DNA Hasarı ve Onarım Mekanizmaları PDF

DNA HASARI VE ONARIM MEKANİZMALARI 1  DNA hasarı, DNA’nın yapısında meydana gelen kimyasal bir değişmedir. Hücre içinde kendiliğinden olan bu hasarlar aynı zamanda lezyon olarak da tanımlanmaktadır.  Baz silinmesi veya eklenmesi, baz yer değiştirmeleri, tek...

DNA HASARI VE ONARIM MEKANİZMALARI 1  DNA hasarı, DNA’nın yapısında meydana gelen kimyasal bir değişmedir. Hücre içinde kendiliğinden olan bu hasarlar aynı zamanda lezyon olarak da tanımlanmaktadır.  Baz silinmesi veya eklenmesi, baz yer değiştirmeleri, tek veya çift zincir kırılmaları ve zincir içinde veya zincirler arası bağların oluşması şeklinde DNA hasarları görülür.  Baz silinmesi ,eklenmesi, baz yer değiştirmeleri Açık Okuma Bölgesini (ORF) değiştirebilir. Bu durum düzeltilmeden kalırsa ve replikasyon gerçekleşirse yeni nesil hücrelere aktarılır ve mutasyon olarak adlandırılır.  DNA hasarı replikasyon sırasında tamir edilemezse mutasyona ve sonuç olarak genomik kararsızlığa, kanser ve yaşlanmaya neden olur.  Tüm organizmalar (bakteri, maya, drosophila, balıklar ve insanlar dahil), hücreleri çevresel hasarlara karşı korumak amacıyla DNA onarım mekanizması içerirler.  Tamir sistemleri DNA’nın yapısında meydana gelebilecek değişiklikleri tamir etmek için vardır. DNA hasarının genel sınıfları  Tek baz değişiklikleri (Konversiyon): DNA dizisini etkiler ancak DNA nın tüm yapısı üzerindeki etkisi küçüktür.  Deaminasyon: C nin amino grubunun oksijenle yer değiştirmesi C yi U ya dönüştürür. CG UG baz çiftine dönüşür.  Alkilasyon: Nitrozamin O6-metil guanin oluşturur, bu baz sıklıkla T ile yanlış eşleşir GC baz çifti AT baz çiftine dönüşür  Oksidasyon, radyasyon: güçlü oksitleyici ajanlar serbest radikalleri üreten iyonize radyasyon ve kimyasal ajanlar sayesinde üretilirler. Reaktif oksijen türleri; bir fazla oksijen atomu taşıyan 8-okzoguanin oluşturur. Bu insanda kansere yol açan en yaygın mutasyon olan GC TA transversiyonuna neden olur.  Kendiliğinden en sık meydana gelen ve en önemli olan hidrolitik zarar bazlardaki (özellikle sitozinde) amin grubunun yok edilmesi (deaminasyon).  Sitozindeki amin grubunun kendiliğinden yok olması → urasil (adeninle eşleşme)  Omurgalı DNAsında C yerine çoğu kez 5-metilsitozin bulunur. Metillenmiş C spontan mutasyonla GC baz çiftinin AT baz çiftine değişmesine neden olur ch8f17 5  DNA hasarının genel sınıfları  Yapısal bozulma:  UV ışığı: DNA dizisini etkiler ve komşu iki timinin T dimeri oluşumuna neden olur. T dimeri DNA sarmal yapısını bozar. Replikasyon ve transkripsiyonu engelleyebilir.  İnterkalasyon ajanları: Etidiyum bromür (EtBr) polisiklik halkalar içerirler ve DNA bazlarının arasına girerek çift sarmal yapıyı bozarlar, replikasyon sırasında insersiyon veya delesyona neden olabilirler.  Baz analogları: Normal bazların yerine geçebilirler. 5-bromourasil; T bazının anoloğudur. Normal replikasyon sırasında DNA ya sokulurlar ancak yanlış baz eşleşmelerine neden olurlar. 5-bromourasil T yerine G ile eşleşir ve GU baz çifti oluşturur.  DNA hasarının genel sınıfları  DNA omurgasının hasarı: Bir nükleotiddeki azotlu bazın kaybolması sonucu oluşan abazik bölgeleri ve çift zincir kırıklarını ifade eder.  