2023-2024 Klinische Biologie Labcluster Cursus (PDF)

Labcluster Klinische Biologie 2 en 3 MLT Facet Hematologie Opleiding: Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie - afstudeerrichting Medische laboratoriumtechnologie Academiejaar: 2023-2024 Ann Appels - Anne-Mie Feyens [email protected] - [email protected] T +32 3 220 55 80 Inhoud Inhou...

Labcluster Klinische Biologie 2 en 3 MLT Facet Hematologie Opleiding: Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie - afstudeerrichting Medische laboratoriumtechnologie Academiejaar: 2023-2024 Ann Appels - Anne-Mie Feyens [email protected] - [email protected] T +32 3 220 55 80 Inhoud Inhoud........................................................................................................................ 1 Inleiding...................................................................................................................... 1 1 Algemeen............................................................................................................. 1 2 Leerdoelen............................................................................................................ 2 3 Bloedafnames....................................................................................................... 3 3.1 Veneuze bloedafname (venapunctie)............................................................ 3 3.1.1 Afnamevolgorde...................................................................................... 4 3.1.2 Uitvoering................................................................................................ 5 3.1.3 Naalden voor bloedafname..................................................................... 5 3.2 Capillaire bloedafname.................................................................................. 6 3.3 Rol van bloedafname in het hele proces van het bloedonderzoek................ 6 3.4 Praktische uitvoering lab: Pre analytische fase (2 MLT)................................ 7 Hemostase................................................................................................................. 8 4 Inleiding................................................................................................................ 8 4.1 Laboratoriumonderzoek van trombocyten: Primaire hemostase................. 10 4.1.1 Bloedingstijd.......................................................................................... 10 4.1.2 Trombocytentelling................................................................................ 12 4.2 Laboratoriumonderzoek van bloedstolling: secundaire hemostase............. 12 4.2.1 Aandachtspunten bij stollingstesten...................................................... 12 4.2.2 Meetprincipe stollingstesten.................................................................. 13 4.2.3 APTT= geactiveerde partiële tromboplastinetijd................................... 13 4.2.4 PTT= protrombinetijd............................................................................ 15 4.2.5 Fibrinogeen........................................................................................... 18 4.3 Opdracht lab: Secundaire hemostase (2 MLT)............................................ 20 4.4 Uitbreidingsstof: Laboratoriumonderzoek bij trombose................................ 21 4.4.1 D-dimeerbepaling.................................................................................. 21 Cytologie................................................................................................................... 23 5 Leukocyten......................................................................................................... 24 5.1 Afwijkingen in het cytoplasma van granulocyten......................................... 26 5.1.1 Toxische korreling................................................................................. 26 5.1.2 Döhle bodies......................................................................................... 26 5.1.3 Vacuolen............................................................................................... 26 @AP Hogeschool  5.1.4 Hypogranulatie...................................................................................... 27 5.1.5 Auerstaafjes.......................................................................................... 27 5.1.6 Malariapigment..................................................................................... 27 5.2 Kernafwijkingen van granulocyten............................................................... 28 5.2.1 Pelger-Huët........................................................................................... 28 5.2.2 Pseudo Pelger-Huët.............................................................................. 28 5.2.3 Hypersegmentatie................................................................................. 29 5.2.4 Linksverschuiving.................................................................................. 29 5.3 Afwijkingen van lymfocyten......................................................................... 29 5.3.1 Geactiveerde of gestimuleerde lymfocyt (reactieve lymfocyt)............... 29 5.3.2 Plasmacel............................................................................................. 30 5.3.3 Gümprechtse schaduwen/schollen....................................................... 30 5.4 Maligne lymfomen....................................................................................... 31 5.4.1 Lymfocyten met gekliefde kern............................................................. 31 5.4.2 Burkitt lymfoomcellen............................................................................ 31 5.4.3 Hairy-cells............................................................................................. 31 5.4.4 Sezary-cellen........................................................................................ 32 6 Erytrocyten......................................................................................................... 33 6.1 Afwijkingen in grootte.................................................................................. 33 6.2 Afwijkingen in kleur...................................................................................... 35 6.3 Afwijkingen in vorm...................................................................................... 35 6.4 Afwijkingen door insluitsels in erytrocyten................................................... 36 6.5 Andere afwijkingen...................................................................................... 37 6.6 Kwantificering morfologische afwijkingen van erytrocyten/leukocyten......... 38 7 Trombocyten....................................................................................................... 39 7.1 Afwijkingen aantal, grootte of granulatie...................................................... 39 7.2 Artefacten.................................................................................................... 39 8 Referentiewaarden Hematologie:....................................................................... 40 9 Praktische uitvoering lab: cytologie (2 en 3 MLT)............................................... 41 10 Voorlopercellen............................................................................................... 42 10.1 Voorlopers van de witte reeks.................................................................. 42 10.1.1 Blasten van de witte reeks.................................................................... 42 10.1.2 Voorlopers van de myeloïde reeks........................................................ 43 10.2 Voorlopers van de rode reeks.................................................................. 45 10.3 Voorlopers van de trombocyten............................................................... 46 @AP Hogeschool  10.4 Maligniteiten............................................................................................. 46 10.4.1 Myeloïde leukemie................................................................................ 46 10.4.2 Lymfatische leukemie........................................................................... 48 Immuunhematologie................................................................................................. 50 11 Bloedgroepen................................................................................................. 51 11.1 Enkele basisbegrippen............................................................................. 51 11.2 Bloedgroepantistoffen.............................................................................. 52 11.3 Klinisch belang......................................................................................... 53 11.4 Bloedgroepensystemen............................................................................ 55 11.4.1 Het ABO-bloedgroepensysteem........................................................... 55 11.4.2 Het rhesus-bloedgroepensysteem........................................................ 56 11.4.3 Andere bloedgroepsystemen................................................................ 57 11.5 De bloedgroepbepaling in het labo........................................................... 57 11.6 Problemen bij de bloedgroepbepaling...................................................... 58 11.7 Praktische uitvoering lab: ABO-bloedgroepbepaling (2MLT).................... 60 11.8 Praktische uitvoering lab: Rhesus-fenotypering (2 MLT).......................... 63 12 Bloedgroepantistoffen..................................................................................... 65 12.1 De antiglobulinetest.................................................................................. 66 12.1.1 Directe antiglobulinetest........................................................................ 66 12.1.2 Indirecte antiglobulinetest..................................................................... 66 12.1.3 Praktische uitvoering Lab: DAT (2 en 3 MLT)....................................... 67 12.1.4 Praktische uitvoering lab: IAT ( 3 MLT)................................................. 68 12.2 Bepaling van de specificiteit van antistoffen............................................. 70 12.3 Het compatibiliteitsonderzoek.................................................................. 