Clase: Dinámica Celular ITBA PDF

Clase: Dinámica Celular Biología Celular y Molecular BIOINGENIERIA ITBA - Prof. Baidanoff, FM.  Objetivo de la clase 1. Comprender el flujo de las proteínas entre diferentes comportamientos celulares en eucariotas. 2. Explicar la dinámica celular lograda a trav...

Clase: Dinámica Celular Biología Celular y Molecular BIOINGENIERIA ITBA - Prof. Baidanoff, FM.  Objetivo de la clase 1. Comprender el flujo de las proteínas entre diferentes comportamientos celulares en eucariotas. 2. Explicar la dinámica celular lograda a través del accionar coordinado de: – Citoesqueleto – Membranas – Matriz extracelular. 3. Describir las uniones célula/célula y célula/matriz con perspectiva multicelular.  Compartimentos intracelulares y tráfico de macromoléculas.  Tránsito de las proteínas La síntesis de las proteínas se da por la acción de los ribosomas – Ribosomas libres en el citosol: Proteínas citosólicas Proteínas translocadas a organelas – Ribosomas unidos al retículo endoplasmático rugoso: Péptido señal de importación al ER. Direccionamiento hacia diferentes compartimentos se dará por: – Co-translocación durante la traducción – Translocación post-traducción PROTEÍNAS co-translocada/traducidas hacia el ER Proteína a exportar Proteína de membrana (queda suelta en el lumen del ER) (diversidad: transmembrana simple o múltiple, extremos C y N terminal hacia un lado específico) Péptidos señales en proteínas de paso múltiple. Cuando una proteína presenta múltiples señales (péptidos señales) de importación y exportación al ER consecutivamente, el péptido “Entra” y “Sale” de la membrana varias veces, generando un tipo de proteína integral de membrana con múltiples pasos. Las secuencias de aminoácidos que está en contacto con la parte membranosa son de naturaleza hidrofóbica.  Lipoproteínas de membrana Uniones a través del Glico-fosfatidil-inositol (GPI). Un tipo de modificación post- traduccional de proteínas. Proteínas glicosiladas por transferasas Transfieren la parte glucosídica de los glucolípidos a residuos de asparagina en las proteínas en el retículo endoplasmático (ER). El «árbol base» de azucares es luego editado en el Golgi hasta su versión final. Maduración de las Modificaciones postraduccionales por glicosilaciones Las glicosilaciones de las proteinas y de lípidos comienzan en el ER y terminan en el Golgi. Recientemente se ha descubierto ARN glucosilado en membrana, aunque poco se conoce su mecanismo. Proteínas mitocondriales. Las proteínas mitocondriales son producidas a partir de la información genética nuclear y a partir del ADN mitocondrial. Péptidos señales permiten su posicionamiento final.  Ruta del tráfico de proteínas: El transporte a través de la compuerta llamada “poro” nuclear, es un tipo de transporte activo específico. Transporte transmembrana: proteínas se translocan a través de la membrana. Transporte vesicular: las proteínas son transportadas de un compartimento al siguiente vía vesículas.  Clasificación del transporte vesicular dependiendo del sentido del transporte: SECRETORA (o exocítica), proteínas producidas en el ER y que se movilizan hacia el exterior celular (de forma directa o vía vesículas) o hacia el sistema endosoma/lisosoma. ENDOCÍTICA, proteínas incorporadas desde el espacio extracelular metabolizadas vías sistema endosoma/lisosoma. BACKFLOW, movimiento de lípidos que recomponen las membranas de las organelas (ER, Golgi, etc.) Vía Secretora: Constitutiva o Regulada Las proteínas de membranas que contiene cada vesícula permite vincularla al citoesqueleto. Clatrina, COPI y COPII son proteínas de membranas que se vinculan con el citoesqueleto (proteínas adaptadoras/proteínas motoras/microtúbulo), permitiendo el movimiento de vesículas y el posicionamiento de las organelas. COP: coat complex protein I TRANSPORTE VESICULAR DE PROTEÍNAS Y LÍPIDOS ¿Qué componente de la célula permite a las células adquirir morfologías particulares, trasladarse e incluso movilizar organelas en su