Examen Coproparasitario: Metodología y Empleo (PDF)

Rev Med Uruguay 1996; 12: 215-223 Examencoproparasitario.Metodologíay empleo. Revisióntécnico metodológica Dr. Roberto Salvatella ', Tec. Carlos Eirale 2 El examertcoproparasitario es un conjunto de técnicas d...

Rev Med Uruguay 1996; 12: 215-223 Examencoproparasitario.Metodologíay empleo. Revisióntécnico metodológica Dr. Roberto Salvatella ', Tec. Carlos Eirale 2 El examertcoproparasitario es un conjunto de técnicas diagnósticas que constituyen la irtdicaciafl metodol&ica para la identificación de la mayoría de las enteroparasitosis motivadaspor protozoarios o helmintos. Su eficacia y sensibilidad para establecer un diagiu5sticocorrecto dependende la adecuada indicación y preparación de la muestra, los datos clítiiros y antecedentesde interés que sean aportados al laboratorio y de su correcta y completa ejecución coti ezmen directo microscópico, enriquecimiento y examen macroscópicoJìna1.Otras técnica.9complementarias(coloraciones, enriquecimientos especiales,etcétera},contribuyen a completar el esquemadel examen,en circunstancias específicas(agentesoportunistas, emergentes,exóticos 0 endémicos).La presente comunicaciónpresenta la metodología y desarrollos en la práctica diaria del Laboratorio de Parasitología de la Repartición Microbiología del Departamento de Lnboratorio Clínico de la Factdtad de Medicina. &&ibt~ &v@: &fermedades parasitarias-diagnóstico Helmintos-microbiología Ho6mintiasis-diagnóstico Protozoari&microbiología Infeccionespor protozoarios-diagnóstico Análisis microbiológico una incidencia de 500.000 nuevos casos anuales, así como la infección por Entamoeba histolytica que afecta Actualmentelas enteroparasitosisrepresentanen el mun- aproximadamentea 50 millones de individuos. do un importante problema de salud pública (l). La Or- ganizaciónMundial de la Salud (OMS) @)estima que la Aunque la mortalidad producida por enteroparasitosis ascaridiasisproducecuadrosclínicos en 214 millones de es baja, los números totales a nivel mundial, alcanzanal- personasa nivel mundial la tricocefalosis en 133 y las tas cifras como 90.000 decesos para anquilostomiasis, uncinariasen 96 millones. En el casode los protozoarios 60.000 por ascaridiasisy 70.000 por amibiasis. Fuera de enteroparásitos,sirven como ejemplo: la giardiasis con estoslamentablesefectos, este grupo de afecciones moti- va infecciones crónicas con efectos negativos e insidio- sos en el crecimiento, nutrición y desarrollo psicofuncio- nal de los ‘niños,con especial repercusión en niñas y mu- 1I Profesor Adjunto 2. Tecndlogo Laboratotista jeres. Laboratorio de Pmsitologia. Repartición Microbiología. Departamen- En Uruguay, es un grupo de afeccionescuya verdadera to de L&oratorio Clínico. Hospital de Clínicas. Facultad de Medicina. Universidad de la República. entidad se desconoció durante mucho tiempo, hasta que Correspondencia: Dr. Roberto Salvatella. Hospital de Clínicas. De- actuales investigaciones detectaron los verdaderos gru- partamento de Laboratorio Clínico. Repartición Microbiología. Labo- pos de riesgo en los que las enteroparasitosis alcanzan ratorio de Parasitología. Av. Italia s/n. Montevideo, Uruguay. prevalenciasy morbilidad de consideración (3). Recibido 16/5/96 Aceptado 224 1/96 Aunque se dispone para el diagnóstico de algunos Vol. 12 No3 Diciembre 1996 215 Dr. Roberto Salvatella, Tec. Carlos Eirale agentes, de métodos inmunológicos (4), la metodología oarásitos o dificultades nara extender frotis de colora- parasitológica directa, organizadabajo el nombre de exa- men coproparasitario, constituye