72 12.3.1 Basis van het compatibiliteitsonderzoek............................................... 72 12.3.2 Type and Screen................................................................................... 74 13 Zwangerschap en geboorte............................................................................ 75 13.1 Hemolytische ziekte van de pasgeborene................................................ 75 13.2 Foetale cellen........................................................................................... 75 13.2.1 Praktische uitvoering lab: Foetale cellen (2MLT)................................. 76 13.3 Rhesus-D-antagonisme............................................................................ 76 13.4 ABO-antagonisme.................................................................................... 77 13.5 Antagonisme door een andere antistof..................................................... 77 13.6 Analysen bij verdenking op HDN.............................................................. 77 13.7 Praktische uitvoering lab: Bloedgroepen / DAT (2 MLT).......................... 78 @AP Hogeschool  13.8 Opdracht lab Imuunhematologie (2MLT).................................................. 78 Lijst met afbeeldingen............................................................................................... 80 Literatuur.................................................................................................................. 82 @AP Hogeschool  Inleiding 1 Algemeen Tijdens de practica Labcluster Klinische biologie 1 hebben jullie kennis gemaakt met basisbegrippen en basishandelingen zoals vingerprik, bloeduitstrijkjes, hemometrische waarden en het bepalen van leukocyten en reticulocyten. In het domein cytologie leerden jullie normale leukocyten microscopisch en digitaal beoordelen. Jullie maakten reeds kennis met afwijkingen in vorm, kleur en grootte van erytrocyten en met de insluitsels die erin kunnen voorkomen. In het domein immuunhematologie leerden jullie bloedgroepen bepalen met de slidemethode. De inhoud van het OLOD Labcluster Klinische biologie 1 is geen afgesloten hoofdstuk. In deze cursus wordt er verder gebouwd op de kennis uit het eerste jaar en jullie kunnen nog steeds de digitapcursus van het eerste jaar gebruiken om te oefenen. Het wordt zelfs ten sterkste aangeraden om dit te blijven doen. Cytologie wordt in de cursus van het tweede jaar uitgebreid met abnormale leukocyten. In het domein Immuunhematologie gaat men verder met bloedgroepbepalingen met de geltechnieken en worden de bepalingen met betrekking tot zwangerschapsproblematiek besproken en aangeleerd. Ook Hemostase komt in deze practica uitgebreid aan bod. Gezien bloedafname ook tot de taak van een medisch laboratoriumtechnoloog behoort, leren jullie in deze practica prikken op een kunstarm. In de digitapcursus ‘Labcluster Klinische biologie 2 vinden jullie bij het facet ‘Hematologie’ alle informatie over toetsing en inhoud van de verschillende lesweken. Heb je nog vragen, dan kan je terecht in het forum op digitap of tijdens de practica. Ook in het derde jaar blijft hematologie een hoofdvak binnen de opleiding MLT. De praktijk zit vervat in het OLOD ’Labcluster Klinische biologie 3’. We bouwen verder op de 2 voorgaande jaren en breiden jullie skills uit. Cytologie gaat vooral dieper in op de abnormale cellen en de ziektebeelden die hieraan verbonden zijn. Immuunhematologie spitst zich toe op het uitvoeren van bloedgroepen en kruisproeven, met speciale aandacht voor kruisproefproblemen en irreguliere antistoffen en hun identificatie. Ook in het derde jaar vinden jullie veel info in de digitapcursus ‘Labcluster Klinische biologie 3, facet Hematologie’ maar zijn jullie tevens steeds welkom met vragen tijdens de practica. De leerstof onder de titels in blauw is alleen voor 3 MLT. @AP Hogeschool p 1 / 82 2 Leerdoelen De leerdoelen 2 MLT binnen deze cursus zijn: Taakanalyse en planning laboratoriumwerkzaamheden Bereidt praktijksessies voor van hematologische experimenten Beschrijft en interpreteert hematologische testen (ABO, Rhesus, Coombs, foetale cellen), inclusief zwangerschapsproblematiek Uitvoering laboratoriumwerkzaamheden Voert hematologische testen uit (ABO, Rhesus, Coombs, foetale cellen) Voert bloedafnames op een kunstarm uit en houdt hierbij rekening met de pre- analytische condities Voert routinestolling uit Verwerken en interpreteren Berekent foetale cellen in het kader van zwangerschapsproblematiek Interpreteert routinestolling Identificeert abnormale, niet maligne leukocyten, abnormale erytrocyten Rapporteren Rapporteert helder en correct, gebruik makend van de gepaste biomedische vakterminologie Verwerkt resultaten in een wetenschappelijk verslag Formuleert principes, werkwijzen en interpretaties van het labwerk Kwaliteit en veiligheid Handelt volgens de voorgeschreven hematologische veiligheids- en afvalverwerkingsvoorschriften De leerdoelen 3 MLT binnen deze cursus zijn: Uitvoering laboratoriumwerkzaamheden Voert immuunhematologische testen uit: ABO- en Rhesusbloedgroepen, directe en indirecte Coombs, kruisproeven. Identificeert de verschillende soorten cellen in bloeduitstrijken in diverse kleuringen. Telt formules en beoordeelt het bloedbeeld. Verwerken en interpreteren Verwerkt en interpreteert de resultaten van de uitgevoerde laboratoriumwerkzaamheden. Identificeert irreguliere antistoffen aan de hand van resultaten van verschillende identificatiepanels. Kwaliteit en veiligheid Handelt volgens de voorgeschreven hematologische veiligheids- en afvalverwerkingsvoorschriften @AP Hogeschool p 2 / 82  3 Bloedafnames Het bloed bevindt zich binnen de bloedvaten en bereikt zo alle delen van het lichaam. Wanneer het bloed buiten de bloedvaten terecht komt bijvoorbeeld bij beschadiging van de vaatwand, gaat het stollen door een natuurlijk proces dat we Hemostase noemen. Bij bloedafnames wordt dit voorkomen door het bloed op te vangen in buisjes waarin zich anticoagulantia (stollingsremmende stoffen) bevinden. De verschillende soorten anticoagulantia en hun werking werden besproken tijdens de hoorcolleges Hematologie 1. Men verkrijgt een suspensie van cellen in plasma. Gebruikt men buisjes zonder anticoagulantia dan treedt er dus stolling in het buisje op en ontstaat er een onoplosbaar netwerk van fibrine waarin de meeste bloedcellen worden gebonden. Het waterige gedeelte van gestold bloed noemt men serum. Het serum is dus bloedplasma zonder stollingseiwitten zoals fibrinogeen. Het mechanisme van stolling wordt verderop in deze cursus besproken. 3.1 Veneuze bloedafname (venapunctie) Bloed uit de venen is het meest geschikt voor hematologisch onderzoek en afname gebeurt voornamelijk t.h.v. de elleboogplooi in de voorarm, waar enkele subcutane venen doorgaans zichtbaar zijn. (vena cephalica, vena basilica). Ook t.h.v. de bovenzijde van de hand zijn veneuze bloedafnames mogelijk. Deze bloedafnames mogen uitgevoerd worden door een medisch laboratoriumtechnoloog. Figuur 1: punctieplaatsen veneuze bloedafname (Sarstedt: Tips & technieken in de pre-analyse) Vroeger werden bloedafnames uitgevoerd met een ‘spuit+naald’-systeem, waarbij het bloed werd afgenomen met een spuit en men nadien het bloed verdeelde over verschillende afnamebuisjes naargelang het soort aangevraagde analyses. Dit ‘open’ systeem wordt als onvoldoende hygiënisch beschouwd en wordt nog zelden gebruikt. Tegenwoordig maakt men gebruik van vacuümbuizen die een nauwkeurig bepaald vacuüm hebben, waardoor steeds een juiste verhouding tussen bloed en anticoagulans wordt verkregen. De naalden die gebruikt worden hebben aan beide @AP Hogeschool p 3 / 82  zijden een puntig uiteinde (waarover zich aan één zijde een rubbertje bevindt). De naald wordt in een huls gedraaid. Het uiteinde dat uit de huls steekt, wordt in de ader gebracht, aan de kant waar zich het rubbertje bevindt plaatst men de vacuümbuis. Omdat deze zijde van de naald voorzien is van een afdichting (namelijk het rubbertje), kan men verschillende buizen na elkaar vullen zonder dat het bloed uit de naald begint te druppelen. Figuur 2: voorbeeld vacuümsysteem 3.1.1 Afnamevolgorde In het verleden werd er een strikte volgorde aangehouden waarin de buizen werden afgenomen. Recente studies hebben echter aangetoond dat er met de moderne bloedafnamesystemen weinig overdracht van anticoagulantia (via de dop) van de ene buis op de andere buis plaatsvindt. Onderstaande volgorde is dus een advies zodat ook bij mensen waar de bloedafname moeilijk verloopt, overdracht vermeden wordt. Wordt er ook een hemocultuur (bloedkweek) aangevraagd, dan neemt men deze als eerste af waarbij men steeds de aerobe fles vult en vervolgens de anaerobe. Figuur 3: aanbevolen afnamevolgorde (www.labomaenhout.be) @AP Hogeschool p 4 / 82 3.1.2 Uitvoering Figuur 4: veneuze bloedafname 1. Handen desinfecteren, eventueel handschoenen dragen. 2. Stuwband rond de bovenarm van de patiënt brengen. Hierdoor zwellen de aders en worden ze beter zichtbaar, een vuist laten maken versterkt dit effect. 3. Aders beoordelen en een keuze maken. 4. Punctieplaats desinfecteren met bv. een 70% ethanoloplossing. 5. Prikken met de naald die in een scherpe hoek t.o.v. de huid en de wand van het bloedvat wordt gehouden (30°), geslepen kant van de naald naar boven. 6. Bij bloedstroom stuwband losmaken, vuist ontspannen. 7. Gevulde buis verwijderen en vervangen door volgende, waarbij de eerste buis een aantal keer wordt gekanteld om bloed en anticoagulans voldoende te mengen (behalve de serumbuis om hemolyse te vermijden). 8. Prikplaats afdekken met gaasje en naald terugtrekken. 9. De naald in de daarvoor geschikte afvalcontainer gooien. 10. Wondje dichtdrukken tot er geen bloed meer uitstroomt. 11. Eventueel afdekken met pleister. 3.1.3 Naalden voor bloedafname Dikte van de naalden wordt opgegeven in gauge. Hoe hoger de waarde, hoe dunner de naald e.o. 18G : 1.2 mm ( bloedgever) 20G : 0.9 mm ( bij normale venen, volwassenen) 21G : 0.8 mm ( idem) 22G : 0.7 mm ( kleine venen, kinderen) @AP Hogeschool p 5 / 82 3.2 Capillaire bloedafname Figuur 5: prikplaatsen bij capillaire bloedafname (Sarstedt: Tips & technieken in de pre-analyse) Een vingerprik werd reeds in Labcluster Klinische biologie 1 aangeleerd. Bij volwassenen wordt deze techniek aangewend voor o.a. glucosebepalingen bij Diabetes. Een hielprik, in de zijkant van de voetzool is aangewezen bij neonaten. Bij pasgeborenen wordt deze techniek toegepast bij het screenen op metabole aandoeningen. Een prik in de oorlel werd vroeger gebruikt bij de bepaling van de bloedingstijd volgens Duke en wordt verder in deze cursus besproken bij de primaire hemostase. 