDAS: aunque sea líquido, no siempre se puede inyectar Compatibilidad técnica analítica (poco tratamiento): - inorgánicos: mayoritariamente si - orgánicos: no tan inmediato > separación necesaria/concentración ELL (o partición líquido-líquido) - Adsorción/intercambio → MUESTRAS GASEOSAS: Análisis directo: coger el gas que queremos y directamente inyectarlo si concentración es alta - volatilidad - concentración Atrapamiento/liberación (preconcentración): analizar volátiles de muestras sólidas, líquidas… - adsorbente: sólido, líquido, criogénico → Ej. en líquido: bolsa de plasma en la que hay sustancias volátiles que pueden ser interesantes para el análisis. Se pone calor y las sustancias volñátiles se vaporizan. Entonces se pueden coger con una jeringa y analizarlas Analito volátil en material particulado en suspensión (analito está adherido a partículas) - Filtrado/extracción filtro Analito volátil en muestra sólida - “head space”, purga y trampa 3) Eliminación de interferencias → Interferente: modifica respuesta (+/-) → Dependerá de la selectividad. La eliminación de interferencias, es la eliminación de algo desechable que nos puede traer problemas Si no las eliminamos nos puede dar tanto respuestas en exceso como por defecto (dependiendo del instrumento) → Falta especificidad > purificación: extracción/disolución 4 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 propiedad analítica mesurada → Enmascarando: F-, EDTA, CN-... Formar un complejo muy estable para camuflar las interferencias → Separación física: añadir un disolvente en el que lo que nos interesa se disuelve ahí precipitación, extracción, destilación, cromatografía,... Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 4) Otras operaciones: → Preconcentración: análisis de trazas. Muchas veces tenemos muchas cosas a concentraciones muy distintas y necesitamos preconcentrar Técnica: ELL, EFS,... Concentrar la muestra líquida antes (evaporación disolvente) → Derivatización analito: derivado de propiedades conocidas compatible con determinación analítica. Reacción que se puede hacer al principio o al final. Finalidad: que el analito que no daría respuesta porque no presenta las mismas características que darían respuestas en nuestro instrumento la de. Derivatizamos en alguna cosa y así hacemos que de respuesta en ese instrumento o: Mayor volatilidad Color más intenso Propiedades espectroscópicas - Extracción líquido-líquido: es sencilla, limpia, eficaz, rápida y de bajo coste → Características Las dos fases implicadas son líquidas La separación se basa en procesos de distribución Control termodinámico del proceso → Inicialmente se añade el compuesto que nos interesa (analito en una fase acuosa que nosotros queremos extraer de alguna manera). A continuación añadimos la segunda fase orgánica (tienen que ser invisibles y si no se puede añadir algo para mejorar la separación de las fases o algún tipo de modificador que ayuden con la elucion). Se mezcla y se espera a que las fases se vuelvan a separar, el analito de interés se quedará en la fase orgánica (afinidad mayor por la fase orgánica que por la acuosa). Si tenemos suerte y la fase acuosa se queda abajo, abrimos y retiramos la fase acuosa, quedándonos con la orgánica 5 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 → Para evaluar la cuantitatividad de la extracción: consideramos que estamos hablando de un equilibrio (concentración de A en la fase orgánica está en equilibrio con la de la fase acuosa). La relación de concentración entre la fase líquida y acuosa se denominará constante de distribución (KD) A mayor valor de KD, más afinidad tendrá nuestro analito por la fase orgánica. Por lo tanto si queremos utilizar este método de extracción, tendremos que buscar Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. una fase orgánica o un disolvente adecuado Para evaluar el factor de recuperación (R): - Inicialmente, en la fase acuosa tenemos una concentración inicial del analito (C0) y añadimos el volumen de fase orgánica. - Después de la extracción, los volúmenes se quedan igual pero la concentración inicial se ha dividido en lo que ha quedado de la fase acuosa y en la orgánica (Corg y Caq). - La relación de volumenes de fase orgánica y acuosa se denomina r (relación de fases) - Relación entre la concentración que queda en la fase acuosa, en función de la concentración que teníamos inicialmente, la constante de distribución y la relación de fases: R = Qorg/Qinicial - Cuanto más aumentamos R, más aumentamos volumen de la fase orgánica y lo que nos interesa está más dividido y será más difícil de extraer → Selectividad de la separación: nos interesa cuando tenemos más de un analito que queremos separar. Separar