el procedimiento de El cronograma de obtención del material debe consi- elección para el diagnóstico de la mayoría de estasdolen- derar: a) que muestrasúnicas solo permiten diagnósticos cias t5). positivos en 60% de las materias con parásitos (i3); b) El examen coproparasitarioposeelejanos antecedentes que los parásitos(protozoarios y helmintos) tienen ciclos que van desde el reconocimiento de helmintos enteropa- de eliminación de huevos y quistes con períodos negati- rásitos en tiempos de Hipócrates (@,hastala visualización vos para la presenciade los mismos en las materiasfeca- de Ciar& Iamblia (Stiles, 1915)por Leewenhoeckal ob- les y c) que existen diversos esquemassobrela secuencia servar materias fecales con el primer microscopio de SU de las muestras recolectables. invención, en la Holanda de 1683 (7). Los esquemasde recolección más empleadosindican El desarrollo de técnicasconcretases relativamentere- tres muestrasen días alternos, colectadassegún lo ante- ciente, con los trabajos de Brumpt y Langeron @lo), dis- riormente expresado. poniéndose en la actualidad de variadas técnicas que se Una condición fundamental paraobtenerlos máscom- complementan en diversos esquemas, implementados pletos y rigurosos resultados es acompañarel material por diferentes grupos de trabajo. con datos clínicos y antecedentes(personales,familiares Esta comunicación pretende mostrar los esquemasy y ambientales)del paciente,así como la sospechaque lle- métodos de trabajo adoptadospor el Laboratorio de Para- va a la búsqueda del diagnóstico coproparasitológico. sitología del Departamento de Laboratorio Clínico del Datos como inmunodepresiónde diverso tipo, proceden- Hospital de Clínicas y profundizar en las técnicas,reque- cia del extranjero, condiciones ambientalesdel examina- rimientos e indicaciones de estos estudios. Se seguirá un do o antecedentesfamiliares de parasitosis,puedenorien- orden de exposición lógico y acordea como avanzala de- tar o adaptar la secuenciade estudios y técnicas que se cisión y ejecución diagnóstica. ejecutarán. Indicaciones y solicitud Algoritmo de procesamiento y metodologías La indicación del examen coproparasitario,por parte del El desarrollo básicodel examencoproparasitariodebein- médico, debe atenderal parásitoque se sospecha,tomán- cluir ineludiblemente tres tiempos: a) examendirecto en dose en cuenta que esta metodología es realmente útil fresco, b) técnica de enriquecimiento y c) examen ma- para aquellos protozoarios, cuyos trofozoítos, quistes u croscópico. ooquistes, o helmintos, cuyos huevos o anillos se emiten La presencia de nuevas enteroparasitosisemergentes mezclados con las materias fecales. Esta consideración (criptoporidiosis, ciclosporidiasis, etcétera)o la pesquisa excluye a Etzterobius vemicularis (oxiuro), dada su ca- de parásitos exóticos para nuestro medio, con requeri- racterística biológica de oviposición en la margen anal, mientos diagnósticos especiales(anquilostómidos,etcé- por lo que su diagnóstico se efectúa mediante el método tera) llevan actualmentea la adopción de técnicas com- de espátula adhesiva. plementarias en 10 referente a coloraciones y enriqueci- Debe tenerseen cuenta, para efectuar con éxito el exa- mientos. men coproparasitario, la adecuada obtención de tres En la figura 1 se detallan los pasosde procesamiento muestras mínimas de materia fecal, debidamenteobteni- que adopta el Laboratorio de Parasitologíadel Departa- das mediante: preparacióndel paciente,correcta prepara- mento de Laboratorio Clínico de la Facultad de Medici- ción del material y cronograma