3.3 Rol van bloedafname in het hele proces van het bloedonderzoek In Labcluster Klinische Biologie 1 hebben jullie tijdens het werkcollege uitgebreid kennis gemaakt met de verschillende fasen ‘Van aanvraag tot uitslag’: 1. Pre-analytische fase 2. Analytische fase 3. Post-analytische fase De bloedafname behoort tot de pre-analytische fase en vormt misschien wel de belangrijkste schakel in het hele proces. Pre-analytische effecten van de bloedafname kunnen een grote invloed hebben op de uitslag van een bepaling. Mogelijke pre-analytische effecten bij bloedafnames: 1. Tijdstip van de dag 2. Houding van de patiënt tijdens bloedafname heeft invloed op de verhouding plasma en cellen, we nemen bij voorkeur bloed af bij een liggende patiënt. 3. Langdurig stuwen of traag in de buis stromen van bloed geeft activatie van het stollingssysteem, langdurig stuwen veroorzaakt eveneens hemolyse 4. Verkeerde naalddikte: een te dunne naald veroorzaakt hemolyse 5. Onvoldoende gevulde buisjes (of teveel gevulde buisjes): juiste verhouding anticoagulans/bloed is bij stollingstesten zeer belangrijk 6. Verkeerde identificatie @AP Hogeschool p 6 / 82 3.4 Praktische uitvoering lab: Pre analytische fase (2 MLT) Veneuze bloedafname op de kunstarm en plaatsen van een infuus Capillaire bloedafname: bloedingstijd bepalen volgens Duke (zie primaire hemostase) @AP Hogeschool p 7 / 82  Hemostase 4 Inleiding Hemostase is een geheel van processen dat ervoor zorgt dat bij vaatwandbeschadiging het lek wordt gedicht zodat bloedverlies tot een minimum beperkt blijft. Hierbij is er een samenwerking tussen trombocyten, stollingsfactoren en componenten uit de vaatwand. Naast hemostase is er in ons lichaam eveneens een mechanisme aanwezig die de gevormde prop weer opruimt nadat de wonde is geheeld, de fibrinolyse. Beide processen zijn nauwkeurig op elkaar afgestemd. Het stollingsmechanisme bestaat uit een primaire en een secundaire hemostase. De primaire hemostase vindt plaats in de vaatwand daar waar het endotheel beschadigd is. De bloedplaatsjes gaan adheren aan het subendotheel van de vaatwand en gaan onderling adheren om een stolselprop te vormen. Figuur 6: primaire hemostase (https://mhemo.fr/wp-content/uploads/2019/04/H%C3%A9mostase-promaire.jpg) De secundaire hemostase speelt zich af in en rond de gevormde plaatjesprop. Verschillende stollingsfactoren gaan een cascade aan reacties uitlokken om een fibrinenetwerk op te bouwen die de plaatjesprop verstevigt. @AP Hogeschool p 8 / 82 De oude stollingscascade gaat uit van twee verschillende vertrekpunten om tot een gemeenschappelijk doel te komen, nl. de omzetting van fibrinogeen in fibrine. Figuur 7: oude stollingscascade (Frederic H. Martini e.a.) In de nieuwe stollingscascade is er slechts één vertrekpunt namelijk het vrijkomen van weefselfactor (tissuefactor). Figuur 8: nieuwe stollingscascade @AP Hogeschool p 9 / 82  In het fibrinolytisch systeem wordt fibrine opnieuw afgebroken door plasmine. Tenslotte zijn er ook natuurlijke anticoagulantia aanwezig in het bloed zoals Proteïne C, Proteïne S en Antitrombine III die bepaalde stollingsfactoren kunnen inhiberen. Figuur 9: hemostatische balans Volgende fysiologische mechanismen vinden dus plaats bij stolling en antistolling: 1. plaatjespropvorming door de trombocyten 2. fibrinevorming door de stollingsfactoren 3. fibrine afbraak door het plasmine 4. anticoagulatie door antitrombine III, proteïne C, proteïne S In de hoorcolleges Hematologie 2 en 3MLT wordt dit systeem van hemostase en fibrinolyse uitgebreid besproken. 4.1 Laboratoriumonderzoek van trombocyten: Primaire hemostase 4.1.1 Bloedingstijd De bloedingstijd is de tijd die nodig is om een prop van plaatsjes te maken. In het verleden werd deze uitgevoerd volgens de methode van Duke aan het oor (vinger) of volgens de methode van Ivy in de onderarm. Met een steriele stilet wordt in de oorlel geprikt (Duke) zodat er een spontane bloeding optreedt Op hetzelfde ogenblik wordt de chronometer gestart Bloed afdeppen om de 15 seconden met een filtreerpapiertje tot stolling zonder de oorlel aan te raken Dit is de waarde van de bloedingstijd Referentiewaarden: 1 – 4 minuten @AP Hogeschool p 10 / 82 https://www.youtube.com/watch?v=bMVy6pCWhRk Tegenwoordig worden deze methodes vervangen door een bepaling van de sluitingstijd op een PFA-toestel ( platelet function analyser). Adhesie, secretie en aggregatie worden nagebootst in dit toestel. Figuur 10: PFA toestel Bloed wordt opgezogen en met een bepaalde snelheid door de geperforeerde membraan gestuurd. Deze membraan is gecoat met collageen-ADP of met collageen-epinefrine (adrenaline) waardoor de bloedplaatjes in het volbloed worden geactiveerd en deze gaan aggregeren waardoor de membraan volledig wordt afgesloten. (ten Boekel Dr. E. e.a). Figuur 11: werking PFA toestel (ten Boekel Dr. E. e.a) De sluitingstijd is de tijd die nodig is om het membraan volledig af te sluiten. De bloedingstijd is verlaagd bij: Trombopenie (< 100.000 / µl) door verlaagde productie @AP Hogeschool p 11 / 82  Kwalitatieve stoornissen (bv. Bernard-Soulier) Anti-aggregatie door medicatie (bv. aspirine) Bloedvaatwandstoornissen Daling of afwezigheid van VWF 4.1.2 Trombocytentelling De telling van de trombocyten gebeurt op een EDTA-tube in de celanalyzer. 4.2 Laboratoriumonderzoek van bloedstolling: secundaire hemostase In het laboratorium wordt er onderscheid gemaakt tussen de extrinsieke en de intrinsieke bloedstolling. Wanneer aan citraatplasma weefseltromboplastine wordt toegevoegd wordt de extrinsieke stolweg gestart. Wanneer citraatplasma in contact komt met een negatief geladen oppervlak zoals glas of Kaoline wordt factor XII geactiveerd. Dit is de start van de intrinsieke weg. Figuur 12: stollingstesten van intrinsieke en extrinsieke weg (ten Boekel Dr. E. e.a) 4.2.1 Aandachtspunten bij stollingstesten Een juiste bloedafname is zeer belangrijk: Indien mogelijk moet een citraatbuis niet als eerste afgenomen worden of moet een eerste buisje weggegooid worden omdat bij het prikken weefselfactor vrijkomt. Het afnamebuisje moet correct gevuld worden en goed gemengd worden. Voor stollingstesten gebruikt men citraatbuizen met een verhouding 9 delen bloed/1 deel natriumcitraat (blauwe stop) Hemolyse geeft verkorte stollingstijden Bij heparinetherapie neemt men bloed af net voor de toediening @AP Hogeschool p 12 / 82  Stollingstesten binnen de 2u na afname uitvoeren Reagentia bij de juiste temperatuur incuberen 4.2.2 Meetprincipe stollingstesten In ons lab maken we gebruik van een KC4 toestel voor de stollingstesten. Dit systeem maakt gebruik van een speciale cuvet waarin een stalen kogeltje zit. Na een welbepaalde incubatietijd (afhankelijk van de uitgevoerde test) wordt de cuvet met het staal en het kogeltje in het meetpunt geplaatst, waarin de cuvet roteert. Exact tegenover de plaats waar het kogeltje zich bevindt, bevindt er zich een magnetische sensor. Doordat de cuvet schuin staat bevindt het kogeltje zich steeds op het laagste punt, zolang er geen stolling optreedt. De tijd begint te lopen als er reagens wordt toegevoegd. Wanneer het staal stolt, ontstaan er fibrinedraden die het kogeltje wegtrekken van zijn positie. Dit geeft een impuls aan de sensor waardoor de tijd stopt. Figuur 13: meetprincipe KC4 (KC4 Delta Operation manuel) 4.2.3 APTT= geactiveerde partiële tromboplastinetijd De APTT is een stollingstest van de intrinsieke stollingsweg waarbij de stollingsfactoren FII, FV,FVIII, FIX, FX, FXI, FXII en fibrinogeen een rol spelen. Principe: Citraatplasma wordt gemengd met een activator van FXII (Kaoline of elaginezuur) en een fosfolipidemengsel. Na recalcificatie wordt de tijd gemeten die nodig is om een fibrinestolsel te vormen. (ten Boekel Dr. E. e.a) @AP Hogeschool p 13 / 82 Behandeling met heparine geeft een verlengde APTT. Aangezien deze test zeer gevoelig is aan heparine is het belangrijk om bij de bloedafname de buis voor stollingsonderzoek af te nemen voor de buis met heparine of EDTA. Uitvoering (afhankelijk van het gebruikte reagens): APTT Reagentia: Reagens 1 (activator + fosfolipiden) CaCl2 0.025M Controle N+P Andere benodigdheden: Pipetten en tips Coagulometer KC4 Rekje (voor afnamebuisjes) Cuvetten met kogeltje Staal: Stollingstube met Na-citraat (vloeibare Na-citraat 1/10 verdund in bloed) Voorbereiding staal: Het staal gedurende 10 minuten centrifugeren om plaatjesarm plasma te verkrijgen CaCl2 op 37°C brengen Testprocedure: Breng in een cuvet met kogel 100µL plasma en 100µL reagens 1 Meng en incubeer exact 3 minuten bij 37°C Voeg 100µL CaCl2 0.025M (37°C) toe en start chronometer Lees de resultaten af Noteer de resultaten in seconden Herhaal de procedure voor controle N en P Belangrijk! Elke test wordt in duplo uitgevoerd Resultaten van controle N en P moeten binnen de grenzen van de bijsluiter liggen Vergelijk de resultaten van het staal met de referentiewaarden Wat is je besluit? @AP Hogeschool p 14 / 82  Referentiewaarden: 25 – 45 seconden Deze referentiewaarden zijn afhankelijk van: - leeftijd (APTT kinderen > ouderen) - gebruikt reagens - meetprincipe Verlaagde referentiewaarden komen voor bij ouderen Verhoogde referentiewaarden komen voor bij - heparinetherapie: preventief (< 0,1 IU/ml) 37 “– 43” curatief (0,2 tot 0,5 IU/ml) 62” – 124” - factordeficiëntie (F VIII bij Hemofilie A) - Lupus anticoagulans 40” – 50 ” - orale anticoagulantia (AVK therapie) 46” – 62 ” 4.2.4 PTT= protrombinetijd Met de protrombinetijd wordt de extrinsieke stolweg onderzocht waarbij de stollingsfactoren FII, FV, FVII, FX en fibrinogeen een rol spelen. Principe: Citraatplasma wordt gemengd met een reagens dat weefselfactor bevat (tromboplastine), na recalcificatie activeert het tromboplastine FVII, waardoor een protrombinasecomplex gevormd wordt. Dit complex activeert vervolgens FII tot trombine dat fibrinogeen omzet in fibrine. De tijd vanaf het toevoegen van het reagens dat bestaat uit weefseltromboplastine, fosfolipiden en Ca++ tot de vorming van een stolsel is een maat voor