dos sustancias entre sí por ELL→ necesario que las correspondientes KD tengan valores suficientemente distintos El factor de separación es el que nos da la selectividad a nuestra extracción El objetivo es que A se nos quede en la fase orgánica y B en la acuosa Estoy haciendo dos cosas a la vez: extrayendo mi analíto, preconcentrandolo (porque alomejor la fase orgánica es muy pequeña) y además estoy consiguiendo que B y otros interferentes se queden en la fase acuosa - Para que esto pase nos interesa el parámetro α → cuanto más se separe del otro, mayor será el factor de separación (cuanto más se distingan mejor) 6 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 → Relación de distribución: lo mismo que la constante de distribución (KD) PERO cuando la forma química en la que puedes encontrar el analito de interés en la fase acuosa u orgánica no siempre será la misma. Ej. Un ácido puede estar neutro, desprotonado, con doble carga o totalmente desprotonado. Por ejemplo el ácido fosfórico, dependiendo del pH: H3PO4/H2PO4-/HPO42-/PO4- todos se pueden producir en la fase acuosa pero a la fase orgánica solo pasará la neutra (H3PO4), los demás se quedarán en la fase acuosa. Por lo tanto, hay que controlar el pH de la fase acuosa para tener todo o la mayor parte del analito en la forma neutra porque ese será el único que pasará a la fase orgánica. Relación de distribución (D) = sumatorio de todas las formas en las que se puede encontrar nuestra molécula → Extracción liq-liq también se puede hacer por etapas: haríamos una primera extracción separando la fase orgánica de nuestro analito A. Nos quedaría la fase orgánica en un erlenmeyer y se nos quedaría la fase acuosa en el embudo, donde añadiríamos una nueva fase orgánica (hacemos esto por si nos ha quedado algo de analíto en la fase acuosa sin estraer). Conseguimos una segunda extracción. Por etapas nos interesa que la fase orgánica quede debajo para que sea más fácil Podemos calcular la concentración que nos queda cada vez en la fase acuosa: (C0 en Caq2 es Caq1) CONSIDERACIONES IMPORTANTES - Cuanto mayor es D, menos extracciones necesitamos para conseguir una recuperación efectiva del soluto - Se obtienen mejores resultados con más extracciones con volúmenes pequeños de disolvente que con una extracción única con un volumen grande 7 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 ASPECTOS PRÁCTICOS A CONSIDERAR - Se produce una dilución del soluto en la fase orgànica combinada con cada extración adicional - Si la fase orgánica es menos densa se complica la realización práctica de la ELL repetitiva Factor de recuperación (R): Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. - Extracción en fase sólida o extracción líquido/gas-sólido (EFS): → Tenemos dos fases: Fase inicial = fluido (líquido o gas) Segunda fase (extractante) = sólido que tiene adherido un punto activo (tiene características que hace que en este punto activo se adhieran las moléculas que están en la fase líquida/gaseosa que son de nuestro interés) → Definición: Retención por adsorción de solutos en un adsorbente (puto activo) adecuado y posterior desorción mediante un disolvente (elusión química→ de fase sólida pasar a fase líquida) o aumentando la temperatura (desorción termica) → Extracción de 4 pasos principales: tema de polaridades; la aplica para retener analitos de interés 1) Acondicionamiento del cartucho→ se encuentra inactivado, se acondiciona con el paso de algún disolvente, para que pueda ocurrir el segundo paso 2) Paso de muestra→ tenemos una muestra acuosa con compuestos de interés (analitos de interés) y con compuestos interferentes. Pasamos nuestra muestra a través del cartucho y se nos quedarían retenidos en nuestra fase sólida con puntos activos 3) Lavado→ quitamos los interferentes con un disolvente con afinidad por ellos pero no por nuestros analitos 4) Elución→ aplicamos un disolvente que tenga afinidad por nuestros analitos, se quedarán adheridos en la fase estacionaria de este → También se puede hacer de otra manera (con 3 pasos): acondicionamiento, paso de muestra y el tercer paso es el que cambia; elución con disolvente que tiene afinidad solo por nuestros analitos y los interferentes se quedan en el cartucho (más fácil y más parecido a una filtración) → ADSORBENTES: Características: - Funcionalidad: afinidad de los analitos por el - Tamaño de partícula: cuando es pequeño, más área superficial tiene y más puntos activos tiene para que cuando pase la muestra, los analitos se queden adheridos al punto activo - Área superficial: cuando más haya, más posibilidad de que se queden adheridos - Tamaño de poro: cuanto más pequeño, más área superficial y más posibilidad de que se queden adheridos - Inercia química: que no interactúen con los analitos y los degraden Materiales más utilizados: en función de lo que queramos separar, buscaremos una afinidad u otra - Sílice y derivados (silicagel y sílices enlazados), Intercambiadores iónicos, Polímeros, Carbón, Polímeros con metales enlazados, Específicos (reconocimiento molecular) → Mecanismo de retención: tenemos un polímero donde se adhieren grupos silanoles (SiOH), esta sería nuestra fase estacionaria (molécula que me interesa separar de mi muestra). 