interior? CITOESQUELETO CITOESQUELETO 1) Microtúbulos de Tubulina 2) Filamentos de Actina 3) Filamentos Intermedios  Citoesqueleto proteínas que se multimerizan/polimerizan Las macroestructuras del citoesqueleto se forman cuando las subunidades monoméricas peptídicas ganan afinidad entre sí y se transforman en complejos fibrosos: - Microfilamentos de Actina - Microtúbulos de Tubulina - Filamentos Intermedios. Microfotogafía en microscopio de fluorescencia de células eucaritoas macadas por inmunofluorescencia con anticuerpo anti-actina (rojo), anti-tubulina (verde) y tinción con DAPI (afinada por al ADN, azul) CITOESQUELETO CITOESQUELETO 1) Microtúbulos de Tubulina 1) Microtúbulos de Tubulina: Son filamentos polarizados (extremos distintos). Consiste en cilindros huecos conformados por la polimerización del heterodímero de α y β tubulina cuando están unidas a GTP. Crecen y decrecen por su extremo CAP (extremo rico en heterodímero con GTP) La polimerización se dará mientras haya GTP y el CAP no se pierda. Si se remueve ese CAP (por ej por la acción de alguna enzima) se produce un fenómeno de despolimerización. Este fenómeno ocurre desde el extremo + al -, es un proceso espontáneo.  Microtúbulos de Tubulina Principales funciones: Transporte intracelular de organelas recubiertas de membranas y vesículas coordinadas desde el centro organizador de los microtúbulos. Segregación de cromosomas durante la mitosis/meiosis desde el centrosoma (centriolos y matriz peri-centriolar) Organización y manutención de la forma celular y polaridad, Conforman estructuras de locomoción como cilios y flagelos.  Centrosoma vs Centro Organizador de los Microtúbulos En organismos multicelulares, cuando las células están diferenciadas cumpliendo su rol en el tejido, no se encuentran dividiendo y por lo tanto sus Microtúbulos (MT) pueden estar siendo controlados independientemente del centrosoma (centriolos y matriz pericentriolar). Se dice entonces que el Centro Organizador de los Microtúbulos (MTOC, por sus siglas en inglés) es no-centrosomérico. Por el contrario, las células madre se encuentran en activa división celular y por lo tanto deben coordinar los MT a través de la generación del huso mitótico (centrosoma + MT) cuando entran en mitosis o meiosis. Célula Diferenciada. Cuándo la célula no se divide su MTOC no está coordinado Célula Madre por el centrosoma. que entra en división, tiene a sus MT coordinados por el Centrosoma. Centrosoma: Centriolos + Matriz centrosómica Los centriolos están conformados por una estructura de tripletes de microtúbulos conectados por fibrillas radiales y conectoras que permiten junto con la matriz centrosómica (o material pericentriolar) la nucleación de los de los extremo – de los microtúbulos durante la división celular.  Movimiento vesicular El transporte vesicular involucra la acción conjunta del citoesequeleto de tubulina, sus proteínas motoras que interactúan con proteínas de membrana del ER y el Golgi. La cara cis del Golgi recibe las vesículas del ER y durante la migración hacia la cara trans las proteínas producidas sufren modificaciones post-traduccionales por glucosilación tránsito dependiente y finalmente sale como vesícula hacia la membrana plasmática (de forma constitutiva o regulada) u hacia otras organelas (ej lisosomas).  Migración de vesículas por acción de Microtúbulos y sus proteínas motoras Kinesinas y Dineínas transportan un «cargo» celular (cromosomas, organleas, vesiculas) usando como «camino» al microtúbulo de tubulina. Las Dineínas transporta hacia el extremo Video recomendado Crash Course (7min) menos y las Kinesinas hacia el extremo mas Para los interesados en motores moleculares: 3 cap 35min c/u iBiology Protein Motors I iBiology Protein Motors II iBiology Protein Motors III  Movimiento de organelas https://twitter.com/MAG2ART/status/1594688115154755585 Las imágenes representativas de una célula no reflejan el alto grado de complejidad y https://twitter.com/MAG2ART/status/1700888775457706290 dinamismo que adquieren las estructuras intracelulares.  