2022-04-28-GFHT-Thrombophilie-aspects-biologiques.pdf

Recherche d’une thrombophilie biologique : propositions du GFHT 2022 - V2.0 Sous l'égide de Y. Gruel et P. Morange Coordonnateurs : M. Alhenc-Gelas (AP-HP HEGP, Paris), E. Boissier (CHU Nantes), I. Gouin-Thibault (CHU Rennes), Rédacteurs : E. De Maistre (CHU Bocage, Dijon), E. De Raucourt (AP-HP CHU Beaujon, Clichy), C. Desconclois (AP-HP CHU A Béclère, Clamart), C. Flaujac (CH Mignot, Le Chesnay), MF. Hurtaud (AP-HP CHU R Debré, Paris), G. Jourdi (AP-HP CHU Cochin, Paris), S. Labrouche-Colomer (CHU Pellegrin, Bordeaux), V. Le Cam (CHU C Nicolle, Rouen), D. Lasne (AP-HP CHU Necker, Paris), L. Mauge (AP-HP HEG Paris), V. Siguret (AP-HP CHU Lariboisière Paris) Relecteurs V1.0 2020 : T. Brungs (CHR La Source Orleans), L. Darnige (AP-HP HEGP, Paris), V. Eschwege (CHU, Nancy), N. Hezard (AP-HM CHU La Timone Marseille), L. Le Flem (Eurofins), F. Loridon (Biogroup) Mots clés : thrombophilie biologique ; maladie thromboembolique veineuse ; inhibiteurs de la coagulation ; analyse des gènes ; FV Leiden ; mutation G20210A du gène F2 ; dysfibrinogénémie ; syndrome des antiphospholipides ; anticoagulant lupique ; D-dimères. 50 I. Table des matières I. Quel prélèvement ? Comment le traiter ?.............................................................................................. 7 A. Tubes de prélèvement, nature de l’anticoagulant............................................................................. 7 B. Conditions temporelles (transport, traitement du prélèvement)...................................................... 7 C. Préparation du plasma....................................................................................................................... 7 D. Congélation des plasmas.................................................................................................................... 8 E. Transport de plasmas congelés.......................................................................................................... 8 F. Décongélation..................................................................................................................................... 8 G. Stabilité............................................................................................................................................... 8 II. Déficits en inhibiteurs physiologiques de la coagulation...................................................................... 10 A. Antithrombine (AT)........................................................................................................................... 10 1. Généralités................................................................................................................................... 10 2. Diagnostic biologique du déficit en AT......................................................................................... 11 a) Mesure de l'activité cofacteur de l'héparine............................................................................ 11 b) Mesure de l'activité progressive de l'AT................................................................................... 12 c) Dosages immunologiques........................................................................................................ 13 d) Place du génotypage................................................................................................................ 13 e) Valeurs usuelles ; variations physiologiques............................................................................ 13 f) Stratégie diagnostique du déficit en antithrombine................................................................ 15 B. Protéine C......................................................................................................................................... 18 1. Généralités................................................................................................................................... 18 2. Diagnostic biologique d'un déficit en protéine C......................................................................... 19 a) Mesure de l’activité anticoagulante......................................................................................... 19 b) Mesure de l’activité amidolytique............................................................................................ 20 c) Dosage immunologique............................................................................................................ 21 d) Place du génotypage................................................................................................................ 21 e) Valeurs usuelles et variations physiologiques.......................................................................... 21 f) Stratégie diagnostique du déficit en PC................................................................................... 21 C. Protéine S.......................................................................................................................................... 23 1. Généralités................................................................................................................................... 23 2. Diagnostic biologique du déficit en protéine S............................................................................. 24 a) Mesure de l’activité (cofacteur de la PCa) de la PS.................................................................. 24 50 b) Dosages immunologiques de la PS........................................................................................... 25 c) Place du génotypage................................................................................................................ 25 d) Valeurs usuelles et variations physiologiques.......................................................................... 26 e) Stratégie diagnostique du déficit en PS.................................................................................... 26 III. FV Leiden et mutation G20210A (c.*97G>A) du gène F2 (Middeldorp and van Hylckama Vlieg 2008) 29 A. Généralités........................................................................................................................................ 29 B. Comment rechercher ces anomalies ?............................................................................................. 