8 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 Fase normal: parte polar (amina que está con silanol) y apolar - Interacción que se produce entre la fase estacionaria y mis moléculas se hace desde la parte que tiene cierta polaridad (lo que es polar interacciona) - Primero la muestra está disuelta en un disolvente no polar, luego se pasa por un disolvente polar y nuestro analito de interés se suelta y lo obtenemos (elución) Fase reversa: sería al revés, la fase estacionaria no es polar (Si con cadena; sílice enlazada) Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. - Primero muestra está disuelta en un solvente polar, luego se pasa por un disolvente apolar y se sueltan nuestros analitos de interés → También se puede llevar a cabo un intercambio con grupos catiónicos o aniónicos Elución grupo catiónico: con un grupo aniónico en fase estacionaria retenemos los catiónicos, luego en la elución se añaden cationes más afines que nuestro catión de interés para que se suelte Elución grupo aniónico: con un grupo catiónico en fase estacionaria retenemos los aniónicos, luego en la elución se añaden aniones más afines que nuestro anión de interés para que se suelte → Breakthrough: los disolventes se pueden saturar: no retienes más y haces una mala cuantificación→ por eso es muy importante calcular correctamente que cantidad de absorbente vas a utilizar → Hay cartuchos de muchas formas: pasar muestra por gravedad, pasar por vacío (el más eficiente para analizar agua, automatizado) → Ej. Experimento de cómo se comunican los ratones madre con sus hijos las primeras semanas después del nacimiento. La hipótesis es que los ratones hijos emiten unos volátiles con los que las madres saben reconocer cuales son sus crías. Se meten en un erlenmeyer con arena para que haga como si fuera el calor de la madre y una entrada de aire para que no se mueran. También hay un tubo con un adsorbente para captar los volátiles que sueltan los ratones y poder analizarlos → Comparación EFS vs ELL Ventajas: Preparación de muestra en el campo, Rapidez y simplicidad, Se evitan emulsiones, No es necesaria la evaporación de disolventes, Flexibilidad, Automatización Inconvenientes: Procesos competitivos agua adsorbente, Necesidad de filtración de muestras sucias, Menor rango de aplicabilidad, Control de retención y elución 9 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 4. LA MESURA DE LA SEÑAL ANALÍTICA: todos los procesos hechos previamente, son para poder realizar una mesura correcta - Operaciones previas → *analit en condiciones mesura - Propiedad físico-química = K x (concentración analito) → Métodos absolutos: K teórica → Métodos relativos: K empírica - Finalidad: → Identificativa - Cuantitativa (normalmente esta) – Estructural (enfrentar moléculas que desconocemos, poder decir que esta molécula es x) → ¿Cómo? Mesurando propiedad analítica = f(cantidad y/o calidad) - Clasificaciones: 1) Función tipo propiedad y forma aplicación: TÉCNICAS CLÁSICAS Análisis cualitativo Marcha sistemática Identificaciones directas Análisis orgánico Análisis cuantitativo Gravimetría Volumetría TÉCNICAS INSTRUMENTALES Técnicas ópticas Emisión atómica Absorción atómica Emisión molecular Absorción molecular Rayos X (Abs, F, Difr) Técnicas eléctricas Potenciometría Voltamperometría Culombimetria Electrogravimetria Conductimetria Técnicas térmicas Termogravimetria Análisis térmico diferencial DSC Técnicas radioquímicas Activación de neutrones Dilución isotópica Técnicas de separación Cromatografía Electroforesis 2) Función de la respuesta: Total (demasiado/mol) – Concentración - TÉCNICAS: TÉCNICA PARÁMETRO MESURADO Gravimetría Peso del analito puro o compuesto estequiométrico que lo contiene Volumetría Volumen de disolución de reactivo patrón que reacciona con el analito Espectrometría Intensidad de radiación emitida o absorbida por el analito 10 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 Electroquímica Propiedades eléctricas de las disoluciones de analito Radioquímica Intensidad de radiaciones nucleares emitidas por el analito Espectrometría de masas Abundancia de iones en función de su relación m/z procedentes del analito Térmica Variaciones