El centrosoma coordina la segregación de cromosomas: huso mitótico Durante la división celular, el ADN replicado se condensa a su máxima expresión en forma de hetrocromatina. Los microtúbulos reconocen la región centromérica del cromosoma. Unido a él comienza un proceso de despolimerización de microtúbulos asociado a proteínas motoras. El huso mitótico está conformado por dos tipos de MT: i) los quinetocoros, son los que se unen a la estructura en el cromosoma llamado quinetocoro, y ii) los MT no-quinetocoros, involucrados en el reconocimiento y el posicionamiento de la estructura en los polos de la célula  ¿Cómo ocurre el «tire» de los cromosomas? Procesos claves: – Reconocimiento de los MT con el Quinetocoro. – Vinculación de las proteínas motoras en el quinetocoro con los MT. – Activación de la depolimerasa en el quinetocoro que remueve el CAP. Mecanismo: a medida que se despolimeriza el MT las proteínas motoras se mueven hacia el extremo menos (hacia el centrosoma). Video 2 min  Plasticidad de los microtúbulos La pigmentación de la piel se da por la transferencia de melanina de un melanocito al queratinocito. La «plasticidad» de los melanosomas en adquirir proyecciones celulares y movimientos de vesiculas cargdas de pigmentos, lo vuelven un buen modelo de estudio in vitro para estudiar la dinámica citoesquelética celular. Estudios in vitro con melanocitos embrionarios permiten observar la reorganización espontánea del citoesqueleto dada por el metabolismo residual en un fragmento de célula libre de núcleo.. CITOESQUELETO CITOESQUELETO 2) Microfilamentos de Actina Filamentos Intermedios: – Conformado por multímeros de proteínas fibrosas que adoptan una estructura tipo cuerda. (Actina 7nm) (Microtúbulos 25nm) 3. Filamentos Intermedios: La diversidad de filamentos intermedios (funciones/tejido específicos) radica en emplear diferentes subunidades. Filamentos Intermedios: Principales funciones: – Soporte estructural. – Manutención de la forma celular. – Forman la lámina nuclear. – Conforman parte de los cilios y flagelos. – Dan la fuerza/rigidez a los axones (neurofilamentos). – Forman parte de la estructura del sarcómero en los músculos (desmina). CITOESQUELETO CITOESQUELETO 2) Microfilamentos de Actina  Microfilamentos de Actina ATP La actina contiene un bolsillo con afinidad al ATP. Y la versión Actina/ATP tienen afinidad por otras Actina/ATP, permitiendo que se unan entre sí formando un «núcleo» a partir del cual se genera el microfilamento. Sin embargo, al tiempo el ATP es hidrolizado y la versión Actina/ADP empieza a tener menos afinidad a otras Actina/ADP haciendo que se separen. De esta manera, un filamento de actina está polarizado. Esto es, tiene extremos diferentes: extremo + o barbado por donde crece, y extemo -, o punta por donde decrece. En fase estacionaria el filamento mantiene su longitud.  Polimerización de actina para locomoción Un modelo para estudiar este proceso es el caso de la bacteria LISTERIA MONOCITOGENES como parásito intracelular en eucariotas. La bacteria expresa proteínas que sirven de factores de nucleación para la Actina/ATP de eucariota en su parte posterior. Cuando la bacteria entra a la célula que parasita, la actina se empieza a polimerizar y «empuja» a la bacteria intracelularmente. Algunas serán exitosas en poder abrirse paso en el tejido infectando otras células. La «cola» o «estela» de filamentos de actinas son muy característicos de observar bajo la correcta tinción. Listeria monocytogenes en alimentos alimentos contaminado.  