DNA Tamir Mekanizmaları PDF

DNA HASAR TAMİRİ Dr. Fatma Zehra Hapil Zevkliler Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Öğrenim Hedefleri ◦ DNA hasarının nedenleri ◦ DNA hasar tamirinin ana mekanizmaları ◦ DNA hasarının hangi koşullarda hangi tamir mekanizması ile giderildiği ◦ Direkt onarım ◦ Yanlış eşleşme o...

DNA HASAR TAMİRİ Dr. Fatma Zehra Hapil Zevkliler Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Öğrenim Hedefleri ◦ DNA hasarının nedenleri ◦ DNA hasar tamirinin ana mekanizmaları ◦ DNA hasarının hangi koşullarda hangi tamir mekanizması ile giderildiği ◦ Direkt onarım ◦ Yanlış eşleşme onarımı ◦ Baz çıkarılma tamir mekanizması ◦ Nükleotid çıkarılma tamir mekanizması ◦ Homolog rekombinasyon ◦ Non-homolog uç birleştirme  UÇEP Hastalık İlişkisi ◦ Abortus ◦ Aplastik anemi ◦ Deri tümörleri ◦ Doğuştan yapısal anomaliler ◦ Gastroinstestinal konjenital anomaliler ◦ Gastrointestinal sistem tümörleri ◦ Hipofiz bozuklukları ◦ İntrauterin büyüme geriliği ◦ Kolorektal tümörler ◦ Konjenital kalp hastalıkları ◦ Lösemiler ◦ Lenfoproliferatif hastalıklar ◦ Meme hastalıkları ve tümörleri ◦ …. DNA HASARININ NEDENLERİ İç Etkenler: (endojen) Dış Etkenler (ekzojen) ◦ Yanlış eşleşmeler ◦ Kimyasal ajanlar ◦ Aflatoksinler, alkilleyici ◦ Kimyasal Değişiklikler ajanlar, benzopiren (sigara ◦ DNA bazlarında deaminasyon veya dumanı), kemoterapi metilasyon ajanları, vinil klorür vs ◦ Baz kayıpları ◦ Fiziksel ajanlar ◦ Güneş ışığı (UV radyasyon) ◦ Depürinasyon, depirimidasyon ◦ İyonize radyasyon (X ◦ Oksidatif hasar ışınları) DNA HASARININ SONUÇLARI ◦ DNA hasar tamiri ◦ Hücre döngüsü kontrol noktalarının aktivasyonu ◦ Transkripsiyonel aktivasyon ◦ Apoptoz DNA HASAR TAMİRİNİN ANA ADIMLARI Hasarın tanınması Hasarlı kısmın çıkarılması Boşluğun doldurulması ANA TAMİR MEKANİZMALARI Kesip çıkarma tamir mekanizmaları Baz çıkarma (base excision) Nükleotid çıkarma (nucleotide excision) Direkt onarım mekanizmaları Fotoreaktivasyon DNA alkilasyonunun onarımı Basit tek zincir kırıklarının ligasyonu Yanlış eşleşme onarımı (mismatch repair) Çift zincir kırık tamiri Kesip çıkarma tamir mekanizmaları Hasar veya hatanın tanınması Hasarlı bölgenin bir nükleaz tarafından enzimatik olarak çıkartılması DNA polimerazın oluşan boşlukları doldurması DNA ligaz’ın eksik kalan son bağı kurarak zinciri tamamlaması  Baz çıkarma tamir mekanizması (BER) ◦ Hücre döngüsünün G1 fazında ◦ DNA heliks yapısını ciddi şekilde bozmayan küçük baz bozulmalarında (doğal süreç ya da çevresel etmenler –kimyasallar, sitostatik ajanlar vb-) ◦ Oksidasyon, alkilasyon, deaminasyon ◦ DNA’da Uracil varsa (sitozinin deaminasyonu ile oluşabilir ya da timin yerine DNA’ya girmiş olabilir) ◦ Deaminasyon örn. Nitrit ve nitratın alt ürünü nitroz asit nedeniyle oluşabilir. ◦ Nüklear ve mitokondriyel DNA Mekanizma Lindahl’ın 1974’de uracil ve deoksiriboz arasındaki bağı kıran enzimi keşfetmesi ile açığa çıkmış.  