29 IV. Résistance à la protéine C activée (RPCA)........................................................................................ 32 V. Anomalies du fibrinogène : dysfibrinogènémie et hypodysfibrinogénémie (Casini et al. 2015, 2017, 2018)............................................................................................................................................................. 34 A. Aspects moléculaires........................................................................................................................ 34 B. Aspect pratique................................................................................................................................. 35 VI. ANTICORPS ANTI PHOSPHOLIPIDES (aPL). DIAGNOSTIC DE SYNDROME DES ANTIPHOSPHOLIPIDES (SAPL) 36 A. Le point sur les connaissances.......................................................................................................... 36 B. Hétérogénéité et "thrombogénicité" des anticorps......................................................................... 36 C. Recherche des anticorps, critères temporels, interprétation des résultats..................................... 36 D. Recherche d'anticoagulant circulant de type lupique...................................................................... 37 1. Principes des recommandations.................................................................................................. 37 2. Aspects pratiques......................................................................................................................... 38 a) Informations et examens d’hémostase devant accompagner la recherche de LA.................. 38 b) Temps de venin de vipère Russell dilué (dRVVT)..................................................................... 39 c) TCA sensible.............................................................................................................................. 39 d) Temps de textarine/temps d’écarine, temps de venin de vipère Taïpan/temps d’écarine..... 39 e) Plasma normal, plasma normal de référence.......................................................................... 39 f) Seuils de positivité.................................................................................................................... 40 g) Performances des tests............................................................................................................ 40 h) Recherche de LA au cours des traitements anticoagulants (Tripodi et al. 2020)..................... 40 i) Interprétation........................................................................................................................... 41 E. Recherche des anticorps anticardiolipine (aCL) 2GPI dépendants et des anti-2GPI..................... 41 F. Rendu des résultats.......................................................................................................................... 42 VII. Autres facteurs biologiques de risque de thrombose...................................................................... 43 VIII. Le dosage des DDimères a-t-il une place dans le bilan de thrombose ?.......................................... 43 IX. Bilan de thrombose de l’enfant............................................................................................................ 46 A. Préanalytique.................................................................................................................................... 46 50 B. Hémostase pédiatrique.................................................................................................................... 47 C. Thrombose et bilan de thrombose pédiatrique............................................................................... 47 D. Valeurs de référence......................................................................................................................... 48 X. Bilan de thrombose : Quelles étapes ?................................................................................................. 48 A. Bilan de dépistage............................................................................................................................. 49 1. Les tests........................................................................................................................................ 49 2. Aspect temporel........................................................................................................................... 49 B. Contrôles........................................................................................................................................... 50 C. Inhibiteurs de la coagulation : place de l’enquête familiale et place des analyses de gène............ 50 50 RESUME Ce texte propose une mise à jour, des recommandations pratiques relatives à la réalisation des analyses biologiques de thrombophilie chez l'adulte et l'enfant, validée par les membres du GFHT. Après une mise au point sur les mesures pré-analytiques, une analyse des caractéristiques des méthodes d’études des inhibiteurs de la coagulation est présentée et des algorithmes de stratégie diagnostique sont proposés. Les causes d’anomalies acquises et d’interférences sont détaillées. En première intention, l’activité cofacteur de l’héparine de l’antithrombine, l’activité de la protéine C seront mesurées de même que l’activité de la protéine S, complétées si besoin par un dosage antigénique. La place du génotypage des gènes de l'antithrombine et des protéines C et S est discuté. Des propositions sont émises pour le dosage des inhibiteurs sous anticoagulant, notamment sous AOD. Les mutations Leiden des gènes des facteurs F5 et F2 peuvent être recherchées par différentes méthodes, commerciales ou « maison », et tout résultat positif sera confirmé sur un nouveau prélèvement. Il est recommandé de ne pas rechercher une résistance à la protéine C activée pour détecter un facteur V Leiden. La recherche d’anomalies du fibrinogène est parfois indiquée, et les méthodes à utiliser sont discutées. Concernant la thrombophilie acquise, les tests nécessaires au diagnostic du syndrome des anticorps antiphospholipides, sont présentés. La démarche diagnostique d'un anticoagulant circulant de type lupique chez un patient traité par anticoagulant et notamment par AOD, est décrite. Le dosage des D-dimères n’est proposé que pour évaluer le risque de récidive de thrombose. Le texte aborde enfin des questions pratiques essentielles, relatives au moment optimal du prélèvement du bilan de thrombophilie. 