Untitled Quiz

מיקרוסקופיה

• התפתחות מיקרוסקופ הפלואורסנטי היא ציון דרך משמעותי בהיסטולוגיה.
• חומרים פלואורסנטיים יפולטו אור בעל אורך גל קצר מזה שהוקרן עליהם, בהתאם לסוג החומר.
• לדוגמה, הקרנה בסגול תניב כחול, הקרנה בירוק תניב צהוב.
• פלואורסנציה מאפשרת סימון עצמים רבים בצבעים שונים בו זמנית.
• ניתן לייצר נוגדנים למבנים רצויים ולצרף אליהם חומר פלואורסנטי שיאיר.
• VTS היא טכניקה שמטרתה להבין מה רואים, מה גורם לראות זאת, ולחשוב על דברים נוספים שלא נראו.
• בתמונות משתמשים בחלבונים פלואורסנטיים, כמו GFP, אשר דומים לחומרים פלואורסנטיים אך המבנה המרחבי שלהם מקנה להם תכונה זו.
• ניתן להאיר את החלבון GFP (שמאיר בירוק) בכחול.
• ניתן להחדיר גן GFP לדנ"א של תאים משום שחלבונים מקודדים מהדנ"א.
• יש להחדיר גן עם פרומוטר כדי שפקטורי שעתוק יתחברו אליו באופן אינדיבידואלי כדי שהחלבון יתבטא ללא תלות בתפקוד התא.
• ניתן להאיר סוגי תאים שונים ולבודד אותם מתוך רקמה עם תאים רבים אחרים על ידי הבהרה סלקטיבית.
• שילוב צבעים שונים מאפשר ללמוד על הקשר בין תאים שונים, לדוגמה, תא עצב שמבטא חלבונים 1 ו-2, ותא אחר שמבטא חלבונים 2, 3 ו-4.
• ניתן ללמוד על תהליכים פיזיולוגיים בזמן התרחשותם מצילום תמונת מצב.
• תמונה של חתך מוח עוברי ביום מסוים בהתפתחות מציגה כלי דם במוח שנמצאים בשלב ההתפתחות, מגששים זה אל זה ובסוף מתחברים.
• החומר הכחול צובע את הדנ"א, והחומר הירוק הוא נוגדן הצובע כלי דם.
• החומר האדום צובע את הדם, ניתן להבחין שהוא לא נשפך החוצה, כלומר, קצוות כלי הדם שנוצרים הם אטומים.
• צהוב הוא שילוב של ירוק עם אדום.

צביעות קלאסיות במיקרוסקופ אור (לא פלואורסנטי)

• Hematoxylin & Eosin: צביעה בה כחול צובע חלקים חומציים (כמו חומצות גרעין ורנ"א) ואדום צובע חלקים בסיסיים (כמו חלבונים).

• PAS: צביעה המבליטה סוכרים בצבע סגול.

• Vital Stain: חומרים שנספגים לתאים כך שהתאים הבולעים את הצבע נצבעים בכחול.

• Trichrome: צובע סיבים.

• Elastic Stain: צובע סיבים אלסטיים.

• Silver Stain: צובע סיבים.

• שימוש בטכניקות צביעה אחרות בדילול מאפשר צביעת חלק מאלמנטים כך שלא כל האלמנטים נצבעים

• תמונה של silver staining מסוג golgi מאפשרת הסתכלות על נוירונים

• מומלץ לזכור כי בתמונה יש המוני תאים, אבל אם כל התאים היו נצבעים לא היה ניתן לראות את השלוחות.

• כשיש לשפוך לתוך הדגימה חומר פלואורסנטי האמור לקשור מבנה מסוים, חשוב לזכור שהוא ייקשר למבנה הרצוי, אך הוא גם יישאר בתמיסה לא קשור לשום דבר.

• חייבים לשטוף את הדגימה כדי שניתן יהיה לקבל מידע מהדגימה, כך הפלואורסנת היחיד שיישאר בדגימה הוא זה שקשור למבנה הרצוי.

• שימוש בחומר קושר דנ"א מאפשר למידה על הרקמה רק מלהסתכל על הגרעינים שלה ועל המיקומים והצפיפות שלהם - ניתן להבדיל בין שתי רקמות.

• צביעה של הגרעינים בלבד מאפשרת להבין מיד שמדובר במוח, וגם להבדיל בין אזורים עם צפיפות גרעינים גבוהה ונמוכה.

• הדנ"א עצמו אינו פלואורסנטי, אלא החומר שנקשר אליו, כמו DAPI.

• החומר מיטוטרוקר, חומר פלואורסנטי בעל זיקה למיטוכונדריה מאפשר להציג את כל המיקומים בהם יש מיטוכונדריה כי ייקשר אליה.

• במיקרוסקופ אור, התמונה מצולמת עם רזולוציה שאינה נמוכה מספיק לתעד מיטוכונדריה בודדה. מתקבלות רשתות שהן אוסף של מיטוכונדריות בגלל זה.

• החומר פלויידין בעל אפיניות למולקולות חלבון ולכן הוא צבוע את סיבי האקטין (שלד תוך תאי).