Polimerización de actina para locomoción (video) Se observa una única célula eucariota (central, grande) y muchos parásitos de L. monocytogenes moviéndose en su interior gracias a la polimerización que realiza la propia Actina celular que toma como centro de nucleación ciertas proteínas integrales de membrana bacteriana posicionadas en uno de sus polos. Para más info> (no-obligatorio) Video (30 min)  MIOSINAS, proteína motoras de los microfilamentos de actina Para que la miosina presente actividad motora requiere actuar como dímero. La cabeza de la miosina tiene afinidad por los filamentos de actina. Existen diferentes miosinas que se movilizan hacia uno u otro extremo del filamento. Cuando se acomplejan, forman macroestructuras fibrosas que se intercalan entre las fibras de actina (músculo). Contracción de Microfilmentos de Actina por acción de Fibras de Miosina en el Sarcómero muscular. Sarcómero: la unidad mínima de contracción muscular. Cuando la cabeza de miosina se une al ATP, pierde afinidad por el filamento de actina. Luego la hidrólisis del ATP a ADP genera un cambio conformacional en el cuello de la miosina que permite que la cabeza se posicione próxima a la actina siguiente a la cual se unirá cuando pierde su fosfato. Finalmente, la pérdida del ADP genera otro cambio conformacional en el cuello que mueve todo el filamento una posición. Se mueve una posición El citoesqueleto de actina es heterogéneo Las fibras de estrés son grandes conjuntos de filamentos de actina que pueden extenderse a lo largo de la célula y son foco de la acción de miosinas generando que se contraigan (ej músculo). Por debajo de la membrana plasmática está la red poco organizada de filamentos de actina que se denomina actina cortical. Los filamentos de actina también se pueden organizar para producir una variedad de extensiones celulares, que incluyen podosomas, lamelipodios, filopodios, microvellosidades y rizados (ruffles) Los podosomas contienen varias proteínas de unión a actina, moléculas de señalización y metaloproteinasas (puntos negros, degran matriz extracelular, ej osteoclastos). Filamentos de actina permiten la locomoción de células sobre un sustrato a través de la unión célula – matriz. CÉLULAS SUSTRATO DEPENDIENTE CRECIENDO EN CULTIVO CELULAR (In vitro): SPREADING  Locomoción por acción del citoesqueleto de actina. Para más info> (no-obligatorio) Modelo in vitro ara el estudio de Video (30 min) fibras de estrés: queratocitos de peces de Zebra se mueven a través de la adherencia el soporte in vitro. Los queratocitos se mueven a través de la adherencia al sustrato gracias a la coordinación en simultáneo de la proyección de su membrana por polimerización de actina y la despolimerización en la parte trasera por la contracción lograda por miosinas. En paralelo, las estructuras de adhesión focal (un tipo de unión célula-matriz) con el sustrato ocurren en el frente y el desarmado en la región trasera.  Actina en Acción El citoesqueleto es super dinámico. Ejemplo: Neutrófilos (un tipo de “glóbulo blanco” del sistema inmunológico) persiguiendo bacteria in vitro. Se observa glóbulos rojos enucleadas  Filamentos de actina: evolución La maquinaria molecular en una célula eucariota se ha conservado por 2000 millones de año de evolución y existen versiones de citoesqueleto bacteriano también (más simple y rudimentario). Amebas “comiendo” 2 Paramecias David Rogers, Vanderbilt University (1950) Protistas, eucariotas unicelulares  Principales funciones de los Filamentos de Actina ✓ Contracción muscular ✓ Locomoción ✓ Fagocitosis ✓ Determina la forma celular ✓ Citoquinesis – Anillo de contracción (ver clase de ciclo celular) CITOESQUELETO - resumen CITOESQUELETO 16.1 Disposición general del citoesqueleto Citoesqueleto y su relación con las uniones células-célula y célula-matriz extracelular Adhesión focal Unión célula/célula: 1. Uniones estrechas (a través de la acción de ocludinas se vinculan los citoesqueletos de actina de ambas células) 2. Uniones adherentes (a través de la acción de cadherinas se vinculan los citoesqueletos de actina de ambas células) 3. Desmosomas (a través de la acción de desmocolinas se vinculan los citoesqueletos de filamentos intermedios de ambas células). 