Baz çıkarma tamir mekanizması (BER) ◦ DNA glikozilaz tarafından bozuk baz çıkartılır (baz ve şeker arasındaki bağ) ◦ Bu şekilde AP bölgesi oluşmuş olur. ◦ AP (a purine or a pyrimidine) endonükleaz, eksik baz bölgesini (AP bölgesi) tanıyıp fosfodiester iskelette kırık oluşturur) ◦ İki ana yolağı vardır: kısa yama tamiri ve uzun yama tamiri. (5’ deoksiribo-fosfat’ın durumuna göre karar verilir.) Kısa: tek nt, uzun: 2-10nt ◦ Eksilen baz, karşı zincir kalıp olarak kullanılarak DNA polimeraz tarafından tekrar eklenir ◦ DNA ligaz boşluğu doldurur. Polimeraz beta’nın, dRPaz aktivitesi var (baz olmayan şeker-fosfat iskeletini kırma akt), eğer bu hasar alırsa LP baskın, ilk glikozilaz da etkiliyor (bunun seçimi de hasara göre değişiyor). LP’de sentez için replikasyon enzimleri kullanılıyor. Nükleotid çıkarma tamir mekanizması (NER) ◦ DNA çift sarmal yapısında bozulmalara neden olan mutasyonlar ◦ UV radyasyon nedeniyle oluşan timin dimerleri ◦ Sigara dumanı nedeniyle oluşan benzopiren-guanin baz değişimleri ◦ Kemoterapotik ajanlar nedeniyle oluşan baz değişimleri ◦ Kseroderma pigmentosum ile ilişkisi 1968’de gösterilmiş ◦ Deri tümörleri ile direkt ilgili. Neden?  Timin Dimerleri ◦ UV ışığa maruz kalan komşu iki pirimidin (genellikle timinler) arasında kovalent bağlanma olabilir. Bu şekilde oluşan timin dimerleri replikasyonu bloke eder. NER, replikasyon blokajı nedeniyle S fazında, Transkripsiyon blokajı nedeniyle hücre döngüsünün diğer fazlarında gerçekleşebilir.  Ökaryotik NER ◦ global NER (genomda herhangi bir yerde ◦ transcription-coupled NER (transkripsiyon gerçekleşebilir) esnasında –hızlandırılmış tamir-) ◦ Hasarın tanınması: XPC-Rad53b ve UV-DDB ◦ Hasarın tanınması: RNA polimeraz II (hasar (UV damaged DNA binding protein) bölgesinde durur) ve CSA, CSB, XAB2 ◦ Alkillenmiş guanin nükleotidinin, ATL proteini tarafından tanındığı 2012 yılında gösterilmiş. O6- methylguanine DNA methyltransferase alkil grubu uzaklaştıramazsa NER ile tamir oluyor (2019, PMID: 31167778)  Ökaryotik NER ◦ DNA çift sarmalının açılması: Transkripsiyon faktörü IIH’nin alt üniteleri olan XPD ve XPB, helikaz aktivitesiyle DNA çift zincirinin açılmasını sağlar. ◦ Hasarlı bölgenin çıkartılması: XPD’nin bağlanması sayesinde, XPA, RPA, ve XPG komplekse gelir, XPC- Rad53B bölgeden uzaklaşır. XPA, bölgeye ERCC1-XPF’i çeker. ◦ ERCC1-XPF, hasarlanmış bölgeyi 5’ ucundan, ◦ XPG hasarlanmış bölgeyi 3’ ucundan keser. XP proteinlerinin mutasyonu: Xeroderma Pigmentosum  Ökaryotik NER ◦ Boşluğun doldurulması: XPG tarafından 3’ uç kesildikten sonra başlar. Boşluğun doldurulmasında RPA, RFC, PCNA, DNA polimeraz delta (δ) ve epsilon (ε) rol oynar. ◦ DNA ligaz ile ligasyon gerçekleşir. ◦ Not: Kromatin yeniden modelleme proteinleri de NER üzerinde etkiye sahip (kromatin yapının açılması gerekiyor). NER tamamlandığında, kromatin yapı tekrar oluşur. XP proteinlerinin mutasyonu: Xeroderma Pigmentosum Yanlış eşleşme onarımı (mismatch repair) ◦ DNA’nın iki zinciri arasında baz uyumsuzluğu olduğunda. ◦ Aslında ökaryotik DNA polimerazın proofreading aktivitesi var. Fakat yine de yanlış eşleşme kalırsa (olasılık 1/10^4-5), bu MMR