het functioneren van de extrinsieke stolweg. (ten Boekel Dr. E. e.a) Uitvoering (afhankelijk van het gebruikte reagens): PTT Reagentia: Reagens 1 (tromboplastine) Controle N+P Andere benodigdheden: Pipetten en tips Coagulometer KC4 Rekje (voor afnamebuisjes) Cuvetten met kogeltje @AP Hogeschool p 15 / 82  Staal: Stollingstube met Na-citraat (vloeibare Na-citraat 1/10 verdund in bloed) Voorbereiding staal: Het staal gedurende 10 minuten centrifugeren om plaatjesarm plasma te verkrijgen Reagens 1 (tromboplastine) (afhankelijk van het gebruikte reagens oplossen of niet) en op 37°C brengen Testprocedure: Breng in een cuvet met kogel 100µL plasma Incubeer exact 2 minuten bij 37°C Voeg 200µL reagens 1 (tromboplastine) (37°C) toe en start chronometer Lees de resultaten af Noteer de resultaten in seconden Herhaal de procedure voor controle N en P Belangrijk! Elke test wordt in duplo uitgevoerd Resultaten van controle N en P moeten binnen de grenzen van de bijsluiter liggen Vergelijk de resultaten van het staal met de referentiewaarden Wat is je besluit? Referentiewaarden (seconden): 12-15 seconden, afhankelijk van het gebruikte reagens. In de praktijk worden de waarden uitgedrukt in % protrombine. Deze waarden worden afgelezen op een standaardcurve die opgesteld is met 4 à 5 verdunningen van pool plasma in veronalbuffer. Een pool plasma is een verzameling van een 20-tal verschillende plasma’s met normale stollingstijden. Onverdund plasma 100 % Verdunning 1:2 50 % Verdunning 1:4 25 % Verdunning 1:8 12,5 Tweede mogelijkheid i.p.v. poolplasma, is een aangekochte standaardreeks vb. Etaloquick (3 verschillende concentraties in %) @AP Hogeschool p 16 / 82 Opstellen standaardcurve: Maak met de bekomen waarden in excel een standaardcurve. In de log absis worden de % geplaatst, in de ordinaat het aantal seconden. Lees de resultaten van je bepalingen af op de curve. Figuur 14: voorbeeld standaardcurve Referentiewaarden (%): 70-120% Therapeutische zone onder orale anticoagulantia: 20 – 40 % Verlaagde waarden (< 70 %) komen voor bij: - Factordeficiëntie (II,V,VII,X) - leverfalen - gebruik van orale anticoagulantia Gebruik van INR of International Normalized Ratio Het uitdrukken van de PT waarden in % volstaat wanneer de test als screening test wordt aangevraagd. Bij gebruik van anticoagulantia bekomt men verschillende waarden naargelang het gebruikte reagens op verschillende toestellen. Er wordt getracht een “gecorrigeerde PT” door te geven. Het gaat hier om waarden die verkregen zouden worden indien men een referentietromboplastine had gebruikt. @AP Hogeschool p 17 / 82  Eerst wordt een berekening gemaakt van een PT-ratio door de PT van de patiënt te delen door de in het labo als normaal beschouwde PT. Men vergelijkt alle bekomen waarden met een referentiewaarde. Vervolgens maakt men een correctie met de ISI (International Sensitivity Index). Van de patiëntenstalen bepaalt men een PT-ratio (PTR) met een referentietromboplastine en het gebruikte tromboplastine. Deze resultaten worden op een LOG-curve uitgezet en de helling van de curve is de ISI. Een ISI-waarde van ± 1.0 zal resultaten geven alsof het referentie-tromboplastine werd gebruikt. De ISI-waarde wordt door de firma steeds opgegeven. INR is de PT-ratio verheven tot de macht ISI. PT patiënt in seconden ISI bijsluiter INR= ______________ PT N-controle in seconden Voorbeeld: PT = 26 seconden Referentie PT = 14 seconden ISI van het gebruikte reagens: 1,4 INR = (PT patiënt / PT referentie)ISI INR = (26 / 14)1,4 = 2,4 Referentiewaarden INR: 1–4 Therapeutische waarden onder orale anticoagulantia: INR: 2 – 4 Meet men bij een patiënt een lagere INR, dan is er te weinig stollingsremming (= tromboseneiging) en moet de dosering verhoogd worden. Bij een hogere INR is er teveel stollingsremming (= bloedingsneiging) en moet de dosering verlaagd worden. 4.2.5 Fibrinogeen Fibrinogeen of Factor I wordt meestal bepaald met de Clauss methode. Er wordt een overmaat aan trombine (FIIa) toegevoegd aan verdund citraatplasma. Dit zorgt voor de omzetting van fibrinogeen naar fibrine. De stollingstijd is dus afhankelijk van de nog ‘stolbare’ hoeveelheid fibrinogeen in het plasma en is omgekeerd evenredig met de fibrinogeenconcentratie. Voor de bepaling maakt men gebruik van een ijklijn van stollingstijden in een verdunningsreeks met gekende fibrinogeenconcentraties. @AP Hogeschool p 18 / 82 Uitvoering (afhankelijk van het gebruikte reagens): Fibrinogeen Reagentia: Reagens 1 (Trombine) Reagens 2 (Owren Koller) Controle N+P Andere benodigdheden: Pipetten en tips Coagulometer KC4 Rekje (voor afnamebuisjes) Cuvetten met kogeltje Staal: Stollingstube met Na-citraat (vloeibare Na-citraat 1/10 verdund in bloed) Voorbereiding staal: Het staal gedurende 10 minuten centrifugeren om plaatjesarm plasma te verkrijgen Trombine op 37°C brengen Staal 1/10 verdunnen: 100µL plasma + 900µL Owren Koller Indien nodig ( zie verder): Staal1/5 verdunnen: 100µL plasma + 400µL Owren Koller Staal 1/20 verdunnen: 100µL plasma + 1900µL Owren Koller Testprocedure: Breng in een cuvet met kogel 200µL verdund plasma Incubeer exact 2 minuten bij 37°C Voeg 100µL trombine (37°C) toe en start chronometer Lees de resultaten af Noteer de resultaten in seconden: tussen 6.0 en 30,0 seconden Indien hoge fibrinogeen (30 seconden): verdun plasma 1/5 Herhaal de procedure voor controle N en P Belangrijk! Elke test wordt in duplo uitgevoerd Resultaten van controle N en P moeten binnen de grenzen van de bijsluiter liggen Vergelijk de resultaten van het staal met de referentiewaarden. @AP Hogeschool p 19 / 82  Wat is je besluit? Opstellen ijklijn: Een standaard met gekende concentratie wordt verdund met buffer. Bv. concentratie standaard = 360 mg% Conc (mg%) Verdunning Buffer (μl) Plasma (μl) 720 1:5 400 100 360 1:10 900 100 180 1:20 500 500 plasma 1:10 90 1:40 500 500 plasma 1:20 De werkwijze is dezelfde als voor patiëntenplasma’s. De resultaten worden in een LOG-curve uitgezet. Referentiewaarden (mg%): 200 – 400 mg% Verhoogde waarden komen voor bij: - infectie, ontsteking - zwangerschap - tumoren Verlaagde waarden komen voor bij: - DIS - leverfunctiestoornissen - fibrinolysetherapie (bv. Streptokinase) 4.3 Opdracht lab: Secundaire hemostase (2 MLT) Bepaal APTT, PT en fibrinogeen van een patiënt. Stel een standaardcurve (PT) en ijklijn (fibrinogeen) op met de gegevens die je krijgt van de lector om je resultaten in de juiste eenheden door te geven. Maak een verslag van de hemostase. @AP Hogeschool p 20 / 82  4.4 Uitbreidingsstof: Laboratoriumonderzoek bij trombose Hemostase of bloedstolling is een systeem in ons lichaam om bloedverlies bij verwonding te voorkomen. Als dit systeem in ons lichaam in actie komt zonder dat er sprake is van een bloeding, dan ontstaat er een stolsel (trombose) in een bloedvat. Dit stolsel kan het bloedvat geheel of gedeeltelijk afsluiten, maar het kan zich ook verplaatsen naar andere delen van het lichaam. Onder normale omstandigheden wordt dit stolsel onmiddellijk opgeruimd door de fibrinolyse. Fibrinolyse zorgt ervoor dat het onoplosbare fibrinenetwerk wordt afgebroken tot oplosbare fibrine- afbraakproducten. Figuur 15: hemostatische balans 4.4.1 D-dimeerbepaling Tijdens de vorming van een stolsel wordt door het systeem de activatie van plasminogeen ingebouwd waardoor plasmine wordt gevormd. Het plasmine lost het stolsel op door de fibrinedraden in stukken te splitsen waardoor er fibrine- afbraakproducten ontstaan Fibrine-splitsingsproducten worden bepaald met een D-dimeertest. Omdat D-dimeren enkel kunnen ontstaan uit fibrine, duidt de aanwezigheid ervan op een actieve fibrinolyse, dit wijst er dus op dat er eerder een stolselvorming is opgetreden. De bepaling wordt voornamelijk gebruikt bij verdenking van trombose in het been of de longen. Is de test negatief dan is er waarschijnlijk geen sprake van trombose. Bij een @AP Hogeschool p 21 / 82 positieve test is radiologisch onderzoek noodzakelijk ter bevestiging van een trombose. D-dimeren kunnen ook verhoogd zijn bij infecties, ontstekingen, zwangerschap of leveraandoening. Een goede anamnese is dus zeer belangrijk. (ten Boekel Dr. E. e.a) Figuur 16: vorming van fibrineafbraakproducten (Moore Gary e.a) @AP Hogeschool p 22 / 82 Cytologie In de labcluster Klinische Biologie 1 werden normale leukocyten ingeoefend en werden de afwijkingen van de erytrocyten besproken. In deze labcluster komen niet- maligne afwijkingen van de leukocyten aan bod en oefenen we verder op de afwijkingen van de erytrocyten. Figuur 17: overzicht ontwikkeling van stamcel tot volwassen bloedcel @AP Hogeschool p 23 / 82 5 Leukocyten Band Figuur 18: normale bloedcellen Vanuit bovenstaande figuur kunnen we de volgende cellen beschrijven die in een normale uitstrijk voorkomen: Naam Kern Cytoplasma Staafkernige Bandvormige kern Zeer licht rozerood neutrofiele < 1/3 ingedeukt Groot aantal kleine granulocyt Zeer grof lichtroze tot purperblauw violetroze korrels chromatine Neutrofiele Gelobd, meestal Zeer licht rozerood segmentkernige 3-4 Groot aantal kleine granulocyt Zeer grof lichtroze tot purperblauw violetroze korrels chromatine Eosinofiele Gelobd, meestal Vol grove oranje segmentkernige 2-3 korrels granulocyt Grof donkerpaars chromatine Basofiele Gelobd, meestal Veel grote segmentkernige 2-3 blauwzwarte granulocyt Grof donkerpaars korrels chromatine Soms degranulatie @AP Hogeschool p 24 / 82  Monocyt Onregelmatig: Blauwgrijs ‘wolkig’ ovaal of ingedeukt Zéér fijne roze ‘lettervormig’ granulatie Fijn chromatine Dikwijls vacuolen met grote mazen Geen perinucleaire Geen nucleoli hof (kleine) Lymfocyt Rond, soms ovaal Smalle rand rond Grof dicht de kern purperblauw Donkerblauw chromatine Geen korrels Geen nucleoli (grote) Lymfocyt Excentrisch Matige Fijn netchromatine hoeveelheid Lichtblauw Enkele grote helderrode korrels @AP Hogeschool p 25 / 82  5.1 Afwijkingen in het cytoplasma van granulocyten 5.1.1 Toxische korreling De korreling in het cytoplasma van de neutrofiele granulocyt is donkerblauw tot bruinrood gekleurd en meestal grover. De basofiele kleur van de korrels is een gevolg van een verandering in pH door activatie van lysosomen. In eenzelfde granulocyt kan er een variatie in kleur aanwezig zijn. Komt voor bij: Bacteriële infecties en bij sepsis Figuur 19: toxische korreling 5.1.2 Döhle bodies Deze insluitsels zijn lichtblauw tot