Abazik bölgeler: Kararsız baz eklentilerinin oluşması nedeniyle spontan oluşurlar. Pürinlerde şeker pürin bağları nispeten kararsızdır. Suyun etkisiyle pürindeki N-glikozil bağının hidrolizi, DNA daki pürinsiz kalan yerde bir OH bırakır.  Çift zincir kırıkları: İyonize radyasyon ve bazı kimyasal bileşikler tarafından indüklenirler. İyonize radyasyon DNA daki deoksiriboz şekere doğrudan veya ROS aracılığı ile dolaylı olarak saldırır. Çift zinciri bozduğundan en tehlikeli DNA hasar tipine neden olur.  Hasar, DNA zincirlerinin bazen sadece birinde, bazen de ikisinde birden oluşabilir. Hasarın nerede ve nasıl ortaya çıktığına bağlı olarak, farklı türdeki DNA hasarlarına karşı farklı DNA tamir sistemleri vardır  Hücreler 3 temel stratejiye sahiptirler.  Hasarın bypass edilmesi  Hasarlı bölgenin eski haline döndürülmesi  Hasarlı DNA bölgesinin çıkarılarak yenisinin sentezlenmesi  DNA ONARIM MEKANİZMALARI: -Lezyon Bypassı-translezyon DNA sentezi  Daha yüksek bir mutasyon riskine rağmen replikasyonun engellenmesi ile ölümcül olabilecek bir durumu ortadan kaldıran ve hücrenin hayatta kalmasını mümkün kılan bir sistemdir.  DNA lezyonu yüksek doğruluklu polimerazlar yerine özelleşmiş düşük doğruluklu polimerazlar tarafından replike edilir. Bu polimerazlar kısa süreliğine yüksek doğruluklu olanların yerini alır.  E. coli de DNA pol IV ve V; insanlarda pol , , , ,   E. coli’de normal şartlarda DNA pol IV ve V sbulunmaz, translezyon sentezinde SOS yanıtının verilmesi için , yani sadece DNA hasarı oluştuğunda sentezlenirler.  İstisna olarak hataya meyilli pol  DNA zincirindeki T-T dimerini tanır ve oraya iki A ekler böylelikle T-T dimerini hatasız bir şekilde bypass eder  Polimeraz η (Pol η, POLH) Translesion DNA sentezi (TLS) kapsamında UV kaynaklı pirimidin dimerlerinin atlanması/bypass edilmesinde görev alır.  Polimeraz κ (Pol κ, POLK) ve Polimeraz ι (Pol ι, POLI) TLS. Pol κ ve Pol ι, hasarın yüksek olduğu ortamlarda replikasyon çatalının durmaması için devreye girer; ancak bu süreç hataya açık (error-prone) olabilir.  DNA ONARIM MEKANİZMALARI -Hasarlı Bölgenin doğrudan geriye döndürülmesi  T-T dimerlerinin fotoliyazla tamiri (fotoreaktivasyon)  Işık tamiridir  DNA daki pirimidin dimerlerinin oluşumuna yol açan UV hasarını düzeltir.  DNA fotoliyaz enzimi pirimidin dimerini birarada tutan kovalent bağı kırmak için foton enerjisini kullanır.  Memelilerde bu enzim yok, NER kullanıyoruz.  Xeroderma Pigmentosum (XP)  DNA ONARIM MEKANİZMALARI -Hasarlı Bölgenin doğrudan geriye döndürülmesi  DNA metiltransferazla hasarın tamiri  Metillenmiş O6-metilguanin bazının tamiridir.  O-6-Metil-DNA-alkiltransferaz enzimi hasarlı guaninden metil grubunun uzaklaştırılmasını katalizler.  Metiltransferazlar oldukça seçicidir ve DNA çift sarmalının küçük oluğuna bağlanarak küçük oluğu genişletir. Hasarlı baz enzimin aktif bölgesine doğru döner ve metil grubu uzaklaştırılır.  Metil grubunu alan metiltransferaz tekrar kullanılamaz, pahalı bir DNA hasar onarım tipidir.  DNA ONARIM MEKANİZMALARI -Hasarlı Bölgenin çıkarılması ve yeni sentez  Tek baz değişimleri (baz eksizyon ve yanlış eşleşme) tamiri  Yapısal bozuklukların (nükleotit eksizyon) tamiri  Çift-zincirli DNA hasarların tamiri  Baz eksizyon onarımı (BER)  Yanlış yerleştirilen ve hasarlı bazları uzaklaştırmak için kullanılan onarım mekanizmasıdır.  