4. Uniones tipo GAP (a través de la acción de conexones se vinculan los citosoles de ambas células) Unión célula/matriz extracelular: 1. Adhesiones focales (a través de la acción de vinculinas e INTEGRINAS se vinculan los citoesqueletos de actina con la ECM) 2. Hemidesmosomas (a través de la acción de plectina e INTEGRINAS se vinculan los citoesqueletos de filamentos intermedios con la ECM) ExtraCellular Matrix (ECM)  Integrinas comunican el citoesqueleto con la matriz extracelular. Adhesión focal: el citoesqueleto de actina vía proteínas adaptadoras reconocen el dominio intracelular de la integrina, mientras que el dominio extracelular se encuentra vinculado con la fibronectina y ésta a su vez con el colágeno (componentes de la matriz extracelular). Los Hemidesmosomas, en cambio se vinculan intracelularmente con los filamentos intermedios. ESPACIO EXTRACELULAR CITOPLASMA  Matriz Extracelular Es generada por la propia célula. A través de la secreción de los componentes y enzimas que regulan su estructura. Está conformada por las siguientes estructuras: 1. Estructura proteica FIBROSA – Colágeno, estructural – Elastina, elasticidad 2. Estructura proteica ADHESIVA – Fibronectina – Laminina → forma la lamina basal en tejidos. 3. Estructura hidratada GEL – Proteoglicanos – Ácido Hialuronico ITBA - Prof. Baidanoff, FM. 1C 2018  Estructura fibrosa: Colágeno Proteina sintetizada hacia el ER donde se trimeriza, luego de su secreción la estructura se ensambla en formato de fibra de colágeno.  Estructura adhesiva: Fibronectina Es una proteína fibrosa que se dimeriza por puentes de disulfuro y que presentan diversos dominios funcionales: – de unión a la célula por afinidad con integrinas – Colágeno – Proteoglicano Por ello su rol adhesivo al vincular estas estructuras Proteoglicano y Ácido Hialurónico Proteoglicano es una proteínas altamente glicosidadas, permite generar puentes de H con moléculas de agua. Es decir, permite conservar la estructura hidratada. Consiste en un «core» proteico al que se le unen glicosaminoglicanos (GAGs). Linkeados con el ácido hialurónico (un polisacárido)  Matriz Extra-Celular: 3 componentes estructural, adhesivo e hidratante. 1 Ac. Hialurónico  Membrana Basal, una ECM especial La membrana basal son las fronteras de los tejidos que conforman los órganos de un organismo multicelular. Cada tejido está organizado por una membrana basal especial para su funcionalidad.  Comunicación Célula/Matriz La célula «entienden» su nicho al interactuar con la matriz que la rodea. Una célula madre habita un “nicho madre” en el tejido con una matriz particular, diferente a la que se presenta en el tejido diferenciado. Vía diferentes cascadas de traducción de señales, cambios en la matriz extracelular (fibronectina) generan cambios conformacionales que se trasladan a proteínas internas que disparan diferentes acciones. Alteraciones en la cascada de señales están asociados a procesos patológicos como los tumores.  Célula – Matriz Extra Celular Adhesión y migración Proliferación Diferenciación Apoptosis Traducción de señales del medio ambiente  Célula – Célula En el Desarrollo del programa multicelular son cruciales este tipo de interacciones que permiten el: – Reconocimiento – Activación – Diferenciación – Apoptosis Responder a señales celulares. – Sistema inmunológico Activación de linfocitos y producción de anticuerpos.  Resumen Compartimentalización y protein sorting – Núcleo – Mitocondria y cloroplastos – Peroxisomas – ER – Golgi – lisosoma Trafico de membranas por vesículas – Endocitosis - Lisosoma Fagocitosis, mediadas por receptor – Exocitosis - secretora Constitutiva Inducible – Blackflow, mantenimiento de estructuras y componentes. – Proteínas involucradas en el reconocimiento y en la fusión de vesículas  Resumen Citoesqueleto – Microfilamentos de actina – Microtúbulos de tubulina – Filamentos Intermedios Matriz Extracelular – Adhesivo – Estructural – Gel Hidratante Interacción Célula/Célula – Uniones adherentes (actinas) – Desmosomas (filamentos intermedios) – Gap junctions – Tight Junctions (actinas) Interacción Célula – ECM (intreginas-fibronectina) – Adhesiones focales (Actina) – Hemidesmosomas (filamentos intermedios)