grijsblauw gekleurd en ongeveer 1-2µm groot. Vaak liggen ze aan de rand van de cel en ze bevatten opgehoopt materiaal uit de ribosomen. Komt voor bij: bacteriële infecties, toxische toestanden en bij kwaadaardige ziekten zoals myelodysplastisch syndroom (MDS) en myeloïde leukemie. Figuur 20: Döhle bodies 5.1.3 Vacuolen Kleurloze, vrij grote ophelderingen in het cytoplasma die materiaal bevatten van gefagocyteerde cellen en organismen. Ze kunnen ook voorkomen wanneer men te lang wacht met het uitstrijken van EDTA-bloed, in bloed dat afgenomen werd van dezelfde patiënt zonder anticoagulans vindt men ze niet terug. Komt voor bij: Ernstige infecties en toxische situaties. @AP Hogeschool p 26 / 82  Figuur 21: vacuolisatie 5.1.4 Hypogranulatie Wanneer door beschadiging van het DNA het aantal korrels in neutrofiele granulocyten gedaald is spreekt men van hypogranulatie. Zijn er geen korrels meer aanwezig dan noemt men dit degranulatie. Het cytoplasma valt daardoor duidelijker op en het is vaak licht grijsblauw gekleurd. Komt voor bij: MDS en myeloïde leukemie Figuur 22: hypogranulatie 5.1.5 Auerstaafjes Deze helderrode, naaldvormige insluitsels komen voor in myeloblasten en promyelocyten (voorlopers van de granulocyten). De inhoud van de staafjes komt overeen met de inhoud van de korrels en hebben daardoor dezelfde kleur. Meestal vindt men 1 of 2 staafjes per cel. Komt voor bij: acute myeloïde leukemie (AML) Figuur 23: auerstaafjes 5.1.6 Malariapigment Typisch geelzwart pigment: ‘hemozoïne’, dat vrijkomt bij lyse van de geïnfecteerde RBC en vervolgens gefagocyteerd wordt (kan ook voorkomen in monocyten). Komt voor bij: ernstige malaria-infecties @AP Hogeschool p 27 / 82  Figuur 24: malariapigment 5.2 Kernafwijkingen van granulocyten 5.2.1 Pelger-Huët Een erfelijke afwijking zonder klinische verschijnselen in de segmentatie van de kernen van neutrofiele granulocyten. In de heterozygote vorm is de chromatinestructuur zeer grof en neemt de kern de vorm van een bril aan. In de homozygote vorm is er geen segmentatie meer en is de kern rond of staafvormig met zeer grof chromatine. Figuur 25: Pelger Huet 5.2.2 Pseudo Pelger-Huët Een niet erfelijke afwijking met (meer) drielobbige kernen en waarbij het kernchromatine minder grof is. Vaak komt er ook hypogranulatie voor. Komt voor bij: MDS en myeloïde leukemie, soms bij ernstige infecties Figuur 26: pseudo Pelger Huet @AP Hogeschool p 28 / 82 5.2.3 Hypersegmentatie Normaal heeft de kern van een rijpe neutrofiele granulocyt 3-4 lobben. Bij hypersegmentatie is het gemiddeld aantal lobben 5 of meer. Criteria die gebruikt worden voor het vermelden van hypersegmentatie zijn: >1% heeft een kern met 6 of meer lobben of minstens 5% heeft 5 of meer lobben. Het is een uiting van een gestoorde uitrijping. Komt voor bij: deficiënties van folaat of vitamineB12. Figuur 27: hypersegmentatie 5.2.4 Linksverschuiving Wanneer de behoefte aan rijpe granulocyten groter is dan de aanmaak komen er nog onrijpe granulocyten vrij uit het beenmerg. Tegenwoordig wordt er eerder naar het absoluut aantal neutrofiele granulocyten gekeken dan naar de aanwezigheid van een linksverschuiving of het percentage staafkernigen en onrijpe granulocyten bij een microscopische differentiatie voor het aantonen van een infectie of een sepsis. 5.3 Afwijkingen van lymfocyten Vroeger werd de term atypische lymfocyten gebruikt, dit is eerder een verzamelnaam waaronder alle lymfocyten behalve de kleine lymfocyt ingedeeld worden. Men kan beter de afwijking benoemen. Ook de term virocyten is niet correct omdat het niet enkel om een virale infectie kan gaan. Algemeen kan men zeggen dat een monotoon beeld van afwijkende lymfocyten doet denken aan een kwaadaardige aandoening, terwijl een heterogeen beeld eerder wijst op een reactie als gevolg van een infectie. 5.3.1 Geactiveerde of gestimuleerde lymfocyt (reactieve lymfocyt) Deze lymfocyten zijn groter dan de kleine lymfocyt en hebben een grillige vorm met een onregelmatige kern die meestal excentrisch gelegen is. De kern is lichtpaars en bevat soms nucleoli en heeft een kernstructuur die tussen fijn en grof ligt. Er is veel cytoplasma aanwezig dat rondom de kern lichtblauw van kleur is en aan de rand van de cel donkerder (basofiel), waardoor men spreekt van een perinucleaire hof. De cel lijkt zich tussen de omliggende cellen te wringen waardoor ze een onregelmatige vorm krijgt, waardoor ze soms sterk op een monocyt lijkt. Komt voor bij: actieve virale infecties. @AP Hogeschool p 29 / 82  Figuur 28: reactieve lymfocyten 5.3.2 Plasmacel Een plasmacel is rond tot ovaal, groter dan een kleine lymfocyt en komt bijna altijd in het beenmerg voor, maar zelden in het bloed. De ronde kern is vrij klein en heeft zeer grof chromatine, wat eerder lijkt op klontering. Hierdoor is hij donkerder gekleurd, met lichte plekken ertussen die spaakvormig uitlopen. De kern ligt eerder excentrisch en er zijn geen nucleoli aanwezig. Er is veel cytoplasma aanwezig dat vooral donkerblauw is aan de rand van de cel en zeer licht tegen de kern, een zogenaamd perinucleaire hof. Soms bevat het cytoplasma vacuolen of een klein aantal helderrood gekleurde korrels. Figuur 29: plasmacel 5.3.3 Gümprechtse schaduwen/schollen Dit zijn onregelmatige, homogeen gekleurde roosrode structuren. Ze ontstaan tijdens het maken van een uitstrijkje door beschadiging van de fragiele kernen van de lymfocyten. Onder de microscoop merkt men ze op tussen een lymfocytose met een monotoon beeld van kleine lymfocyten. Komt voor bij: Chronisch lymfatische leukemie (CLL) Figuur 30: beeld van CLL @AP Hogeschool p 30 / 82  5.4 Maligne lymfomen 5.4.1 Lymfocyten met gekliefde kern Hoekige lymfocyten met weinig cytoplasma en een onregelmatige kern met een diepe kloof en grof chromatine. Komt voor bij: folliculair lymfoom en mantelcellymfoom Figuur 31: lymfocyten met gekliefde kern 5.4.2 Burkitt lymfoomcellen Grote polymorfe lymfocytaire cellen met meerdere nucleoli, blauw (sterk basofiel) cytoplasma en zeer veel vacuolen. Komt voor bij: Lymfoblastair lymfoom, Burkitt lymfoom Figuur 32: Burkitt lymfoomcellen 5.4.3 Hairy-cells Middelgrote lymfocyten met een grote boonvormige kern. Het kernchromatine is fijn en er zijn geen nucleoli aanwezig in de kern. Het blauwgrijze cytoplasma heeft haarvormige uitsteeksels rondom de hele cel. Meestal treedt er ook volledige monocytopenie op. Komt voor bij: Hairycelleukemie Figuur 33: Hairy-cells @AP Hogeschool p 31 / 82 5.4.4 Sezary-cellen Middelgrote abnormale T-lymfocyten met een donkere kern die op meerdere plaatsen ingesnoerd is waardoor men het uitzicht van een bloem krijgt. De kern heeft een uitgegomd uitzicht. Het cytoplasma is donkerblauw. Komt voor bij: een bepaald type non-Hodgkinlymfoom Figuur 34: Sezary cellen @AP Hogeschool p 32 / 82  6 Erytrocyten Figuur 35: normale erytrocyten Onder verschillende omstandigheden kan de vorm van de erytrocyten afwijken van de normale biconcave vorm en ook afwijkingen in grootte en kleur komen vaak voor. De morfologie van erytrocyten is een belangrijk hulpmiddel voor de diagnostiek van anemie. In de werkcolleges Labcluster klinische biologie1 werden de verschillende afwijkingen van de rode reeks reeds besproken. In de bijhorende digitapcursus kunnen jullie nog steeds aan de slag met het oefenmateriaal. Dit wordt ten stelligste aangeraden. In de labs van Labcluster Klinische biologie 2 worden de afwijkingen van de erytrocyten microscopisch ingeoefend en leren jullie histogrammen interpreteren a.d.h.v. RBC-indices. Ook in labcluster Klinische biologie 3 blijft het belangrijk de afwijkingen van het rode bloedbeeld te kunnen benoemen. 6.1 Afwijkingen in grootte Microcytair (klein), macrocytair (groot) en anisocytose(verschillend) zijn basisaanduidingen die jullie kennen uit labcluster Klinische biologie 1. Ze zeggen iets over het volume van erytrocyten. Een celteller zet de meting van het volume van de erytrocyten om in een histogram, ook volumedistributiecurve genaamd. Figuur 36: histogram van een gezond persoon @AP Hogeschool p 33 / 82 Bij een gezond persoon is de verdeling van de erytrocyten naar vorm een Gauss- curve. De top van de curve geeft de MCV (mean corpuscular volume) van de persoon weer. Het kan zijn dat het gemiddeld celvolume ( MCV) normaal is, maar dat er in een microscopisch beeld toch veel macrocyten en microcyten aanwezig zijn (anisocytose). In dat geval is het kijken naar de RDW (red cell distribution width) een meerwaarde. Een RDW-waarde geeft ons informatie over de breedte van de curve en dus ook over de mate van anisocytose. Figuur 37: betekenis RDW Een histogram kan ons dus veel informatie geven bij aandoeningen m.b.t. erytrocyten: Figuur 38: voorbeelden volumedistributiecurve bij verschillende aandoeningen (Hoffmann, Dr.J.J.M.L. e.a) @AP Hogeschool p 34 / 82 6.2 Afwijkingen in kleur Hypochrome erytrocyten bevatten minder hemoglobine dan normaal, bij sterk verminderde hemoglobineconcentraties worden deze cellen ook annulocyten genoemd. Bevat de erytrocyt meer hemoglobine dan normaal, dan verdwijnt de centrale opheldering en lijken de cellen eerder bolvormig dan biconcaaf. De term hyperchroom wordt echter zelden gebruikt en men spreekt eerder van sferocyten of kogelcellen. Celtellers geven in een hemoglobine distributiecurve een beeld van de gemiddelde hemoglobineconcentratie waarbij de top van de Gauss-curve van een gezond persoon het gemiddelde celhemoglobine of MCH (mean corpuscular hemoglobine) weergeeft. Ook hier is de breedte van de curve een maat voor de spreiding van het hemoglobine gehalte, anisochromasie genaamd. De term polychromasie wordt gebruikt wanneer er naast normale erytrocyten ook grijsblauwe erytrocyten aanwezig zijn. Dit wijst op de aanwezigheid van onrijpere reticulocyten in het bloed. 