DNA glikozilaz enzimi görev alır  Deoksiriboz şekerinin N-glikozil bağını keserek hasarlı bazı DNA zincirinden uzaklaştırırlar (eksizyon) ve DNA üzerinde abazik bir bölge oluştururlar. 1. Hasarlı Bazın Tanınması ve Kesilmesi - DNA glikozilazlar adı verilen özelleşmiş enzimler, hasarlı ya da yanlış eşleşmiş bazı tanır. - İlgili baz ile şeker-fosfat omurgası arasındaki N-glikozidik bağı keserek hasarlı bazı çıkarır. Bu aşamada, DNA zincirinde “abazik” (AP, apürinik veya apirimidinik) bir konum oluşur. 2. AP Endonükleaz Aktivitesi - Oluşan AP bölgesini *AP endonükleaz* (örn. APE1) adı verilen enzimler tanır. - AP endonükleaz, şeker-fosfat omurgasında bir kesik (nick) oluşturarak eksizyonu başlatır. 3. Deoksiribo-fosfodiesteraz Aktivitesi - Kesik (nick) çevresindeki deoksiribo-fosfat kalıntıları temizlenir ve polimeraz enziminin yeni nükleotidi eklemesine uygun bir uç oluşturulur. 4. DNA Polimeraz Aktivitesi -DNA polimeraz β (Pol β)*, eksik bazın yerine doğru nükleotidi sentezleyerek boşluğu doldurur. - Bazı durumlarda DNA polimeraz δ veya ε gibi başka polimerazlar da devreye girebilir. 5. DNA Ligaz İşlemi Son olarak, *DNA ligaz* enzimi kesik bölgeyi (nick) onararak DNA omurgasını yeniden bütünleştirir. BER DNA yı urasil, hidroksimetilurasil, metilsitozin, hipoksantin, G-T yanlış eşleşmeleri, 3-metil adenin, 7-metil guanin, formamidoprimidin, 8- hidroksiguanidin, 5,6-hidrat timin, ve primidin dimerleri gibi çeşitli lezyonlardan korumak için oldukça önemlidir. Bunlardan her biri spesifik bir DNA glikozilaz tarafından tanınır.  Hatalı Eşleşme Onarımı (Mismatch Repair)  Bu onarım mekanizması, DNA replikasyonu esnasında meydana gelen ve çift sarmalda anormal boyutlara neden olan, normal bazların hatalı eşleşmesi şeklindeki hataları düzeltir.  E. coli’de hatalı eşleşme 7 proteinden oluşan bir sistem tarafından belirlenir: mutS, mutL, mutH, uvrD, ekzonükleaz I, SSB ve DNA polimeraz III  E. coli DNA’sında, (5')GATC dizisindeki adeninler özel bir metilaz olan “Dam Metilaz” tarafından metillenmiştir. Replikasyon esnasında kalıp zincir metillenmiş durumdadır.  Ancak, yeni sentezlenen zincir birkaç dakikalık bir gecikme ile metillenir.  Bu zaman sürecinde yeni zincirdeki hatalı eşleşen bazlar mutS tarafından tanınır.  Sırayla mutL ve mutH bir kompleks oluşturmak üzere sisteme katılırlar ve DNA boyunca çift yönlü olarak metilenmemiş bir GATC buluncaya kadar hareket ederler.  MutH’deki endonükleaz fonksiyonu metil grubunun karşısında metillenmemiş zincire bir çentik atmak üzere aktive olur.  Metillenmemiş zincir, ekzonükleaz I, SSB ve uvrD helikaz’ın birlikte uzaklaştırılır.  DNA polimeraz III doğru DNA zincirini tekrar oluşturur ve ligasyon ile onarım sona erer.  Nükleotit eksizyon onarımı (NER)  DNA bazları üzerinde büyük eklentiler oluşturan birçok çeşit hasarı tanıyabilen bir onarım mekanizmasıdır.  Mikoplazmadan memelilere kadar geniş bir yelpazedeki organizmalar tarafından kullanıldığı belirlenmiştir.  Birçok DNA hasarının özellikle de geniş hasara neden olanların onarımında etkindir.  