• צביעה אימונו-פלורוסנטית היא צביעה פלורסנטית שנעזרת בנוגדנים, אותם אפשר לסווג לשתי קטגוריות: ישירה (direct) ועקיפה (indirect).

• בצביעה אימונו-פלורוסנטית ישירה משתמשים בנוגדן שקשור לחומר פלורסנטי מצד אחד ומצד אחר נקשר לאנטיגן המתאים לו על גבי התא שנבחר.

• בצביעה אימונו-פלורוסנטית עקיפה יש נוגדן שמזהה את האנטיגן שלו בסוג התא/חלבון הרצוי, הנקרא נוגדן ראשוני, אבל הוא עצמו לא מסומן פלורסנטית.

• מוסיפים נוגדן שניוני שנקשר לנוגדן הראשוני והוא עצמו כן קשור לחומר פלורסנתי.

• היתרון בשיטה זו הוא הגברה של הסיגנל, כי במקום מולקולה אחת יש שלוש.

• כדי לייצר נוגדנים, מזריקים לגוף חומרים זרים לו, באופן הזה הוא הופך ״מחוסן" ומייצג נוגדנים לאותו חומר שהשתמשו בו.

• אוספים את הנוגדנים האלה ומשתמשים בהם למחקר.

• בדרך כלל מחסנים באמצעות חלבונים של רקמה ולא תערובת של הרקמה עצמה.

• אלה הם הנוגדים הראשוניים.

• כדי לייצר נוגדנים שניוניים, לוקחים את הנוגדנים הראשוניים שיצרנו ומחסנים חיה אחרת, שאותם נוגדנים זרים לה. שימוש בשיטה זו מאפשרת יד חופשיה יותר במעבדה.

• צביעה עם נוגדנים לא חייבת להיות פלורסנטית, אפשר להשתמש גם בצבעים של האור הנראה.

• כדי לקבל חתך צבוע, שופכים עליו נוגדנים מתאימים לאנטיגנים שקשורים בקצה האחר שלהם אנזימים, שוטפים ושופכים מעל את הסובסטרט שמגיב לאותו אנזים. התוצר של התגובה הוא צבע ושוקע במיקום של האנזים.

• היתרון של שיטה זו היא אפשרות לשלוט על עוצמת הצבע – ככל שניתן יותר סובסטרט, יתקבל יותר תוצר צבוע.

מיקרוסקופ אלקטרונים

• למיקרוסקופ אור יש מגבלות רזולוציה, במיוחד כשמסתכלים על רקמה, אפשרי להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים
• מיקרוסקופ אלקטרונים משתמש באורכי גל קצרים יותר, וזה נותן רזולוציה טובה יותר.
• במיקרוסקופ אור יש לנו מקור אור, עדשה מרכזת על הדוגמה, עדשה שאוספת אור מהדוגמה ועדשת עין שמגדילה את התמונה.
• במיקרוסקופ אלקטרונים יש במקום מקור אור אקדח אלקטורנים, במקום עדשות אופטיות יש מגנט שמרכז את האלקטורנים.
• מגנט אוסף את האלקטרונים שעוברים דרך הדוגמה, ומגנט נוסף משמש כמקרן שמקרין את הדוגמה על מסך. בשונה מאור נראה, אלקטרונים עוברים פחות טוב דרך רקמה חיה, לכן הדוגמה צריכה להיות דקה יותר מהדוגמאות שמשמשות למיקרוסקופ אור -מתכות שהם מה שקובע האם יהיה סיגנל מאזורים ברקמה או לא זה נוכחותן של מתקדשים יותר. קובע איפה האלקטרונים יעברו .ולכן בכל חלקי הרקמה בהם יש מתכות האלקטרונים לא יכולו לבעבור.
• הצבע מקורב לצביעה רק שפה משתמשים במתכות כבדות. עובי דוגמה למיקרוסקופ פלורוסנטי הוא 12 מיקרון ולמיקרוסקופ אלקטורנים עובי הדוגמא קתנה ל70 ננומטר . יכולת הסימון במיקרוסקוף الكتروني יותר מוגבלת. בעיית הרזולוציה נפתרה בזכות פילת העומק בעת הסתכלות דגמאנות הסומנות. ניתן לפתור את בעיית העומק בעזרת מיקרוסקופ קווקפלי.

מיקרוסקופ קונפוקלי

• ניתן לראות את אותה הדוגמה, אחת תחת מיקרוסקופ רגיל והשנייה קונפוקלי, הרזולוציה טובה יותר בקונפקאלי.
• המקור לטשטוש הוא שיש סיגנלים שמגיעים ממישורים שלא קשורים אחד לשני, כאשר אור מוקרן לדוגמא עבה הוא פוגע בכל המוקולות בסביבה התחתית מטושטשת מיקרוסקופ קונספקלי אור פולאוריצסמטי שמוגברת בו ברזולוציה הדו מיימדי שלו, ששווה גם אותו מידה כמו אפדי קראקלאסי ,אבל בניגוד לזה יש לו וולוציה חום טובה .