6.3 Afwijkingen in vorm Poikilocytose is een verzamelnaam voor alle vormafwijkingen. Het is beter om elke vormafwijking apart te benoemen omdat dit een diagnostische meerwaarde heeft. Zo is bv. de aanwezigheid van sikkelcellen een diagnostisch gegeven. In 3MLT zullen jullie leren een score te geven aan het voorkomen van een afwijking. Dit geldt tevens voor grootte- en kleurafwijkingen en zoals we verder zullen bespreken, voor insluitsels. Hoe meer een afwijking aanwezig is in de uitstrijk, hoe hoger de score. Enkel indien er verschillende vormafwijkingen voorkomen zonder dat er iets overheerst, spreekt men nog van poikilocytose. (zie verder) Naam Beschrijving – Voorkomen Elliptocyten Ovale RBC Vroeger: ovalocyten Veranderingen cytoskelet - Ernstige megaloblastische anemie Sikkelcellen of Sikkelvormig met scherpe Drepanocyten uitsteeksels Bij sikkelcelanemie Targetcellen of Enkel Hb aan de rand en in het schietschijfcellen midden Gestoorde globinesynthese - Lever- miltaandoeningen - Thalassemie @AP Hogeschool p 35 / 82  Traandruppelcellen Traan- of peervormig of teardrop-cells Myeloproliferatieve ziekten, kan wijzen op aanmaak buiten het beenmerg Fragmentocyten of ‘stukjes’ RBC met scherpe schizocyten uitsteeksels DIS – HUS – TTP - Hartkleppen Ernstige verbranding Doornappelcellen Vele dunne uitsteeksels Artefact Echinocyten Een of meer uitsteeksels Leverziekten – DIS - Miltverwijdering Ook wel ‘burr’-cellen (met stompe uitsteeksels) of acantocyten (met enkele dunne uitsteeksels) Stomatocyten Mondvormige opheldering Leverziekten – alcoholisme – bep. medicijnen - erfelijk 6.4 Afwijkingen door insluitsels in erytrocyten Naam Beschrijving - voorkomen Howell-Jolly bodies Paars klein bolletje, kernresten, meestal 1/cel Miltverwijdering – gestoorde miltfunctie @AP Hogeschool p 36 / 82  Basofiele punctering Vele kleine donkerblauwe korrels, resten ribosomen Thalassemie - loodvergiftiging Pappenheimer- 1 of enkele donkerblauwe of lichaampjes zwarte insluitsels Bij elkaar, bevatten ferritine Myelodysplastische anemie - miltverwijdering Ringen van Cabot Paarsrood, lusvormig Resten van kerndeling Ernstige anemie Heinz-bodies Donkere bolletjes gedenatureerd Hb Enkel in vitale kleuring G6DP-deficiëntie Thalassemie Malariaparasieten Zie cursus parasitologie 6.5 Andere afwijkingen Naam Beschrijving - Voorkomen Rouleaux- of RBC ‘stapelen’ op elkaar geldrolvorming Pseudoagglutinatie Monoclonale eiwitten - infecties @AP Hogeschool p 37 / 82 6.6 Kwantificering morfologische afwijkingen van erytrocyten/leukocyten @AP Hogeschool p 38 / 82  7 Trombocyten Figuur 39: trombocyten 7.1 Afwijkingen aantal, grootte of granulatie Bij trombopenie is het aantal trombocyten verlaagd. Dit wordt veroorzaakt door een gedaalde productie of door een gestegen verbruik. Bij trombocytose is het aantal trombocyten gestegen. Als deze stijging wordt veroorzaakt door een infectie, blijft het uitzicht van de trombocyten normaal. Als de trombocyten tevens vergroot zijn, is de oorzaak myeloproliferatief. Men spreekt van macrotrombocyten als ze even groot of zelfs groter worden dan de RBC. Bij gedegranuleerde trombocyten is het aantal granules gedaald of zelfs afwezig. Dit kan een artefact zijn, zoals in het geval van stolsels, maar kan ook veroorzaakt worden door een beenmergziekte. 7.2 Artefacten Naam Oorzaak Aggregaten Aantal vals verlaagd Klontering bij moeilijke afname Satellitisme Aantal vals verlaagd Trombocyten schikken zich in vitro rond neutrofielen @AP Hogeschool p 39 / 82 8 Referentiewaarden Hematologie: Deze brede grenzen zijn leerstof in MLT Man Vrouw Eenheid RBC 4.3 – 6.0 3.8 – 5.5 Miljoen / µl HGB 14 – 18 12 - 16 g/dl HCT 40 - 55 35 - 45 % MCV 75 - 95 fl MCH 27 - 32 pg MCHC 30 - 35 g/dl RDW < 15 % WBC 4000 – 11.000 /µl TRO 140.000 – 450.000 /µl RET 0.2-2.0 % Absoluut # 60.000-100.00 ( neonati tot 400.000) /µl reticulocyten Reticulocyten index 0.4-2.22 % Referentiewaarden differentiatie WBC: Staafkernige neutrofiele granulocyt 0-2% Segmentkernige neutrofiele granulocyt 45-75% Eosinofiele granulocyt 0-8% Basofiele granulocyt 0-2% Lymfocyt: 15-45% Kleine lymfocyt: 90% Grote lymfocyt: 10% Monocyt 4-13% @AP Hogeschool p 40 / 82 9 Praktische uitvoering lab: cytologie (2 en 3 MLT) Bloed wordt uitgestreken, gekleurd en beoordeeld bij vergroting 1000x (of 500x) met immersieolie met als doel de differentiatie van de leukocyten. Daarnaast wordt ook het gehele bloedbeeld: leukocyten, erytrocyten en trombocyten beoordeeld. Men begint met het tellen van 100 leukocyten of een veelvoud hiervan. Dit doet men in de vlam van het preparaat met de zogenaamde kanteelmethode, ook meanderen genoemd. (zie Labcluster Klinische biologie 1) Figuur 40: kanteelmethode De aantallen worden doorgegeven in percentages. In de praktijk worden deze waarden ook gerapporteerd in absolute waarden wat een beter beeld geeft van de werkelijke situatie. Als één populatie verhoogd is, kan het lijken dat een andere populatie procentueel verlaagd is, terwijl dit in absolute cijfers niet het geval is. Vervolgens vermeldt men bijzondere kenmerken van de leukocyten. Daarna overloopt men het rode bloedbeeld en let men daarbij op de grootte en de kleur van de cellen, eventuele vormafwijkingen en insluitsels. Tenslotte beoordeelt men de trombocyten op aantal, grootte en hoeveelheid granulen. Aggregaten worden eveneens vermeld. @AP Hogeschool p 41 / 82  10 Voorlopercellen De bloedcellen worden gevormd in het beenmerg en de bloedvormende organen. Bij celdeling of proliferatie ontstaan dochtercellen die identiek zijn aan de moedercel, terwijl bij differentiatie of uitrijping de cel niet meer deelt maar overgaat van een onrijper stadium naar een rijper stadium. Uiteindelijk zullen door dit proces de rijpe bloedcellen ontstaan die voorkomen in het perifere bloed. Onder bepaalde pathologische omstandigheden kunnen de voorlopercellen toch verschijnen in het perifere bloed en dus in de uitstrijkjes. Daarom is het belangrijk ook deze cellen te leren kennen. 10.1 Voorlopers van de witte reeks 10.1.1 Blasten van de witte reeks Myeloblast Ø 10-18 µm Cel: groot, rond, soms licht ovaal Kern: rond – ovaal, roodviolet, zeer fijne chromatine, 2-4 nucleoli Cytoplasma: smalle lichtblauwe cytoplasmazoom, geen korrels Auerstaafjes bevestigen de identificatie myeloblast, maar zijn niet altijd aanwezig Lymfoblast Cel: 9-18 µm Kern: rond – ovaal, nucleoli zijn erg moeilijk te zien Cytoplasma: smalle diepblauwe cytoplasmazoom, geen korrels @AP Hogeschool p 42 / 82  Monoblast Ø 12-20 µm Cel: rond of vrijwel rond Kern: groot, rond of ovaal, fijne chromatine, 1 of 2 nucleoli Cytoplasma: donkerblauw, geen korrels 10.1.2 Voorlopers van de myeloïde reeks Figuur 41: ontwikkeling van de myeloïde reeks De myeloblast wordt beschreven onder punt 10.1.1. Zoals vermeld bevestigen Auer- staafjes de identificatie maar zijn deze niet steeds aanwezig, zoals in onderstaande foto te zien is. Figuur 42: myeloblast @AP Hogeschool p 43 / 82  Promyelocyt Ø 15 – 25 µm Cel: rond Kern: rond – ovaal, roodviolet, fijne chromatine, 1-3 nucleoli (minder goed te zien dan in de myeloblast) Cytoplasma: meer cytoplasma dan in de myeloblast, lichtblauw, talrijke grote azurofiele (helder- rode) korrels, ook over de kern heen Myelocyt Ø 12-20 µm Cel: rond of iets ovaal Kern: rond – ovaal, roodviolet, grove chromatine en daardoor donkerder (klontering chromatine wordt zichtbaar), geen nucleoli Cytoplasma: relatief meer cytoplasma, blauwachtig tot roze, groot aantal korrels, differentiatie van de korrels zichtbaar: neutrofiel, eosinofiel, basofiel Metamyelocyt Ø 15-20 µm Cel: rond – ovaal Kern: ingedeukt (boon- of niervormig), roodviolet, grove chromatine Cytoplasma: roze, groot aantal korrels, differentiatie van de korrels zichtbaar: neutrofiel, eosinofiel, basofiel @AP Hogeschool p 44 / 82 10.2 Voorlopers van de rode reeks Uit de pro-erytroblast ontstaan de rijpere stadia van de rode cellijn. De pro- erytroblast is vrij groot (14-19µm), iets ovaal met een grote ronde kern met fijn chromatine en één of meer nucleoli. Het cytoplasma is diep donkerblauw en bevat geen korrels. De basofiele erytroblast is kleiner (12-17µm). Het chromatine in de kern wordt dichter en er zijn geen nucleoli meer, het cytoplasma is nog steeds blauw. De mesochromatische erytroblast is nog kleiner (12-15µm). De kern is kleiner en de chromatine grover. De aanmaak van hemoglobine komt op gang waardoor het cytoplasma een oranjebruine kleur begint te krijgen. De orthochromatische erytroblast (8-12µm) heeft een kleine kern met een grove geklonterde structuur en ligt vaak excentrisch, het cytoplasma heeft nagenoeg dezelfde kleur als dat van een rijpe erytrocyt. De differentiatie gaat geleidelijk aan en zodoende zijn er vaak overgangsvormen te zien met kenmerken die zowel bij onrijpere als bij rijpere vormen passen. De differentiatie tussen deze vormen is bijgevolg moeilijk en daarom volstaat het voor onze praktijklessen te weten dat de rijpere stadia van de rode cellijn ontstaan vanuit pro-erytroblasten. Een typisch kenmerk van pro-erytroblasten zijn de ‘oortjes’. Verder is het belangrijk erytroblasten te kunnen herkennen omdat deze regelmatig aangetroffen worden in een perifere bloeduitstrijk. Deze cellen zijn maar een klein beetje groter dan de rijpe erytrocyten en hebben ook bijna dezelfde kleur cytoplasma: van grijsblauw zoals bij jonge erytrocyten tot bruinroze zoals bij rijpe erytrocyten. Ze bevatten nog een kleine, meestal excentrisch gelegen kern met een grove structuur. Normaal wordt deze uitgestoten vooraleer de cel in de periferie komt. Erytroblasten worden apart geteld en vermeld. Er worden 100 WBC geteld en tijdens deze telling worden de erytroblasten apart gehouden van de WBC. Ze worden gerapporteerd als X erytroblasten per 100 getelde WBC. Verschillende voorlopers van de rode reeks: Pro-erytroblast Erytroblast Erytroblast @AP Hogeschool p 45 / 82  10.3 Voorlopers van de trombocyten Trombocyten worden aangemaakt door megakaryocyten in het beenmerg. Dit zijn zeer grote cellen met een sterk gelobde kern en veel korrels in het cytoplasma. De trombocyten scheuren los van het cytoplasma. In de periferie kan men naast de trombocyten soms een megakaryocytenkernrest waarnemen: een donkere kern met soms flarden cytoplasma waar men een trombocyt in kan herkennen. Figuur 43: megakaryocytenrest (cellWiki) 10.4 Maligniteiten De belangrijkste groep ziekten binnen de hematologische maligniteiten zijn de leukemieën en de maligne lymfomen. Een leukemie wordt gekenmerkt door een abnormale ophoping van leukocyten in het beenmerg. In een later stadium komen deze leukemische cellen ook in het bloed voor. Een maligne lymfoom is een kwaadaardige lymfeklierzwelling als gevolg van ophoping van abnormale lymfocyten. In latere stadia van lymfomen ziet men deze abnormale cellen ook in het bloed. Men spreekt dan van een leukemisch lymfoom. Omdat bij alle typen leukemie de proliferatie van de cellen verstoord is, spreekt men van proliferatieve bloedziekten. Myeloïd dan wel lymfoïd op basis van de morfologische, cytochemische en immunologische kenmerken van de leukemische cellen. Afhankelijk van het klinisch verloop is er tevens een indeling in acute en chronische vormen. 10.4.1 Myeloïde leukemie Het kenmerk van acute myeloïde leukemie (AML) is het voorkomen van een verhoogd aantal myeloïde blasten waarbij deze morfologische afwijkingen vertonen. Typisch is de aanwezigheid van Auerstaafjes, maar ze zijn niet altijd aanwezig. Meestal is de concentratie aan leukocyten verhoogd. Alhoewel extreem hoge concentraties leukocyten niet zeldzaam zijn, is het zelfs mogelijk een verlaagd aantal te vinden. Bijna altijd is er ook een normochrome, normocytaire anemie en een ernstige trombopenie, als gevolg van verdringing van deze cellen in het beenmerg door de kwaadaardige cellen. Er kunnen ook vormafwijkingen van de erytrocyten voorkomen, evenals macrotrombocyten. @AP Hogeschool p 46 / 82 Bij chronische myeloïde leukemie (CML) is de proliferatie verstoord maar is de differentiatie min of meer normaal, met als resultaat dat grote aantallen onrijpe en rijpe granulocyten in het bloed circuleren, maar de rijpere vormen overheersen. Bij CML is er een uitgesproken leukocytose. De concentratie basofielen is altijd verhoogd. Het percentage blasten is afhankelijk van het stadium van CML. Er bestaat een milde anemie en de erytrocyten vertonen geen afwijking. Figuur 44: microscopisch beeld van Acute myeloïde leukemie Figuur 45: microscopisch beeld van Chronisch myeloïde leukemie @AP Hogeschool p 47 / 82 10.4.2 Lymfatische leukemie De kenmerkende cel van acute lymfatische leukemie (ALL) is de lymfoblast. Het geeft een monotoon beeld van lymfoblasten. De concentratie leukocyten kan normaal, verhoogd tot zeer hoog zijn. De myeloïde cellen vertonen geen afwijkingen. Door verdringing in het beenmerg kan er een normocytaire anemie ontstaan evenals trombopenie. De immunologische typering zorgt ervoor dat een onderscheid gemaakt kan worden tussen de verschillende types ALL. In meer dan 90% van de gevallen is een ALL van B-cel-origine. De behandeling is verschillend voor het type ALL en typering is dus van groot belang. ALL is de meest voorkomende leukemie bij kinderen en komt bij volwassenen relatief weinig voor. Chronisch lymfatische leukemie (CLL) is de meest voorkomende van alle lymfoproliferatieve aandoeningen. CLL wordt gekenmerkt door een (soms extreme) lymfocytose met een monotoon beeld van kleine lymfocyten. Men ziet ook veel Gümprechtse schaduwen of schollen die ontstaan doordat de fragiele CLL-cellen kapot gaan bij het uitstrijken. Er komen ook regelmatig enkele prolymfocyten voor. Dit zijn grotere, jongere cellen. De kern is rond, heeft een losmazige structuur en er is een grote opvallende nucleolus aanwezig. Het cytoplasma is grijsblauw en de kern ligt excentrisch. Als er anemie aanwezig is, is ze normocytair en normochroom. CLL komt vooral bij ouderen voor. De groeisnelheid van de cellen is veel trager. Als deze leukemie ontdekt wordt, vaak bij toeval, is het proces meestal al jaren aan de gang. Zelfs zonder behandeling kunnen deze patiënten nog maanden tot jaren leven. Figuur 46: microscopisch beeld van Acute lymfatische leukemie @AP Hogeschool p 48 / 82 Figuur 47: microscopisch beeld van Chronische lymfatische leukemie t @AP Hogeschool p 49 / 82 Immuunhematologie Immuunhematologie is een belangrijk onderdeel van het dagdagelijkse werk in een klinisch laboratorium dat volledig door de MLT wordt uitgevoerd. Het is daarom essentieel een degelijke kennis van de materie te hebben. Nochtans is deze tekst geen volledige theoretische bespreking, hiervoor wordt verwezen naar de theoretische cursus hematologie. Deze nota’s zijn bedoeld als hulpmiddel voor het uitvoeren van de praktische opdrachten. Bloedtransfusie is het toedienen van een bloedproduct van een donor aan een ontvanger. Een transfusie kan alleen veilig verlopen als het toegediende product compatibel (geschikt voor de patiënt) is. Het is de taak van de MLT met behulp van de juiste technieken de bloedgroep van de patiënt te bepalen en eventuele antistoffen op te sporen tegen bloed van potentiële donoren teneinde een geschikte donor te vinden en een transfusiereactie te voorkomen. Tijdens de werkcolleges Labcluster Klinische biologie 1 werd er aandacht besteed aan de ontdekking van de verschillende bloedgroepsystemen op de erytrocyten. De vorming van ABO en Rhesus bloedgroepantigenen en -antistoffen werd besproken en er werd geoefend op juiste combinaties donor-acceptor. Ook de Rhesus- incompatibiliteit bij zwangerschap werd besproken. Het aflezen van bloedgroepbepalingen en de juiste schrijfwijze werd uitgebreid ingeoefend met voorbeelden uit de praktijk. Tijdens het practicum werd de bloedgroepbepaling met de slide-methode uitgevoerd. Ook deze kennis heb je dit academiejaar nodig om de bepalingen die uitgevoerd worden bij zwangerschapsproblematiek te begrijpen. In de Labcluster Klinische Biologie 2 en 3 gaan we nog een stap verder met de problematiek van transfusiereacties. @AP Hogeschool p 50 / 82  11 Bloedgroepen 11.1 Enkele basisbegrippen Aan de buitenzijde van de celmembraan van de erytrocyten bevinden zich allerlei moleculen met een eigen structuur en functie. Deze moleculen kunnen fungeren als antigenen waartegen antistoffen gevormd kunnen worden. We noemen deze antigenen bloedgroepen. Figuur 48: antigenen op de rode bloedcellen Bloedgroepantigenen worden gevormd door genen op de chromosomen. Een gen is altijd in twee allelen aanwezig, eentje van de vader en eentje van de moeder. Er zijn verschillende soorten allelen: bij dominante allelen komt slechts één allel tot uitdrukking. Een recessief allel komt alleen tot expressie als op beide chromosomen hetzelfde allel aanwezig is. Bijna bij alle bloedgroepsystemen zijn de allelen codominant en komen ze beiden tot expressie. Zo kan iemand dus zowel het A-allel als het B-allel tot uitdrukking brengen en benoemen we dit als bloedgroep AB. Soms komt een allel niet tot expressie, een zogenaamd stom allel, zoals het O-allel. Met genotype wordt er bedoeld wat werd overgeërfd, terwijl fenotype staat voor wat er tot uitdrukking komt. @AP Hogeschool p 51 / 82  Figuur 49: voorbeeld genotype en fenotype ABO-systeem 11.2 Bloedgroepantistoffen Er zijn inmiddels al meer dan 300 bloedgroepen bekend waarvan het grootste deel binnen de 30 bekende bloedgroepsystemen valt. Op de erytrocyten bevinden zich een groot aantal verschillende bloedgroepen. Tussen verschillende personen zullen er dus steeds meerdere bloedgroepen verschillen. Als men bloed toedient komt de ontvanger in contact met een groot aantal bloedgroepen die lichaamsvreemd zijn en waartegen er antistoffen kunnen gevormd worden. Indeling van bloedgroepantistoffen: - Allo-antistoffen zijn gericht tegen antigenen van een ander persoon, terwijl auto-antistoffen gericht zijn tegen eigen antigenen. - Natuurlijk voorkomende antistoffen zijn aanwezig zonder voorafgaand contact met het antigen waartegen ze gericht zijn, terwijl immuun-antistoffen gevormd worden na contact met een lichaamsvreemd antigen. Dit proces noemen we immunisatie, bv door een transfusie of tijdens een zwangerschap. - Natuurlijk voorkomende antistoffen anti-A en anti-B noemen we ook reguliere antistoffen, terwijl we alle overige bloedgroepantistoffen irreguliere antistoffen noemen. - Complete antistoffen geven agglutinatie in fysiologisch zout zonder toevoeging van hulpmiddelen, terwijl incomplete antistoffen pas agglutinatie geven na gebruik van hulpmiddelen. IgM-moleculen zijn pentameren en kunnen door hun grootte de afstand tussen twee erytrocyten overbruggen en agglutinatie geven. IgG-moleculen zijn monomeren en dus veel kleiner. Zij zullen binden zonder agglutinatie te veroorzaken. Dit proces noemt men sensibilisatie, wat aangetoond kan worden door hulpmiddelen in te zetten. - Sommige antistoffen maken de erytrocyten onmiddellijk kapot. Men noemt deze hemolysinen. @AP Hogeschool p 52 / 82  Figuur 50: overzicht immuunglobulinen Figuur 51: complete en incomplete antistoffen 11.3 Klinisch belang Het is belangrijk eventueel gevormde antistoffen bij de patiënt aan te tonen om te voorkomen dat de patiënt de toegediende erytrocyten versneld af gaat breken. Deze afbraak wordt hemolyse genoemd. Indeling van hemolytische reacties: - HTR: hemolytische transfusiereactie. De patiënt heeft antistoffen die gericht zijn tegen een antigen dat aanwezig is op de rode bloedcelmembraan van de donor. De reactie kan mild tot zeer ernstig verlopen!! - HDN: hemolytic disease of the newborn. Tijdens de bevalling of soms al tijdens de zwangerschap komt de moeder via haar ongeboren kind in contact met lichaamsvreemde antigenen, namelijk de bloedgroepantigenen die het kind geërfd heeft van zijn vader. Zij kan hier antistoffen tegen aanmaken van het type IgG die de placenta kunnen passeren en de erytrocyten van het kind kunnen afbreken. @AP Hogeschool p 53 / 82  - AIHA: auto-immuun hemolytische anemie. Hierbij heeft de patiënt antistoffen aangemaakt tegen eigen bloedgroepantigenen, die vervolgens de eigen erytrocyten afbreken. - UHTR: uitgestelde hemolytische transfusiereactie. Wanneer een antistof is aangemaakt in het verleden, zal de patiënt daarna altijd met bloed getransfundeerd moeten worden dat negatief is voor het antigen waartegen deze antistoffen gericht waren. Het immuunsysteem blijft deze antigenen herkennen via een geheugenfunctie. Bij een volgende transfusie met het desbetreffende antigen zullen snel en in grote hoeveelheden antistoffen worden aangemaakt en het donorbloed zal na enkele dagen (‘uitgesteld’) worden afgebroken. Dit betekent dat men goed moet documenteren dat er (ooit) antistoffen gevormd werden omdat deze geheugenfunctie steeds in werking treedt, zelfs al is de titer van de antistof in de loop van de tijd zodanig gedaald dat de antistoffen met de huidige technieken niet meer aantoonbaar zijn. Belang van temperatuur: Antistoffen die het beste reageren bij 37°C worden warmte antistoffen genoemd. Zij zullen bij lichaamstemperatuur de erytrocyten afbreken. Koude antistoffen reageren het beste bij een temperatuur beneden 30°C en geven meestal minder problemen dan de warmte antistoffen. Belang van het vermogen om het complement te activeren: Vooral complement bindende IgM-antistoffen