İnsanlarda güneşten gelen UV ışığının karsinojenik etkilerine(dimerler) ve sisplatin, 4- nitrokuinolin oksit gibi etkenlerle reaksiyon sonucu oluşan büyük eklentili hasarlara karşı önemli bir savunma mekanizmasıdır. NER mekanizmasının anahtarı;  Hasarın tanınması  Protein kompleksinin hasarlı bölgeye bağlanması  ~24-32 nükleotid uzunluğunda bir fragment içinde bırakacak şekilde lezyonun her iki tarafından hasarlı zincirin kesilmesi (incision)  Degradasyon (hasarı içeren oligonükleotidin uzaklaştırılması)  DNA sarmalı üzerinde meydana gelen boşluğun DNA polimeraz tarafından doldurulması (polimerizasyon)  Ligasyon  DNA çift-zincir kırığı onarımı  DNA çift zincir kırığının kaynakları: İyonize radyasyon, topoizomeraz inhibitörleri (etoposide, adriamycin), V(D)J rekombinasyonu.  DNA çift zincir kırıkları (DSBs), DNA hasarının en yıkıcı şeklidir.  Onarılmazsa kromozomların kırılmasına ve hücre ölümüne varan sonuçlar doğurabilir.  Yanlış onarılırsa kromozom translokasyonuna ve kansere sebep olur.  DSBs’ye neden olan en önemli eksojen ajan iyonize radyasyondur. Ayrıca radon bozunumu ve antikanser ilaçlar da etkilidir. Oksidatif serbest radikaller oluşturan Bleomisin, Adriyamisin, Etoposit topoizomeraz II yi inhibe ederek protein köprülü DSBs’ler meydana getirirler. DSBs oluşturan endojen ajanlar ise serbest radikaller  Homolog rekombinasyon ve Homolog olmayan rekombinasyon yollarıyla tamir edilir. Homolog rekombinasyon  Prokaryotlarda ve tek hücreli ökaryotlarda çift zincir kırıklarında önemli rol oynar  Çok hücreli ökaryotlarda bu açıdan daha az öneme sahiptir  Kırılmış bir zincir bölgeleri zarar görmemiş homolog kromozomda bulunan zincir kullanılarak tamir edilebilir. 24 Homolog olmayan rekombinasyon- homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) Bu tip onarım mekanizmasında aynı kromozoma sahip olup olmadığına bakılmaksızın iki kırık uç tamir mekanizması tarafından yapıştırılabilir ve bu homolog olmayan uç birleştirme kırık bölgesinde genellikle insersiyon veya delesyonla sonuçlanır. Bu hayatta kalmaya karşı ödenen bir bedeldir. DNA zincirlerinin değiştokuşuna ihtiyaç duymaz. 25 (NHEJ) Memeli Yolağı Ku: Ku70 ve Ku80 dimeri DNA-PKcs: DNA-bağımlı protein kinaz katalitik altbirimi ATM ve ATR içeren protein kinaz ailesi üyeleri Sinapsis mikrohomoloji ile sağlanır. Uçlarla ilgili süreçte etkin olan faktörller? MRN bir Mre11/Rad50/Nbs1 kompleksidir. Xrcc4/DNA ligaz IV son ligasyon basamağında gereklidir. Hata-eğilimli (Error-prone); Küçük insersiyon ve delesyonlar. Major 26 pathway of DSB repair in mammals, minor pathway in yeast.Further reading: Lees-Miller & Meek, Biochimie 85, 1161 (2003)  DNA hasarına biyolojik tepki Hücre döngüsü durdurulur, onarım ya da hasar toleransı için gereken zaman sağlanır. Doğrudan ya da dolaylı olarak onarım Cell-cycle veya hasar toleransına katılan bazı checkpoint genlerin transkripsiyonel ve post- transkripsiyonel upregülasyonu (aktivasyonu) activation Transcrip- tional Repair activation DNA Baz hasarının geri dönüşümü Farklı tepkili Çoklu genler Hasar gören bazı çıkarılması STRES CEVABI DAMAGE Yanlış eşleşme onarımı Zincir kırılması onarımı Programlı hücre ölümü ; büyük mutasyon zararı görmüş veya büyük çaplı genom kararsızlığına maruz Damage Apoptosis kalmış çok hücreli Tolerance organizmaları temizleyebilir. Replikasyon bypass 27 Hatasız Friedberg, EC AJP September 2000, Vol. 157, No. 3 Hata eğilimli (MuTAGENEZ)