temperatura/calor en función de procesos térmicos externos a muestra Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Cromatografía Posición de las señales de la *analit en función del tiempo o el espacio - Esquema general de un instrumento: → GENERADOR DE SEÑAL (muestra/energía) → TRANSDUCTOR DE ENTRADA → PROCESADOR DE SEÑAL → TRANSDUCTOR DE SALIDA (espectro/pantalla) Generador de señal: se produce una interacción entre el analito que yo quiero mesurar y alguna fuente de energía Transductor de entrada: se produce una conversión de la propiedad físico-química (E1) que se traduce a una señal eléctrica (E2) Procesador de la señal: se puede filtrar, amplificar integrar… Señal electrica que se transforma (adecuación) Transductor de salida: esa señal transformada se convierte en una señal comprensible para nosotros (en una pantalla, en un gráfico o en un dispositivo analógico…) → Un instrumento analítico es un dispositivo que convierte una señal que no suele ser directamente detectable por los seres humanos, en otra forma que si lo es. 5. ASPECTOS CUANTITATIVOS EN LOS MÉTODOS ANALÍTICOS→ 2 tipos de calibrado: 1) Calibrado instrumental: para garantizar el funcionamiento correcto del instrumento utilizado por la cuantificación (balanza, bureta, espectrofotómetro, potenciómetro,...). Se realiza utilizando estándares que no contienen el analito (filtros de longitud de onda, pesas de calibración...) 2) Calibrado metodológico: su finalidad es establecer una relación clara e inequívoca entre la respuesta instrumental y la cantidad/concentración del analito. Los estándares utilizados en estos casos si que contienen el analito. - CUANTIFICACIÓN CON CALIBRADO METODOLÓGICO: → Utilizan instrumentos en los que es posible definir una relación clara entre señal y concentración → Curva de calibrado: → Serie de estándares analíticos (pureza) → Son los métodos más utilizados en QA → La concentración de la analito se obtiene interpolando (o extrapolando) la señal de la muestra en la curva de calibrado: Calibrado externo (solvente o en matriz): - En solvente: → Disoluciones patrón de diferentes concentraciones preparadas a partir de una disolución patrón “madre” del analito que queremos determinar → Disolución madre: disoluciones que preparamos en el laboratorio una vez, se tienen que preparar siempre por peso y en concentraciones muy elevadas para asegurar la estabilidad del analito, se conservan siempre en congelador. Se utiliza una balanza analítica. → A partir de las madre se preparan las disoluciones denominadas stock: se conservan en nevera y son las de trabajo diario 11 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 → Se preparan en disolvente. No hay componentes de la matriz. → ¿Cuándo? Cuando no existe efecto matriz (si existe, la respuesta del instrumento es diferente si yo mido la misma concentración de analito en solvente o en matriz; para que no exista tiene que dar la misma respuesta) Un único calibrado para todas las muestres Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Interpolación (para obtener concentración muestra) - En matriz: → La preparación de los patrones se realiza utilizando matriz “blanca” → Los patrones contienen los componentes de la matriz: cuanto más parecida sea la matriz blanca mejor. Ej. determinar en el plasma metabolitos de nuestro sistema; encontrar un plasma sin metabolitos para que funcione como matriz blanca→ plasma sintético sin metabolitos para calibrar → ¿Cuándo? Cuando existe efecto matriz de exaltación o supresión de la señal Hace falta matriz “blanca” (no contiene analito) Interpolación Calibrado de adiciones estándares → La preparación de los patrones se realiza utilizando la muestra → ¿Cuándo? Cuando existe efecto matriz de exaltación o supresión de la señal No tenemos matriz “blanca” (tenemos analito, nos da señal del analito; sino empezar por 0) Extrapolación (único más adecuado que interpolación) Una calibración por muestra → ¿Cómo podemos asegurar similitud entre patrones y muestra? Añadiendo los patrones sobre la muestra Hacer alícuotas con la muestra y el patrón adicional y después se enrasan con disolvente Calibrado con patrón interno → Patrón interno (P.I): Analito diferente al que quiero analizar pero con comportamiento parecido P.I: mis analítos marcados isotópicamente, para asegurar que no está en la muestra → Se añade P.I a muestras y patrones calibración siempre a la misma concentración (antes o después de extracción): misma concentración en todos los muestreos y patrones → Corrección de la deriva de la señal instrumental Cuando yo estoy trabajando en respuesta relativa a una cosa, si ese analito se comporta como el mío, la relación siempre será constante. → “Manipulación” muestra/patrón