ile düzeltiliyor. ◦ Özellikle karşı bazda bir modifikasyon varsa karşısına hatalı baz eklenebiliyor.Ya da uzun tekrar dizilerinde. Bu durumlar yoksa olasılık 1/10^10 ◦ Bir diğer neden de tamir sonrası DNA: hasar tamirindeki DNA polimerazların proofreading aktivitesi düşük. ◦ Hasarın Tanınması: Kalıp zincir ve yeni sentezlenen zincirin birbirinden ayırt edilmesini, prokaryotlarda kalıp zincirdeki DNA metilasyonu, ökaryotlarda ise replikasyon esnasında oluşan kırıklar sağlar (yeni sentezlenen zincirde kırıklar kalır). ◦ Ökaryotlarda sürekli zincir Polε, kesikli zincir ise Polδ tarafından sentezleniyor. ◦ Kesikli zincirde zaten kırıklar var (Okazaki fragmentleri) ◦ Devamlı zincirde ise bazen deoksiribonükleotid yerine ribonükleotid eklenir ve bunlar RNAz H2 tarafından kırılır.  Prokaryotlarda Yanlış eşleşme onarımı ◦ Dam metilasyonu: Kalıp zincirdeki 5’GATC dizinlerindeki adeninlerin N6 pozisyonundan metillenmesi Dam metilaz tarafından gerçekleştirilir. ◦ Yeni sentezlenen DNA hemen metillenemez. Uyumsuzluk varsa, yeni DNA’nın düzeltilmesini sağlar. ◦ MutS, MutH, MutL proteinleri ◦ MutS, hatayı tanıyan protein (kısa indel’ler, yanlış bazlar vs). MutL proteini MutS ile kompleks oluşturarak hatalı bölgeye bağlanır ◦ Tanıyor çünkü eşleşmede hata varsa H bağı kurulamıyor. ◦ MutH (endonükleaz) da bu komplekse bağlanır: metillenmemiş zincirde GATC dizisinin 5’ ucundan kırılmayı gerçekleştirir. ◦ DNA helikaz, DNA ekzonükleaz 1 ve tek sarmal DNA bağlayıcı protein (SSBP). Hataya kadar olan bölge çıkartılır. ◦ Kalan boşluk DNA polimeraz III ile doldurulur ve DNA ligaz tarafından yapıştırılır. Ökaryotlarda Yanlış eşleşme onarımı ◦ Ökaryotlarda MutS’in 3 (hMSH2/3/6), MutL’nin 4 (hMLH1/3, hPMS1, hPMS2) homoloğu var. Bu genlerin mutasyonları, herediter non-polipozis kolon kanseri (HNPCC) ile ilişkili bulunmuş. (MutH homoloğu yok) ◦ MutSα (Msh2/Msh6) tek baz uyumsuzluklarını ve tek nükleotidlik indel’leri tanır. MutSβ (Msh2/Msh3) ise tek nt veya daha uzun indel’leri tanır. ◦ MutS, MutL ile bağlanıp kayan kelepçe yapısını oluşturur. ◦ PCNA (Replikasyonun kayan kelepçe (sliding clamp) proteini (proliferating cell nuclear antigen)) kırıkların 5’ tarafına bağlıdır. MutS-MutL kelepçesi, PCNA’ya kadar kayar. Bu hareket EXO1 ekzonükleazı bölgeye çeker. (PCNA’ya yakın yerleşen RPC gider, yerine EXO1 gelir) ◦ EXO1, ekzonükleaz, hasarlı bölgeyi keserek uzaklaştırır. Diğer zincir RPA ile sabitlenir. ◦ DNA polimeraz boşluğu doldurur. ◦ DNA ligaz onarımı tamamlar. RPA: replication protein A DIREKT ONARIM MEKANIZMALARI Direkt Onarım Mekanizmaları ◦ Timin dimerleri (bu şekilde tamir edilemezse NER) ◦ Alkillenmiş bazlar ( bu şekilde tamir edilemezse BER) ◦ Zincir kırılmadan hasar onarılır: ◦ Fotoreaktivasyon ◦ DNA alkilasyonunun onarımı ◦ Basit tek zincir kırıklarının onarımı ◦ DNA ligaz Fotoreaktivasyon ◦ Timin dimerleri, prokaryot ve ökaryotlarda (memelilerde yok  ) bulunan fotoliyaz enzimi katalizi ile monomerlerine çevrilir. ◦ Fotoliyaz enziminin iki kofaktörü var: MTHF ve FAD ◦ UV ışık (100-400nm) maruziyeti ile oluşan timin dimerleri, mavi spektrum (300-600nm) içeren görünür ışığa maruz bırakıldıklarında: ◦ MTHF, görünür ışığı emer ve ekzite olur ve FAD’a elektron transfer eder (FAD→ FADH2) ◦ FADH2, (electron transporter), aldığı serbest elektronu DNA’ya iletir. Timin (pirimidin) dimerleri stabil olmadığı için, bu electron transferi ile dimer yapısı ayrılır. ◦ DNA tamir olmuş olur. DNA alkilasyonunun onarımı ◦ Alkilleyici ajanlar varlığında Guanin → O6-metil guanin, tamir edilmezse, C yerine T ile bağlanacağı için G-C baz çiftinin A-T baz çiftine dönüşmesine yol açar. (mutajenik) ◦ Direkt onarım, DNA metil transferaz tarafından yapılır. ◦ DNA metil transferaz, Guanin’e bağlı olan metil grubunu, kendi yapısındaki sistein aminoasidine transfer eder. ◦ Bu sayede enzim inaktive olur. ◦ Bu enzim inaktive olunca, bazı genlerin ekspresyonu artar (DNA hasar tamir genleri)  ÇİFT ZİNCİR KIRIKLARININ ONARIMI Çift zincir kırıklarının onarımı ◦ İyonize radyasyon, topoizomeraz inhibisyonu vb ◦ Çift zincir kırıkları onarılmazsa i) apoptosis, ii) genomic instabilite (kanser) olur. ◦ Homolog rekombinasyon (homology directed repair: HDR) ◦ Yüksek doğruluk oranı ◦ Tamirde homolog kromozom kalıp olarak kullanılıyor (KO ve rekombinasyon dersi) ◦ S ve G2 fazında gerçekleşir (mitozdan hemen önce ve sonra, kardeş kromatidler erişilebilirken) ** bölünmeyen hücrelerde gerçekleşmez!! ◦ Homolog olmayan uç yapıştırma (Non-homologous end joining: NHEJ) ◦ Küçük insersiyon ve delesyonlar (indel) oluşabilir. ◦ Mikro-homoloji aracılı uç yapıştırma (microhomology mediated end joining: MMEJ) ◦ Mikrohomolog dizileri kullanarak dizileri hizalar. Bu, NHEJ’de oluşandan daha büyük indel’lere sebebiyet verebilir)  NHEJ (Homolog olmayan uç yapıştırma) ◦ Bölünen ve bölünmeyen hücrelerde gerçekleşebilir, hücre döngüsünden bağımsız! ◦ V(D)J rekombinasyonu (bağışıklık sistem çeşitliliği) ◦ Ökaryotik Ku proteini (K70+Ku80), kırık bölgesini tanıyıp bağlanır. Ku heterodimeri, tamir için gerekli proteinleri kırık bölgesine çeker. Aynı zamanda kırık bölgesini alakasız ekzonükleazlar tarafından degrade edilmekten korur. ◦ Ku proteini kırık bölgesinde DNA-PKc ile kompleks yapar (DNA-PKc, memelilere özgü bir protein). DNA-PKc otofosforilasyonla aktive olur (Bu bir S/T kinaz, H2Ax ve diğer hedefleri fosforile eder. ) ◦ Ku heterodimeri ayrıca bölgeye NHEJ için gereken diğer proteinleri (XRCC4, XLF, APLF, Ligaz IV) de çeker ve büyük bir protein-protein kompleksi oluşmuş olur. ◦ Uç stabilizasyonu bu şekilde sağlandıktan sonra, uç işleme yapacak proteinler (örn. Artemis) ve DNA polimeraz mü ve sigma bölgeye gelir. ◦ Kırık bölgesinde ligasyona izin vermeyecek 5’ hidroksil ya da 3’ fosfat grupları varsa, uç işleme yani kontrollü degradasyon gerekir. ◦ Artemis, DNA-PKc tarafından fosforilasyonla aktive edilir ve nükleaz aktivitesi ile uç kırpılmasını (uç işleme) sağlar. ◦ DNA polimeraz, boşluğu doldurur. İlk baştan beri komplekse gelmiş bulunan Ligaz IV, son boşluğu kapatır. Homolog rekombinasyon (HDR) ◦ Homolog rekombinasyon, çift zincir kırığına MRN kompleksinin çekilmesi ile başlar (MRN: Mre11, Rad50, Nbs1) ◦ MRN kompleksinin nükleaz aktivitesi var ◦ MRN, bölgeye ATM’i (S/T kinaz) çeker. ◦ ATM, H2AX dahil olmak üzere birçok hedefi fosforile eder (Fosforilasyon hedefleri DNA-PKc ile aynı) ◦ Bu fosforile histonlar, DNA’nın kırpılması için sinyal görevi görür (End resection) ◦ Komplekse bağlanan diğer proteinler, BRCA1 ve BRCA2’yi çeker ◦ BRCA1 ve BRCA2, tümör baskılayıcı genlerdir (meme kanseri) ◦ Rad51: Rekombinaz ◦ RPA, fosforile histonlara bağlanıp tek zincir DNA’yı stabilize eder. Homolog rekombinasyon (HDR) ◦ Rad51, RPA’yı (tek zincir DNA’yı stabilize eden molekülü) uzaklaştırır. ◦ Homoloji aranır, homoloji bulunan bölgede Rad51 sayesinde zincir işgali (strand invasion) başlatılır ve D-loop kurulur. Homolog rekombinasyon ◦ hasarlı DNA molekülünde ortaya çıkan 3’ uçlardan biri, kalıp DNA’yı «işgal eder» ◦ DNA polimeraz, sağlam ipliği kalıp alarak zinciri uzatır ◦ işgalci iplik ayrılır, DNA uçları birleştirilir Gözden geçirelim: ◦ DNA 3 boyutlu yapısının bozulmadığı küçük baz bozulmaları (örn DNA’da Uracil varsa) hangi DNA tamir mekanizması ile giderilir? ◦ UV maruziyetine bağlı olarak DNA’da hangi hasar meydana gelir? ◦ Bu hasar hangi yolla giderilir? ◦ Transkripsiyonla aynı anda gerçekleşebilen hasar tamir mekanizması hangisidir? ◦ Bölünmeyen, terminal diferansiye hücreler iyonize radyasyona maruz kaldığında hangi tamir mekanizması ile DNA hasarı giderilir? ◦ G1 checkpoint’de, DNA’nın 3 boyutlu yapısında bir bozukluk fark edilirse hangi tamir mekanizması devreye girer? ◦ Çift zincir kırıklarının tamirinde en yüksek doğruluk oranına sahip tamir mekanizması hangisidir? Hücre döngüsünün hangi evrelerinde aktiftir? ◦ DNA hasar tamirinin son aşamasında devreye giren, basit tek zincir kırıklarının doğrudan onarımında da rol oynayan enzim hangisidir? Gözden geçirelim: ◦ Ailesel meme ve over kanserinde rol oynayan onkogenler BRCA1 ve BRCA2, hangi hasar tamir mekanizmasında görev almaktadır? ◦ NHEJ hangi protein kompleksinin çift zincir kırık bölgesine bağlanması ile başlar? ◦ HDR, hangi protein kompleksinin çift zincir kırık bölgesine bağlanması ile başlar? ◦ HDR ve NHEJ’de, H2AX’I fosforile ederek hasar bölgesini işaretleyen enzimlerin adları nelerdir? ◦ DNA alkilasyonu (guanin’e metil grubu takılması)’nun direkt onarımında hangi enzim rol oynar? ◦ DNA alkilasyonu bu şekilde tamir edilemezse hangi tamir mekanizması devreye girer? ◦ Benzopiren maruziyeti sonrasında DNA’da oluşan hasar hangi yolla giderilir? Bu tamir esnasında yeni sentezlenen zincirde kalıp zincirden farklı bir eşleşme olursa bu defa hata hangi mekanizma ile giderilir? ◦ Yanlış eşleşme onarımında, kalıp zincir ve yeni sentezlenen zincir ayrımı prokaryotlarda nasıl yapılır? ◦ Yanlış eşleşme onarımında, kalıp zincir ve yeni sentezlenen zincir ayrımı ökaryotlarda nasıl yapılır? ◦ Bütün hasar tamir mekanizmalarında ortak olan proteinler hangileridir? KATILIMINIZ IÇIN TEŞEKKÜR EDERIM Sorular?