zijn zeer gevaarlijk omdat zij het complement al in de bloedbaan activeren. Er ontstaan ‘gaten’ in de rode bloedcelmembraan waardoor hemoglobine weglekt. Dit noemt men intravasale hemolyse. Natuurlijk voorkomende anti-A en anti-B antistoffen zijn hier voorbeelden van. Dit onderstreept het belang van het toedienen van een passende ABO-bloedgroep! Het vrijgekomen hemoglobine wordt gebonden aan haptoglobine met als uiteindelijk doel het ijzer te recupereren. Haptoglobine is bijgevolg een parameter om intravasale hemolyse op te sporen. Als er meer hemoglobine vrijkomt dan er gebonden kan worden, wordt dit uitgescheiden door de nieren via de urine. Urine kleurt dan donker. Erytrocyten kunnen ook op een indirecte wijze worden afgebroken in de milt en in de lever. Dit noemt men extravasale hemolyse. - In de milt: gesensibiliseerde erythrocyten met IgG-antistoffen gebonden aan antigenen op hun membraan worden door macrofagen gevangen en vernietigd. - In de lever: antistoffen die complement gebonden hebben aan de erytrocyten waarbij de activatie gestopt is bij C3b geven geen hemolyse in de bloedvaten, maar deze erytrocyten zullen door macrofagen gefagocyteerd worden en in de lever afgebroken. @AP Hogeschool p 54 / 82  Figuur 52: aantonen van IgG en complement op gesensibiliseerde erytrocyten 11.4 Bloedgroepensystemen 11.4.1 Het ABO-bloedgroepensysteem Met het ABO-systeem moet ALTIJD rekening gehouden worden door de aanwezigheid van de natuurlijk voorkomende antistoffen. Een incompatibele transfusie kan leiden tot een zeer ernstige transfusiereactie. Het ABO-systeem bestaat uit 3 allelen: A, B en O. Bloedgroepen A en B zijn codominant terwijl bloedgroep O beide allelen mist. Er zijn dus 4 mogelijke bloedgroepen binnen het ABO-systeem: bloedgroep A, B, AB en O. Van bloedgroep A en B zijn een aantal subgroepen bekend. De belangrijkste zijn bloedgroep A 1 en bloedgroep A2. Het aantal A-antigenen op A1 erytrocyten is aanzienlijk hoger dan op A2 erytrocyten. Mensen met bloedgroep A2 kunnen antistoffen aanmaken tegen A1. Op dezelfde manier komen bloedgroepen A1B en A2B voor. Alhoewel de natuurlijk voorkomende antistoffen anti-A en anti-B steeds gevormd worden als de desbetreffende bloedgroep ontbreekt, kan de titer (of concentratie) wel verschillen van persoon tot persoon. Bij neonaten moet de antistofproductie nog op gang komen. Bij ouderen en bij mensen onder immuunsuppressietherapie zullen de titers zeer laag worden. Ook op andere bloedcellen kunnen de ABO-bloedgroepen tot expressie komen. @AP Hogeschool p 55 / 82  Figuur 53: ABO-bloedgroepen Uit kennislink, bloedtransfusie en afweer, Merlijn van Hasselt, foto Jos van den Broek, Leiden 11.4.2 Het rhesus-bloedgroepensysteem De oorspronkelijke benaming rhesus positief en rhesus negatief zegt alleen iets over de aan- of afwezigheid van het rhesus D-antigen. Daarnaast bevat het rhesussysteem nog meer antigenen waarvan C, c, E en e de voornaamste zijn. Het D-antigen is het meest immunogene antigen van het rhesussysteem en er wordt steeds rekening mee gehouden ingeval van een transfusie. Niet bij iedereen zijn er evenveel rhesus-D-moleculen aanwezig op de erytrocytenmembraan. Daarnaast bestaan er ook mutaties waarbij slechts een deel van het rhesus-D-antigen tot expressie komt. Als het aantal rhesus-D-antigenen aanzienlijk lager is dan normaal spreekt men van een zwak D-antigen. Als er een stuk ontbreekt van het D-antigen spreekt men van een partieel D-antigen of een rhesus-D-variant. De meest voorkomende variant is de zogenaamde klasse VI variant. Monoklonale IgM-antistoffen zijn tegenwoordig zo krachtig dat het missen van een relevant zwak D-antigen niet meer voorkomt. IgG-reagens wordt gebruikt voor het opsporen van de D-variant klasse VI. De volledige fenotypering rhesus-D, C, c, E en e wordt uitgevoerd om vrouwen jonger dan 45 jaar, patiënten met allo-antistoffen, auto-immuun hemolytische anemie, myelodisplastisch syndroom, sikkelcelanemie en thalassemie te kunnen transfunderen met cEK-compatibel bloed. @AP Hogeschool p 56 / 82  Antistoffen tegen het rhesussysteem worden meestal pas gevormd na immunisatie bij een zwangerschap of na een transfusie. Deze antistoffen kunnen tot ernstige transfusieproblemen leiden. Ze zijn meestal van het type IgG, optimaal werkzaam bij 37°C en niet complementbindend. 11.4.3 Andere bloedgroepsystemen De meeste bloedgroepen kunnen ingedeeld worden binnen 30 bloedgroepsystemen. Voor de praktijk is het niet nodig deze allemaal te bespreken. De belangrijkste systemen zijn: Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P en MNS. Binnen het Kell-systeem zijn K en k de belangrijkste allelen. Het Kell-antigen is na de ABO-bloedgroepen en het rhesus-D-antigen de meest immunogene bloedgroep. Het Kell-antigen is al vroeg in de ontwikkeling van de foetus aanwezig en Kell-antistoffen zijn meestal van het type IgG. Zodoende is dit dus een gevaarlijke antistof in het geval van de hemolytische ziekte van de pasgeborene (zie verder). 11.5 De bloedgroepbepaling in het labo Gezien het grote belang van een correcte bepaling van de bloedgroep om te voorkomen dat er incompatibel bloed wordt toegediend en de patiënt een transfusiereactie ontwikkelt, zijn er strikte richtlijnen vastgelegd. De juiste identificatie is cruciaal. Daarom dienen er twee afnames te gebeuren: op twee verschillende tijdstippen en door twee verschillende phlebotomisten. Op die manier zijn er twee identificatiemomenten waarop naam en geboortedatum van de patiënt gecontroleerd worden. Deze gegevens moeten ook overgenomen worden op de afnametubes zodat controle op het labo mogelijk is. De bloedgroepbepaling dient ook tweemaal uitgevoerd te worden in het labo. Uiteraard moeten de resultaten van deze bepalingen overeenstemmen. De bepaling bestaat uit twee gedeeltes: de aangetoonde antigenen op de erytrocyten moeten overeenstemmen met de te verwachten antistoffen in het serum van de patiënt. Deze laatste noemt men de tegenproef. De bloedgroepbepaling is tegenwoordig meestal geautomatiseerd. Men maakt gebruik van de kolommethode met behulp van gelkaarten. Deze bestaan uit kolommen gevuld met gel waarin zich antistoffen bevinden gericht tegen een welbepaald bloedgroepantigen. Bovenaan is er ruimte om bloed aan te brengen. Na centrifugatie is interpretatie mogelijk: als er binding is tussen antigenen op de erytrocyten en de aanwezige antistoffen in de gel, heeft er agglutinatie plaatsgevonden. De gevormde agglutinaten zijn te groot om door de gel te passeren en blijven bovenin de kolom hangen. De reactie is in dit geval positief. Als de erytrocyten kunnen passeren door de gel heeft er geen binding plaatsgevonden en hebben de erytrocyten dus geen antigenen die gebonden kunnen worden door de antistoffen in de gel. De reactie is m.a.w. negatief. @AP Hogeschool p 57 / 82  Figuur 54: voorbeelden bloedgroepbepalingen met tegenproef 11.6 Problemen bij de bloedgroepbepaling Bij de bloedgroepbepaling kunnen verschillende foutenbronnen er de oorzaak van zijn dat de resultaten niet overeenkomen met resultaten uit het verleden of dat er discrepanties gevonden worden tussen de resultaten op de erytrocyten en in het serum van de patiënt. Logistieke fouten De verkeerde patiënt werd geprikt (geen goede identificatie gedaan van naam en geboortedatum) De verkeerde etiketten werden op de buizen geplakt Er werden fouten gemaakt met het overschrijven of ingeven van de resultaten Technische fouten Te dunne of te dikke celsuspensie maken Geen of onvoldoende reagens toevoegen Contaminatie van het reagens Vervallen reagens gebruiken Incubatietijd niet respecteren Centrifugatie niet goed verlopen Hemolyse over het hoofd zien De oorzaak van de discrepantie kan ook patiënt gebonden zijn. Er kunnen verschillende oorzaken aan de basis liggen van onverwachts + of – reacties: Reacties van de cellen met de testreagentia zwak of negatief De bloedgroepantigenen zijn zwak Bij pasgeborenen aanwezig op de cellen Bij zeldzame varianten Mixed-field reactie: gemengde Na niet identieke transfusie populatie van erytrocyten die wél en Na beenmergtransplantatie die niet agglutineren @AP Hogeschool p 58 / 82  Reacties van serum/plasma met test-erytrocyten zwak of negatief Natuurlijk voorkomende antistoffen Leeftijd (heel jong/heel oud) ontbreken of titer heel laag Immuundeficiëntie Testcellen gehemolyseerd Aanwezigheid sterke hemolysinen Reacties van de cellen met de testreagentia positief Pseudo-agglutinatie of Door teveel of afwijkende immuun- geldrolvorming globulines (Kahler/Waldenström) Aanwezigheid Whartonse gelei Bij navelstrengbloed Verworven B-antigen Bij infecties in het maag-darmkanaal Reacties van serum/plasma met test-erytrocyten positief Koude antistoffen Bv bij (virus)infectie Irreguliere antistoffen Bij sterke antistoffen en hoge titer Pseudo-agglutinatie Door teveel of afwijkende Ig Antistoffen tegen bewaarmiddelen @AP Hogeschool p 59 / 82 11.7 Praktische uitvoering lab: ABO-bloedgroepbepaling (2MLT) De ABO-bloedgroep wordt bepaald met behulp van anti-A en anti-B testsera. De rhesus-D bloedgroep wordt bepaald met behulp van anti-D testserum. Tevens wordt een rhesus-controle bepaling uitgevoerd om aspecifieke positieve reacties op te sporen. De rhesus-controle moet negatief zijn, anders mag de uitslag van de rhesus- bepaling niet geïnterpreteerd worden. Tenslotte wordt ook een tegenproef uitgevoerd: serum van de patiënt wordt in contact gebracht met gekende A en B- cellen. DiaClon ABO/D en tegenproef Reagentia: ID-Card ABO/D + Reverse Grouping ID-Diluent 2 Testcellen: ID-DiaCell A1 en B-cellen in 0.8% suspensie Andere benodigdheden: Pipetten en tips Buisjes (voor suspensie bloed patiënt) Rekje (voor gelkaarten) ID-centrifuge Staal: EDTA-bloed voor de ABO/D-bepaling Plasma of serum voor de tegenproef Voorbereiding staal: Maak een 5% RBC suspensie in ID-Diluent 2: Pipetteer 0.5 mL ID-Diluent 2 in een buisje Voeg 50µL volbloed of 25µL packed cells toe Meng voorzichtig De suspensie is onmiddellijk klaar voor gebruik Testprocedure: Identificeer de gelkaart Hou de gelkaart verticaal en verwijder de aluminium afdekstrip Pipetteer 50 µL ID-DiaCell A1 in kolom 5 Pipetteer 50µL ID-DiaCell B in kolom 6 Pipetteer 50µL serum of plasma van de patiënt in kolom 5 en 6 Incubeer 10 minuten op kamertemperatuur Pipetteer 10µL RBC-suspensie van de patiënt in kolom 1, 2, 3 en 4 @AP Hogeschool