de obtención (“). na. La preparación del paciente pasa por lograr mediante El material recibido, en correctascondicionesde envío un régimen alimenticio previo (48 horas antes), con la y conservación,pasaa ser procesadoen un primer tiempo menor cantidad posible de frutas, verduras y grasas,ob- de observaciónmicroscópica directa, en fresco y con tin- servaciones microscópicas libres de residuos, que obsta- ción por lugo1 parasitológico. Para la obtención de la culicen el estudio. muestra se procedea una observaciónde la materia fecal Una muestra correcta de materia fecal para el examen recibida, tomándose mediante asa bacteriológica mues- coproparasitario debe ser suficiente (más de 50 g), re- tras de elementospatológicos (moco, pus o sangre)si se ciente (conservar en heladerahasta8 horas y aplicar con- los observara, o de cualquier sector aleatoriamenteen servadores en plazos mayores), correctamente rotulada casode no identificarse materialesanormales. (nombre del paciente y fecha de emisión), en frasco de La observación se inicia con la suspensiónde ese ma- vidrio transparente, limpio, seco y de boca ancha con terial en una gota de 0,05 ml de solución salina isotónica, tapa-rosca y sin mezcla de orina (para evitar deterioro de sobre portaobjeto, y simultáneamenteotra muestra simi- 216 RevistaMédica del Uruguay  Examen coproparasitario. Metodología y empleo , Coloraciones y técnicas especiales Diarreas crónicas Figura 1. Algoritmo del examen coproparasitario en el Laboratorio de Parasitología del Departamento de Laboratorio Clínico. Técnicas de enriquecimiento: Ritchie o Faust. Coloraciones o técnicas especiales: 1) Negro de Clorazol, Tionina, Tricrómica, Bailenger; 2) Kinyoun, Sheater, WES y Calcofluor, autoflourescencia y flourescencia directa por anticuerpos monoclonales. lar seri mezcladaen 0,015ml de lugo1parasitológico.Este tracción de grasas,utilizándose en lugar de éter sulfúrico colorante; de gran afinidad por los azúcarescomplejos, el.acetato de etilo o el empleo soluciones alcohólicas permite obtenercoloracionescontrastadasque facilitan la tamponadas,en los últimos lavados del sedimento (‘;). observaciónde elementosintracelulares. Existen en la actualidad técnicas de enriquecimiento Los aumentos empleablesen el microscopio, se inicia- con equiposcomercialesdescartables,que poseenla ven- rán por el lente topográfico (30 x), para seguir progresi- taja de un procesamientoen circuito cerrado, hecho que vamentehastacompletarla totalidadde objetivos en seco brinda resaltable bioseguridad con gran exactitud diag- disponibles (generalmente200 x y 450 x). La búsqueda nóstica,pero estosmaterialesdescartablesposeenun cos- de huevos o larvas de helmintos requiereespecialcuida- to no siempreposible de absorberpor las instituciones(le”. do; ya que su presenciapuedeconcentrarseen sectoresde La tabla 1 detalla las ventajasy utilidades de las técni- la laminilla o de la muestrapreparada. casde Ritchie y Faust”“, que se utilizan en Uruguay des- Un resultado positivo, en el examendirecto, depende de largo tiempo atrás. del azaro de la presenciade un gran número y concentra- El examenmacroscópico se fundamentaen el macera- ción de elementosparasitariosen el material observado. do de la materia remanentesobre un tamiz (malla tina de El enriquecimiento es el tiempo del examen copropa- 0,5 mm) que se coloca debajo de un fuerte chorro de agua rasitario que tiene por finalidad la concentración de los de canilla, hastaobservarsolo restosvegetaleso eventua- elementosparasitarios,aumentandola sensibilidad de la les parásitos macroscópicos. El residuo retenido en la observacióncuandosu númeroesescasoy escapaa la de- malla fina se depositarápara su examen en una bandeja tección del examendirecto. Existen dos grupos de técni- esmaltadade fondo bicolor (campo negro y blanco). Este casde enriquecimiento:a) técnicasde sedimentacióny b) tiempo del examen coproparasitario es útil en el control técnicasde flotación. de tratamientode teniasis por T.saginato/soLium con anti- Algunas de las técnicas más conocidas y empleadas helmínticos, a los efectosde certificar curación por elimi- son, entre las de sedimentación,Ritchie o Carles y Bart- nacion del escolex, o para detectarotros parásitosde gran helemy; y entre las de flotación, Willis o Faust (14,‘5). tamaño (Ascaris lumbricoides, hidatides evacuadaspor En la práctica diaria del Laboratorio de Parasitología vía digestiva, etcétera.) del Departamentode Laboratorio Clínico, las técnicasde Los tres tiempos básicos (directo, enriquecimiento y concentración empleadasson el Ritchie, en sedimenta- macroscópico) constituyen etapasineludibles del trabajo ción, y el Faust, en flotación (ver anexos 1 y 2). diagnóstico,que implica un completo examencopropara- En relación a técnicas de sedimentaciónderivadas de sitario. la técnica básicade Ritchie, se cuentacon diversasmodi- La realización de estastres etapasjunto con la correcta ficacionescomo en caso del tiempo de lavado para la ex- preparacióndel material a examinar y la recoleccion se- Vol. 12 No3 Diciembre 1996 217 Dr. Roberto Salvatella, Tec. Carlos Eirale Tabla 1. Capacidades comparadas entre las técnicas de enriquecimiento coproparasitológico de Ritchie (sedimentación) y Faust (flotación) Técnicas Concentración Conteo Identificación Identificackjn Identificación Preparaciones’ huevos quistes trofozoítos Ritchie sí No sí sí sí No ’ preparaciones permanentes directas. * no permite recuperar huevos operculados l Figura 2. Ooquistes de Gfyptosporidium sp., extendido de material de enriquecimiento, teñido con técnica de Kinyoun. riada de tres muestras son la garantía de mayor eficacia empleada es la utilización del lugo1 parasitológico (ver en el diagnóstico a realizar. anexo 1). La irrupción de Cryptosporidium sp., como un entero parásito oportunista emergente,determinala adopcióndl Técnicas especiales y coloraciones una técnica de enriquecimiento por flotación: el métodc de Sheater (ver anexo 3) o flotación en sacarosa,consis La llegada de nuevos agentesde enteroparasitosisopor- tente en una flotación simple capazde obtener una ade tunistas emergentes (Cryptosporidium sp., microspori- cuada concentración.para los ooquistes de este agente, deos, etcétera.), la localización de endemiasenteropara- con coloración identifkatoria de estoselementos. sitarias focalizadas o regionales (estrongiloidiasis, unci- nariasis, etcétera.), problemas diagnósticos (identifica- Tanto el sedimentocomo el sobrenadantedel enrique- ción de agentes,alteración de trofozoítos, etcétera.)o fi- cimiento de rutina, para identificación de Cryptospori- nalidades de docencia e investigación obligan al empleo dium sp., debenpasarpor la coloración identificatoria del de técnicas especialeso de diversascoloraciones,muchas Ziehl-Neelsen modificado (técnica de semi ácido resis- de ellas de reciente generalizacióno descripción, que per- tencia) o de Kinyoun, que utiliza las cualidadestintoria- miten abordar los problemas y situacionesreseñados. les de semiácidoresistenciade los ooquistes(17)(ver ane- xo 4 y figura 2). El empleo de anticuerposmonoclonales En la observación directa “en fresco” y del enriqueci- marcadoscon fluoresceína, disponibles comercialmente, miento, la primera, más simple y generalizadacoloración constituye otra alternativa al diagnóstico. 218 Revista Médica del Uruguay I  Examen coproparasitario. Metodología y empleo Figura 3. Esporas de microspondios, extendldo de matenal de enriquecimiento. teñido con técnica de Kinyoun. Figura 4. Ooquiste de Cyclospora cayetanensis, extendido de material de enriquecimiento, teñido con técnica de Kinyoun. La propiedad de semi ácido resistenciatambién cola- intestinalis, Encephalitozoon sp.) se caracterizan por el bora al diagnóstico de dos nuevosenteroparásitosemer- pequeño tamaño de sus esporas (1x2 Pm), que poseen gentes:los microsporidios (figura 3) y Cyclospora caye- propiedadesde fluorescencia al utilizar la técnica de Van tanensis(figura 4). Gool con el colorante Uvitex 2b 0 Calcofluor (MR), LOS microsporidios (Enterocytozoonbieneusi, Septata siendoestatécnica de tinción y observación en microsco- Vol. 12 No3 Diciembre 1996 219 Dr. Roberto Salvatella, Tec. Carlos EN-ale pio de tluorescencia el principal elemento de SU recono- cimiento. Van Gool y colaboradoreshan empleado,com- plementariamente, técnicas de concentración especiales Materiafecal para estos parásitos (WES o técnica del Cytospin Gasa (MR)(ver anexo IO), que logran aumentarsensiblemente su detección (‘*). Malla C. cuyetunerzsispuede reconocersepor su semi ácido Agua resistencia, unida a un tamaño de ooquistes que alcanza entre las 7 y 9 pm de diámetrosdel ooquiste,con fluores- cencia propia al ser observadosen microscopio de fluo- rescencia (19). La identificación de quistes, ooquisteso trofozoítos de protozoarios enteroparrjsitospuede necesitar,en circuns- tancias determinadas, de coloraciones especiales.La he- matoxilina férrica de Heindenhain ha sido el método tra- Tubo de centrífuga - dicionalmente empleadoen nuestro medio, pero su labo- riosidad, prolongado tiempo de procesamientoy manejo artesanal de alguna de sus fases (decoloración), han he- cho desaconsejablesu empleo en los actualesesquemas diagnósticos de rutina. Por ello. nuevas técnicas de coloración más simples, Figura 5. Aparatode Baermann,para diagnósticode rápidas y fácilmente reproductibles se han integrado al larvasde Sstercorak. trabajo en coproparasitología.Una de ellas, la tinción con Negro E de clorazol (ver anexo 5), que permite una rápi- ción, ya que su diagnóstico particular sefundamentaen I da solución a la identificación de quistes, con correcta técnica de espátulaadhesivaen todassus variantesQ’) apreciación de detalles morfológicos útiles en la identifi- Pero en casosespeciales,como los nematodesque di: cación. persan larvas y no huevos (Strongyloides stercomlis uncinarias),el empleo de una técnicaclásica complemen A la observación rutinaria de los sedimentoso sobre- taria, como la de Baermman, complementa el procedi nadantes,según el enriquecimiento seleccionado,se pue- miento del examencoproparasitario(anexo 9). de añadir como rutina de extrema utilidad para fines do- centes, la observación de una muestrade material con co- Conclusiones loración de tionina (ver anexo 6), entre porta y cubreob- jeto. Esta simple metodología permite destacardetalles El examencoproparasitarioes la mayor herramientadiag- de pared, núcleos y organelos, en casosde difícil obser- nóstica disponible en el casode las enteroparasitosis,y su vación como Endolirnax nana, con ventajas sustantivas composición puedeser variada de acuerdoa las necesida- para actividades de docencia o entrenamiento, des eventuales de un diagnóstico, presenciade nuevas Similar rendimiento y posibilidades posee la colora- afecciones emergenteso peculiaridadesregionales. que ción de Ballenger (ver anexo 7), aplicable al producto fi- impongan el diagnóstico de una endemialocal (2’). nal de un enriquecimiento, para su rápida observación Su eficacia está directamenterelacionadaa la interac- coloreada entre lámina y laminilla. ción del clínico con el parasitólogo actuante. Factores Otra coloración de utilidad en la observacióny obten- como la calidad de la muestra,el aportede datos clínicos ción de preparacionesduraderas,en extendido sobrepor- y antecedentessuficientes y la solicitud oportuna y ade- taobjeto, es la técnica de coloración tricrómica (ver anexo cuada del procedimiento, harán que el rendimiento diag- 8) que permite observacionesidentificatorias de alta cali- nóstico alcancesu máxima performance. dad con conservación del material observado. No debemenospreciarsela prevalenciae incidencia de las enteroparasitosis,ya que en nuestromedio para algu- Para la identificación de los helmintos enteroparásitos nos grupos sociales de riesgo! estasafeccionesconstitu- es el examen coproparasitario la técnica de elección, por yen un claro motivo de morbilidad. medio de la observación microscópica de sus huevos o macroscópica de anillos en el casode Tnenk sp. o de he]- Summary mintos adultos como en el caso de Ascuris lumbricoides, siendo Ellterobius vermiculnris (oxiuro) la única excep- Coproparasitaryexamination constitutesa setof diagnos- 220 RevistaMédica del Uruguay  Examen coproparasitario. Metodología y empleo tic technique involving the methodologic indication ai- enniñosdela comunidad.CongresoFLAP, 10y Congreso med at the identifícation of most enteroparasitosesderi- Uruguayode Parasitología,1. Montevideo:1991. ved from portozoa or helminths. Its effectivenessof res- 4. Long E, Chrlstie J. 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Instituto Nacional de Microbiología “Dr.C. Malbrán”. 3. Zanetta E, Acuña A, Algorta G, Montano A, Méndez ManualdeTécnicasenCoproparasitología. BuenosAires: V, Murillo N. Enteroparásitos asociadosa diarreaaguda, Laboratoriode Parasitología,1994. Vol. 12 No3 Diciembre 1996 221 Dr. Robeffo Salvatella, Tec. Carlos Eirale ANEXO NoI a) homogeneizadoy filtrado y b) centrifugado y lava- do. Enriquecimiento por sedimentación. Método de Ritchie. 2) El último sedimentose resuspendeen una solución de 1) Homogeneizado y filtrado. sulfato de zinc al 33% de densidad 1033 glml. Mezclar y homogeneizar en un vaso de Bohemia una 3) Esta suspensiónse centrifuga a 1500 rpm por un mi- muestra de materia fecal de 5 g con 25 ml de suero nuto. fisiólogico salino. 4) Del material obtenido se extrae una muestradel mate- Pasar por embudo con triple filtro de gasa y algodón rial suspendidoen el menisco superior de la interfase a un tubo de centrífuga de fondo cónico 8 ml de la líquido/aire de donde se extrae medianteasa o pipeta suspensión, buscando retener los residuos más volu- Pasteur. minosos. ANEXO No3 2) Centrifugado y lavado. La suspensión obtenida en la etapa anterior se centri- Método de Sheather o flotación en sacarosa para fuga a 2300 revoluciones por minuto (rpm) durante un identificación de ooquistes de Ctyptosporidium sp. minuto. 1) Se toma un ml del sedimento obtenido por el método Se descarta el sobrenadante,y secando el borde del de enriquecimiento de Ritchie que se resuspendeen 5 tubo con un hisopo, se vuelve a resuspenderel sedi- ml de solución de Sheather(*). mento en suero fisiológico por agitación, volviendo a 2) Dejar reposarel material con el tubo en posición ver- centrifugar a 2300 rpm durante un minuto la nueva tical durante 3 minutos. suspensión. 3) Se toma la muestra de la superficie de la suspensión Esta operación se repite hasta obtener sobrenadantes con pipeta Pasteur, colocándoseuna gota entre por- translúcidos, generalmentetres veces. taobjeto y cubreobjeto. 3) Fijación y eliminación de grasas. 4) Observaciónde campos con aumentode 40 x en seco. Al sedimento final obtenido se le adiciona 2 ml de for- Los ooquistes se observan de color rosa con gran re- mol al IO%, homogeneizándosela muestra por agita- fringencia, membranabien definida y halo hialino. ción y dejándosereposar por cinco minutos, con fines (*) Solución de Sheather saturada. Sacarosa 500 g de fijación. A la suspensiónlograda se le agregan3 ml Cristales de fenol 65 g de éter, agitando vigorosamente el tubo tapado, para Agua Destilada 3200 ml extraer grasas. Calentar el agua destilada a ebullición, retirar el mechero y agrega1 los restantescomponentes,agitando con una varilla hasta completa 4) Centrifugado final. disolución. Se centrifuga el tubo a 1500 rpm durante un minuto. Descartamos el sobrenadante,limpiando la boca del ANEXO No4 tubo con hisopo de algodón. Técnicade Ziehl-Neelsen modificada; de semi ácido 5) Observación. resistencia o de Kinyoun, para diagnóstico de El sedimento obtenido estápronto para la observación Cryptosporidium sp. microscópica, tomándolo con pipeta Pasteur,para sus- 1)Colocar y extender una gota del sedimento obtenido pender en suero fisiológico y lugo1 parasitológico(*) por enriquecimiento sobre un lámina portaobjeto, de- sobre lámina portaobjeto, cubriéndoseambasmuestras jando secar a temperaturaambiente. con cubreobjetos. 2) Fijar con metano1por 5 minutos. La observación microscópica se efectuarácon objeti- 3) Cubrir el preparadocon carbol-fucsina al 4% durante vos en seco a aumentos de 100 x, 200 x y 450 x, su- 15 minutos a temperaturaambiente. cesivamente. 4) Lavar con agua destilada suavemente. (*) Lugo1 parasitológico. 5) Breve lavado con alcohol etllico 95%. Yodo metálico 2g Yoduro de potasio 4 g 6) Lavar con agua destilada suavtmente. agua destilada looml 7) Etapa de decoloración selectiva con ácido sulfúrico al Se disuelve el yoduro de potasio en el agua destilada y se agrega el 10% durante un minuto. yodo metálico, conservándoseel colorante preparado en botella co- 8) Lavar con agua destilada suavemente. lor caramelo y fuera de luz solar. 9) Aplicar coloración de contrastecon verde malaquita al ANEXO No2 0,8% o azul de metileno al 0,3% 10) Lavar con agua destilada y dejar secar al aire. Enriquecimiento por flotación. Método de Faust. 1l)Observación con lente inmersión de 1OOx o aumentos 1) Se repiten como en el método de Ritchie las etapasde: en seco máximos con frotis transparentadocon aceite 222 Revista Médica del Uruguay  Examen coproparasitario. Metodología y empleo de inmersión. Los ooquistes,por su condición de semi 3)Colocándose posteriormente en etanol al 70% con ácido resistentesse ven de color rojo sobre fondo ver- iodo de D’Antonioni durante 2 a 5 minutos. doso (cuando se utilizó verde malaquita) o fondo azul 4)Se continúa con un nuevo tiempo en etanol al 70% (contrastecon azul de metileno). durante 5 minutos, dejando escurrir el preparado, re- pitiendo la operación inicial dejándolo 5 minutos. ANEXO No5 5) Se agregael colorante Tricrómico durante 10 minutos. Colorante“E” de negro de cloruzol. 6) A continuación, en la etapade diferenciación, se agre- 1) Mezclar una gota pequeñadel material obtenido de un gará alcohol etílico al 90%, acidificado con ácido acé- enriquecimiento, con una gota del colorante prepara- tico al l%, durante 3 segundos. do(*). 7)Efectuar dos nuevos cambios con alcohol absoluto y 2) Dejar en cámara húmedapor 24 horas, con cubre, se dejar de 2 a 5 minutos, en etapa de deshidratación. agregaráglicerina fenicaday lutar para su observación 8)Colocar en xi101o tolueno, durante 2 a 5 minutos, en con lentes en seco de 450 x. etapa de clarificación. (*) Mezclaralcoholetílico170ml. alcohol metílico 160 ml, ácido acé- 9) Se deja secar para ser observado al microscopio con ticoglacial20ml,fenollíquido20mi,ácidofosfotúngstico 1%12ml, lente de inmersión a 100 x. La cromatina del núcleo aguadestilada 618mly ColoranteEdeclorazol5g (molido,semadura toma una coloración rojiza, con citoplasma en tono unmes). FiltrarconpapelWhatman número12. verde azulado sobre fondo verde. Paraobtener preparaciones permanentes pasarporalcohol,luegocw bol-xilol,siguiendo porxilol y montaje conPermount. ANEXO No9 Técnicade Baermann ANEXO No6 Se trabaja con materias fecales frescas (sin conservado- Coloraciónde Jionina. res), en las cuales las larvas posean una importante mo- 1) Se coloca sobre un portaobjeto20 microlitros del se- vilidad. Contando con un aparatode Baermann, como se dimento de un enriquecimiento,con 50 microlitros de describe en la figuras, se procede de la siguiente forma: colorante de tionina. 1) El embudo se llena con agua a 4045°C 2) Se cubre con laminilla y se deja 5 minutos para que 2) Sobre el mismo, en una malla metálica se sobreponen actúe el colorante. dos capasde gasa,en contacto con el agua, sin sumer- 3) Observación al microscopio óptico, en seco, a 10 x y girse. 40 x. El citoplasmade los protozoariosse tiñe de color 3) En las gasasse extiende la muestra fecal, que reposa rojo-azulado obteniéndoseuna mejor diferenciación por 3 horas. del elemento parasitarioy sus estructurasinternas. 4)Posteriormente se abre la pinza, recogiéndose en el tubo de fondo cónico 10 ml del agua portadora del se- ANEXO No7 dimento acumulado. Coloración de Ballenger. 5) Se centrifuga el material por 5 minutos a 1500kpm. 1) Se depositan20 microlitros, del sedimento de materia 6) Observar al microscopio el sedimentoen buscade lar- fecal obtenido por método de enriquecimiento, sobre vas (Strongyloides stercoralis). un portaobjeto al que se le agregan50 microlitros del ANEXO N”I0 reactivo de Ballenger (tomadode la superficie del fras- co que lo contiene), cubrir con laminilla. Técnica de detección de microsporidios de Van Gool 2) Observaral microscopio en secoa 40 x. La coloración 1) 0,5 g a 1 g de materia fecal fresca se homogeiniza en es inmediata coloreándoselos quistes y las formas ve- 8 ml de agua destilada y se filtran por medio de una getativas, con citoplasmas de tono rojo y detalles de malla de 300 Pm. las estructurascitoplasmáticascon gran claridad. 2) Método WES (agua-éter-sedimentación) se agregan3 ml de éter a 8 ml de filtrado. Esta mezcla se agita en ANEXO No8 tubo cerrado por un minuto. Coloración Jricrómica. 3) Se centrifuga a 700 g por dos minutos. 1) Se realiza un frotis de materia fecal en portaobjeto y 4) Se diluye el sedimento en 100 a 150 ml de agua des- sin dejar secarlo,se le agregafijador de Schaudin,con tilada. la finalidad de preservar los elementos celulares, de- 5) Una gota (10 a 15 ~1) de la suspensiónse extiende so- jándole por un mínimo de 30 minutos o un máximo de bre 15 mm2 de área. 24 horas. 6) Se colorea con Uvitex 2B y se examina a 1250 x en 2) Se coloca el frotis en etanolal 70 % durante5 minutos. microscopio de fluorescencia. Val. 12 No3 Diciembre 1996 223