no reproducible → Efecto sobre precisión y exactitud 12 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 → Sa/Spi = b0 + b1 x Ca Medida de la señal relativa Sa/Spi Interpolación - CALIDAD DEL CALIBRADO: Parámetros más importantes que determinan la calidad de la calibración: → Precisión de las medidas → Veracidad de los estándares: si yo mesuro algo, estar segura de que es esa medida → Validez de la comparación - VALIDEZ DE UN CALIBRADO: mesurar muestras de las que conocemos sus concentraciones → Comprobación de la exactitud de los resultados en muestras fortificadas o materiales de referencia: → Comparación entre los resultados entre el método escogido y un método alternativo por una serie de muestras de diferentes concentraciones (si no tenemos material de referencia) → Necesidad (y frecuencia) de la re-calibración: normalmente calibrar siempre que se va a hacer → Calibración más simple → un estándar → NO HABITUAL → estándar de confianza y de concentración similar (mesurar un punto, interesa que sea el blanco) y = b1· c b1 = sensibilitat y = b0 + b1· c b0 = magnitud del blanc b1 = sensibilitat → Modelo matemático por mínimos cuadrados: evaluar los residuales (diferencia entre concentraciones) Error relativo = residuales → puede haber mucho error pero ver que hay una tendencia, aun asi ese valor no se puede coger porque es un mal calibrado Restricciones: - La incertidumbre asociada a la respuesta instrumental de cada punto experimental tiene que ser mucho más grande que la incertidumbre asociada al correspondiente valor de concentración. Esta condición se suele cumplir en la mayoría de los casos. - La incertidumbre asociada a la respuesta instrumental (estimable por ejemplo mediante repeticiones) tiene que tener un valor constante a lo largo de todo el intervalo de linealidad (el que se conoce como homocedasticidad). - Los errores aleatorios asociados a la respuesta instrumental tienen que ser mutuamente independientes. A la práctica esto implica que los estándares utilizados para construir la recta de calibración se tienen que preparar de forma independiente, a partir de una o varias disoluciones madre. Validación modelo de recta: - Coeficiente de correlación = r 13 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10214901 6. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS - Proceso utilizado para confirmar que el procedimiento analítico utilizado para un ensayo específico es adecuado para el uso previsto - Consiste en una serie de experimentos específicamente diseñados para la evaluación - Requisito previo a la autorización de su uso en el laboratorio - ¿Cuando hará falta la validación de una metodología analítica? Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. → Antes de introducirlo en trabajos de rutina → Siempre que se introducen cambios en las condiciones de aplicación → Cuando se cambie el método - Parámetros de validación: → ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD → RANGO DE LINEALIDAD → PRECISIÓN: repetibilidad, reproducibilidad → EXACTITUD → LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN (Determinación) - Especificidad/selectividad: → Preparar 1 blanco de procedimiento: una muestra que contiene todos los pasos de mi método excepto la muestra (no contaminar la muestra) Ej. extracción fase-sólida: primer paso acondicionar cartucho, introduces todo menos la muestra → 1 blanco de muestra → 1 muestra fortificada (nivel LOQ): añadir un patrón de x concentración para obtener una muestra fortificada. Se añade a una concentración concreta en la que yo pueda asegurar que si yo tengo una muestra que está por encima de x mg yo la podré cuantificar (LOQ) → Criterio aceptación: Señal del blanco < 30% del LOQ - Linealidad y curvas de calibrado: “...posibilidad de establecer una relación directa o matemática muy definida entre la respuesta y la concentración de analitos en muestras dentro de un rango...” → DETERMINACIÓN: Medida de una serie de 3-6 inyecciones de disoluciones patrón (5 o más) cubriendo, al menos, un rango de 50-150% del nivel de actuación → EVALUACIÓN: Ajuste matemático de la regresión (mínimos cuadrados) Inspección visual por representación gráfica → CASOS ESPECIALES: Necesidad de aplicación de calibraciones con “ajuste de matriz” → Criterio aceptación: r2 ≥ 0.99 → No tendencia residuales - Precisión (repetibilidad y reproducibilidad) “...dispersión de una serie de valores mesurados frente a un valor central (medio) y que incluye, considerado de forma global, todas las posibles fuentes de variabilidad...” → REPETIBILIDAD: sin cambios en operador, sistema o día n (5-10) medidas repetidas a 3 niveles de concentración ESTIMADOR: Desviación Estándar Relativa CRITERIO: