Structures des gènes et expression du message génétique chez E.Coli PDF

3- Structures des genes et expression du message génétique chez E.Coli Comment s'exprime le message génétique ? L’ADN porte l’information génétique mais ne peut pas être la matrice de la synthèse protéique En effet la synthèse protéique chez les eucaryotes a lieu dans le cytosol alors que l’AD...

3- Structures des genes et expression du message génétique chez E.Coli Comment s'exprime le message génétique ? L’ADN porte l’information génétique mais ne peut pas être la matrice de la synthèse protéique En effet la synthèse protéique chez les eucaryotes a lieu dans le cytosol alors que l’ADN est dans le noyau Les ARNm font le lien entre l’ADN et les protéines -> Culture de cellules avec de la cytidine radioactive pendant 15 minutes Autoradiographie marquage initiale au niveau du noyaux : lieu de synthèse des ARN Si on cultive les cellules 15 min en présence de cytidine radioactive puis pendant 90 min en présence de cytidine non radioactive Marquage dans le cytoplasmes ! Migration des ARNs du noyau vers le cytoplasme Le Dogme Comment une série de base (séquence ADN) va diriger la production d’ARN et de protéines qui réalisent les fonctions cellulaires et définissent le type cellulaire Une organisation qui a des conséquence fonctionnelles Cell procaryotes Cell eucaryotes - un seul compartiment - compartimentation du noyau et du cytoplasme - la transcription et la - la transcription, et la maturation des ARNm a lieu traduction des ARN en pz a lieu dans le noyau. dans ce cytosol - La traduction des ARN matures en protéines a lieu dans le cytoplasme. - Le transport depuis le noyau jusqu'au cytoplasme est très sélectif : Les pores nucléaires contrôlent l'exportation des seuls ARNm matures (transport actif). - A l'inverse, les ARN polymérases, les histones (protéines synthétisées dans le cytoplasme et localisées dans le noyau) transitent du cytoplasme vers le noyau A- La transcription La transcription est très semblable à la réplication de l’ADN : Les 2 mécanismes impliquent des enzymes qui synthétisent un brin d’acide nucléique complémentaire d’une matrice d’ADN Catalysée par UNE seule enzyme (chez les bactéries) = RNA polymérase : activité Polymérasique 5’-3’ Copie le brin matrice en ARN Pour la synthèse elle a besoin des 4 rNTP : UTP, ATP, GTP, CTP et d’ions Mg2+ Transcription : différences avec la réplication Un seul des brins d’ADN est copié = le brin matrice l'ARN nouvellemnt synthétisé ne reste pas apparié : plusieurs ARN pol peuvent donc agir en même temps en se suivant les une après les autres L'ARN polymérase n'a pas besoin d'aorce : Elle initie la transcription "de nov" Seules certaines régions du génome sont transcrites : des ragions spécifiques déterminent l'initiation et la terminaison de la transcription L'initiation se fait au niv des promoteurs La polymérase se déplace le long de celui-ci et débute la transcription au site +1 Elle s'arrête au niv de certaines régions = terminateurs 1- L'ARN polymérase d'E.Coli Composées de 6 sous-unités : complexe d’environ 500kDa Le cœur de l’enzyme ARN polymérase = α2ββ’ω Enzyme minimale capable de synthétiser de l’ARN : In vitro elle peut en principe initier la transcription à n’importe quel endroit du génome Or la transcription ne s’effectue qu’au niveau de certaines régions spécifiques du génome ? Enzyme cœur vs Holoenzyme ! L’addition du facteur sigma s : Formation de l’holoenzyme α2ββ’ω σ permet la reconnaissance des régions promotrices Plusieurs facteurs s différents (mécanisme de régulation) Le facteur s prédominant = s70 Les promoteurs reconnus par les ARN polymérases contenant s70 ont tous les mêmes caractéristiques 2- Structure du gène procaryote 3- Structure type d'un promoteur d'E.Coli reconnu par le facteur sigma 70 L'expression de certains gènes est régulée par d'autres facteurs : protéines régulatrices = activateurs ou répresseurs Ils se fixent sur des séqeunces d'ADN = opérateur voisinage promoteur -80/+20 4- Les étapes de la transcription 3 étapes : Initiation de la synthèse d'ARN Elongation du brin d'ARN naissant Terminaison 1- L'initiation Reconnaissance du promoteur par sigma et fixation de l'ARN pol sur une région -55 à +20 Complexe binaire fermé Holoenzyme/ADN fermé réversible Changement de conformation de l'ARN pol, ouverture des brins Bulle de transcription, complexe binaire ouvert stable Brin du promoteur séparés, ouverture au niv de PB riche en A et T Plusieurs tentatives d'initiation avortées Libération de courts transcrits de 9nt ou moins Jusqu'à synthèse d'un ARN d'environ 10nuc : seuil : passage à l'étape l'élongation -> Quand Succès du démarrage de la transcription (ARN 10nt) la polymerase doit commencer à avancer dissociation du facteur sigma l'enzyme cœur peut avancer 2- L'élongation A 37° l'élongation se poursuit au rythme de 40 nucléotides/seconde, l’enzyme cœur se déplaçant sur la molécule d’ADN. ! complexe ternaire ouvert : DNA + RNA + enzyme cœur. Pendant toute la transcription, une dizaine de nucléotide restent hybridés à l’ADN Dimère NusA se fixer sur l’enzyme cœur Rôle dans la processivité de l’élongation Et la terminaison Plus tard 3 protéines additionnelles Nus B, E et G se joindront au complexe transcriptionnelle : rôle dans la terminaison 3- La Terminaison La transcription s’arrête toujours au même nucléotide = au même endroit du gène Au niveau de séquences nucléotidiques spécifiques appelées terminateurs. Dissociation du complexe transcriptionnel. Il existe 2 types de terminateurs selon qu’ils nécessitent la présence d’une protéine additionnelle : la protéine Rho. -> Terminateurs Rho indépendants : Arrêt de la transcription quand l’ARN polymérase atteint le Terminateur (en aval de la séquence codante) -> Terminateurs Rho dépendants : Intervention de la protéine Rho a- La terminaison Rho indépendante Terminateurs Rho indépendants composées de : 1. Séquences d'ADN palindromiques riches en paires G-C (3 liaisons hydrogènes fortes) à 20-30 bases du point de terminaison 2. une séquence riche en A conduit à la formation d'un hybride ADN - ARN peu stable (2 liaisons hydrogènes) ce qui permet le décrochage de l'ARN b- La Terminaison Rho dépendante Intervention d'une protéine : Rho = hexamère à activité ATPasique : ATPase RNA dépendante s’attache à un site sur l’ARN = rut (Rho utilization site) Site optimal : 40 nucléotides environ qui ne forment pas de structure secondaire (restent simple brin) riche en résidus C situé après le stop (le dernier dans le cas d’un opéron) car Rho ne se fixe qu’à de l’ARN dépourvu de ribosomes  Suivit de séquences palindromiques (structures secondaires) (pas de seq riche en T) -> Rho rattrape l’ARN pol lorsqu’elle marque un arrêt à cause des structures secondaire -> Dissociation B- La Traduction ! La traduction est irréversible -> pas de transfert d'information génétique à partir de protéine Les Prions  Défi plus important que la réplication et la transcription pour les chercheurs Pas ou peu d’affinité des AA pour les nucléotides Hypothèse dès 1955 : molécules adaptatrices capables de reconnaitre les codons doivent exister Il fut démontré en 1957 qu’avant leur incorporation dans les protéines, les AA étaient attachés à une classe d’ARN = 15% de l’ARN cellulaire total = ARNt (ARN de transfert) -> Composants principaux de la traduction : ARNm ARNt Aminoacyl-ARNt synthètase Ribosome 1- ARNm - Cadre de lecture et code génétique La machinerie de traduction ne décode qu’une partie de chaque ARNm en polypeptide  Région codante = ORF (Open Reading Frame) = phase ouverte de lecture composée d’une succession non chevauchante de codon (triplet de nucléotides) ! 1 ORF : 1 polypeptide La traduction démarre en 5’ de l’ORF : codon initiateur : Codon START 5’-AUG-3’ le plus souvent (GUG ou UUG retrouvé dans certaines ORF bactériennes) Spécifie le 1er acide aminé Défini le cadre de lecture pour tous les codons suivants La traduction se termine en 3’ de l’ORF : codon STOP : terminaison de la synthèse protéique Code génétique : correspondance entre les triplets de nucléotides de l’ARN = Codon et les acides aminés. 64 codons (43) 20 Acides Aminés constituent les protéines -> 61 codons codent pour 20 AA -> 3 codons = STOP (UAA, UAG, UGA) : terminaison traduction Plusieurs codons pour presque tous les acides aminés (sauf MET et TRP) : Le code génétique est dégénéré (dégénérescence porte sur la 3eme base du codon = spécificité réduite de la 3eme base) 2- Les ARNT (tRNA) Sont au cœur de la synthèse Adaptateurs entre les codons et les Acides Aminés (AA) Vont donc permettre le décodage de la séquence de l’ARNm qui repose sur l’hybridation spécifique codon (ARNm) / anticodon (ARNt) -> Plusieurs types mais caractéristiques communes : Possèdent une structure secondaire en feuille de trèfle du fait de la présence de région d’auto-complémentation Attachés à un AA spécifique Reconnait 1 codon particulier Possèdent tous la même séquence en 3’ = 5’-CCA-3’ = site de liaison de l’AA Il existe plusieurs codons pour 1 même AA (dégénérescence code) :  Il existe donc plusieurs tRNA pour 1 même AA = tRNA isoaccepteurs fixent le même AA Présentent un anticodon différent LES ARNt ISOACCEPTEURS 3- Les AminoAcyl-ARNt Synthétases - Attachement des AA aux ARNt Les ARNt sont chargés par l’attachement d’un AA à l’adénosine de l’extrémité 3’ par une liaison Acyle riche en énergie Les Aminoacyl-ARNt synthétases sont les enzymes qui chargent chaque AA sur le tRNA correspondant. Dans la plupart des organismes il y en a 20 (car 20 AA) Chacune reconnaît un seul AA tous les tRNA sur lesquels cet AA peut se placer (dégénérescence du code génétique) Chargement des acides aminés sur les ARNt = Acyclation 2 étapes : 1. L’activation de l’Acide Aminé = l’Adénylylation des AA 2. Le chargement de l’ARNt = le Transfert de l’AA sur l’ARNt 4- Mutation non sens et souches suppressives Il existe des souches bactériennes mutantes dites souches suppressives : Mutation sur un tRNA au niveau de l’anticodon : complémentarité avec un codon stop : ! Ce codon stop n’est plus dans ces souches un codon stop. Les codons STOP: UAA (Ochre) UAG (Ambre) UGA (Opale) Example Souche AMBRE dans laquelle Codon stop UAG sera traduit en tyrosine : Traduction non stoppée : protéine complète  Dans cette bactérie, tous les UAG sont traduits en tyrosine. Si le stop naturel était un UAG la protéine sera plus longue que la protéine sauvage. La traduction s’arrêtera avec un codon stop UAA ou UGA dans le cadre de lecture. La protéine sera-t-elle fonctionnelle ? Certaines protéines sont potentiellement plus longue, cependant de telles bactéries existent, donc la protéine est suffisamment fonctionnelle pour permettre la survie des bactéries Exploitation de cette mutation en laboratoire pour exprimer certaines protéines d’intérêt sans risque de propagation dans les bactéries de l’environnement Mutation le mRNA de la protéine à étudier: modification non sens : un codon de terminaison apparaît prématurément dans l’ORF : Arrêt traduction : protéine  le stop UAG est traduit en Tyr La protéine sera possiblement modifiée mais néanmoins potentiellement active et étudiable 5- Le ribosome et son recrutement Machinerie Moléculaire qui dirige la synthèse protéique Beaucoup plus complexe que ADN ou ARN polymérase Composé d’au moins 3 molécules d’ARN et de plus de 50 protéines différentes MW totale de plus de 2,5 mégadaltons Vitesse : 2 à 20 AA / seconde (200-1000 nt /sec pour la réplication)  Pour qu’il y ait traduction il faut que le ribosome soit recruté sur l’ARNm au bon endroit ! Pour cela il y a une courte séquence de 3 à 9 nucléotides en amont du codon START = Site de liaison des ribosomes = Ribosome Binding Site (RBS) = Séquence SD (Shine Dalgarno Séquence SD 5’-AGGAGGU-3’ Complémentaire d’une séquence de l’ARNr 16s composant de la petite sous-unité du ribosome Permet donc d’apparier le Ribosome et le début de l’ORF Le niveau de complémentarité et la distance de cette séquence / codon initiateur influence le taux de traduction 6- Mécanismes 1- L'initiation 3 Evénements sont nécessaires à l'initiation de la traduction : Recrutement du ribosome sur l’ARNm L’ARNt initiateur chargé doit être positionné dans le site P du ribosome Le ribosome doit être placé de manière précise sur le codon initiateur (critique pour le cadre de lecture) En plus des acteurs précédents 3 facteurs interviennent : IF : Initiation Factor Liaison IF3 / SU-30s : modification conformationnelle de la sous-unité qui devient : Incapable de se lier à la grande su ribosomale  Capable de se lier à l’ARNm Liaison IF3-SU-30s/mRNA NB : IF3 n’intervient pas dans la reconnaissance de l’ARNm : rôle ARNr16s le RBS étant idéalement situé sur l’ARNm : positionnement de la petite sous-unité idéal pour le positionnement du codon initiateur au site P du ribosome Recrutement d’un ARNt particulier : ARNt initiateur : s’apparie avec codon initiateur. Chargé avec une forme modifiée de la méthionine = N-formylméthionine = fMet IF2 Se lie spécifiquement à un f-met-tRNA et l’apporte au complexe IF3/SU 30S/mRNA Installation de l’anticodon UAC face au codon IF1 liaison Site A et IF2 : stabilisation du complexe IF2 a une activité GTPase ribosome dépendante.  IF2 n’est probablement pas une GTPase, mais il active une protéine ribosomale qui a cette fonction. ! Quand la SU 50S se joint à 30S pour donner 70S : Consommation d’énergie : GTP - > GDP + Pi ! Recrutement de la grande sous-unité, libération des facteurs d'initiation et hydrolyse du GTP -> Recrutement de la grande sous-unité, libération des facteurs d’initiation et hydrolyse du GTP  NB sur la fMet (N-formyl-Méthionine) Les codons initiateurs AUG GUG…sont reconnus par l’ARNt initiateur Premier AA de toutes les protéines procaryotes ? NON Déformylase enlèvent les groupes formyl En fait nombreuses protéines procaryotes n’ont même pas de Met en N-ter (extrémité amine) : les Aminopeptidases enlèvent souvent la Met voir 1 ou deux AA en plus !! 2- L'élongation = La synthèse peptidique Elle peut commencer une fois le ribosome assemblé sur l’ARNm et l’ARNt initiateur présent au site P 3 évènements clés : Arrivée d’un ARNt-AA au site A en concordance avec le codon Liaison peptidique entre aminoacyl-ARNt et la chaine peptitique attaché au peptidyl- ARNt du site P (N-formylméthionine –ARNt après l’initiation) Translocation vers le site P -> 3 facteurs protéiques nécessaires : EF : Elongation factors EF Tu : escorte les aminoacyl-ARNt jusqu’au site A, fixe et hydrolyse le GTP EF Ts : facteur d’échange du GTP : recharge EF Tu en GTP EF G : se lie au ribosome et permet la translocation 3- Inhibiteur de la synthèse protéique : ex de la puromycine 4- La Terminaison Site A : codon stop UAA, UAG, UGA pas de tRNA avec un anticodon correspondant aux codons stop. codon reconnu par une protéine RF RF release factor : facteurs de terminaison RF1 reconnaît UAA ou UAG RF2 reconnaît UAA ou UGA RF3 permet la libération des facteurs RF1 et RF2 -> Agissent si le site P est occupé par un tRNA portant une protéine (= un peptidyl-tRNA) -> Relargage : polypeptide, dernier tRNA, mRNA, 30S, 50S (GTP -> GDP +Pi) 7- Transcription et traduction sont quasi simultanées chez E.Coli Cell procaryotes un seul compartiment. La transcription et la traduction des ARN en protéines a lieu dans ce cytosol. ! Conséquence fonctionnelle : Traduction et Transcription sont quasi simultanée