50 ABSTRACT This article is an update, validated by the members of the GFHT, of the practical recommendations for performing thrombophilia screening in adults and children. After a focus on pre-analytical conditions, an analysis of the characteristics of methods for studying coagulation inhibitors is presented and diagnostic strategy algorithms are proposed. The causes of interferences and of acquired abnormalities are detailed. In first intention, the heparin cofactor activity of antithrombin, the activity of protein C will be measured as well as the activity of protein S, and if necessary antigenic assays will be performed. The role of genotyping of antithrombin and protein C and S genes is discussed. Proposals are made for the dosage of inhibitors under anticoagulants, in particular under DOAC. Leiden mutations of the factor F5 and F2 genes can be investigated by different methods, commercial or "in-house", and any positive result will be confirmed on a new sample. It is recommended not to test for activated protein C resistance to detect Factor V Leiden. Testing for fibrinogen abnormalities is sometimes indicated and the methods to be used are discussed. For acquired thrombophilia, the tests necessary for the diagnosis of antiphospholipid antibody syndrome are presented. The diagnostic approach of a lupus anticoagulant in a patient treated with an anticoagulant especially with DOAC, is described. The D-dimer assay is proposed only to assess the risk of recurrence of thrombosis. Finally, the text addresses practical issues related to the optimal timing of thrombophilia testing. 50 I. Quel prélèvement ? Comment le traiter ? La préparation d’un plasma de qualité optimale pour la réalisation du bilan de thrombose doit prendre en compte les points suivants : 1) certaines protéines de la coagulation sont labiles 2) la recherche d’anticoagulant lupique est extrêmement influencée par la présence de plaquettes résiduelles dans le plasma, et particulièrement lorsqu’elle est réalisée sur des échantillons plasmatiques qui ont été congelés. En effet, la congélation induit une extériorisation des phospholipides plaquettaires procoagulants qui réduisent la sensibilité des tests. Le prélèvement et son traitement doivent donc être effectués en respectant scrupuleusement les recommandations nationales et internationales. Les recommandations que nous résumons ci-dessous sont celles du Groupe Français d’étude sur l’Hémostase et la Thrombose (GFHT)(Groupe Français d’Etude sur l’Hémostase et la Thrombose 2015, 2017, 2018, 2020), du Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) (Adcock et al. 2008 ; Ledford-Kraemer et al. 2014), complétées en ce qui concerne de la recherche d’anticoagulant lupique, par celles de l’International Society of Thrombosis and Haemostasis (ISTH) (Pengo et al. 2009). A. Tubes de prélèvement, nature de l’anticoagulant Les prélèvements d’hémostase doivent être réalisés sur citrate 0,105-0,109 M (3,2%) (1vol pour 9 vol de sang). Les tubes citrate 0.129 M (3,8%) sont acceptables. Un prélèvement en 1ère position est acceptable si réalisé en ponction veineuse franche sinon un tube de purge neutre est nécessaire. Les tubes d’hémostase en matière plastique peuvent être en PET (polyéthylène téréphtalate), ou en polypropylène. Un remplissage ≥ 90% est recommandé ; il est acceptable jusqu’à 80%. B. Conditions temporelles (transport, traitement du prélèvement) Le transport de l’échantillon du site de prélèvement au laboratoire doit se faire préférentiellement à température ambiante, soit entre 15° et 25°C (préférence pharmacopée européenne). Les conditions réfrigérées (2-8°C) ne sont pas recommandées car il y a un risque d’activation du FVII, de modification du facteur Willebrand et d’activation plaquettaire. Idéalement, le transport doit se faire dans l’heure qui suit le prélèvement. C. Préparation du plasma Les tests d’hémostase spécialisés doivent être réalisés sur du plasma contenant < 10 G/L de plaquettes. Les conditions de centrifugation sont les suivantes : au moins 15 min à 1500-2000 g, ou au moins 10 minutes à 2000-2500g. Un frein activé à la puissance maximale, n'a pas d'impact sur le chiffre de plaquettes résiduel (< 10 G/L) et sur les valeurs de plusieurs tests d'hémostase (INR, TCA, fibrinogène, facteurs II, V, X, anti-Xa héparine et antithrombine) (Boissier et al. 2020). Ainsi, par extrapolation, le frein peut être réglé à la puissance maximale (avis d'expert). Si le chiffre de plaquettes n'est pas < 10 G/L après la première centrifugation, une double centrifugation doit être réalisée avec une étape intermédiaire de décantation du plasma, en veillant à ne pas prélever les plaquettes résiduelles présentes au fond du tube. Ne pas filtrer. Toutefois, pour la recherche d'anticoagulant circulant de type lupique sur plasma congelé, la double 50 centrifugation systématique est recommandée (Devreese et al. 2020). La centrifugeuse doit avoir une température contrôlée qui doit être comprise entre 15 et 25 °C. D. Congélation des plasmas Lorsque les examens ne peuvent pas être effectués dans un délai acceptable, les plasmas déplaquettés doivent être congelés en aliquotes de petit volume dans des tubes en matériau non mouillable avec bouchons à vis dont la capacité est adaptée au volume de l’échantillon (volume mort minimal). La congélation sera la plus rapide possible. La température de congélation recommandée est inférieure ou égale à -70 °C. Une congélation rapide à température inférieure ou égale à -20°C est acceptable. E. Transport de plasmas congelés Le transport en carboglace en quantité suffisante, dans un emballage approprié, en suivant les recommandations de transport des échantillons de sang humain est à privilégier. Le transport dans de la glace est acceptable sous réserve d'avoir validé au préalable les modalités (volume de glace, durée maximale…) et de s'assurer de la conformité du matériel à la réception. F. Décongélation Selon les recommandations, la décongélation doit être effectuée rapidement (quelques minutes à adapter au volume de plasma) à une température de 37 °C. Les plasmas doivent ensuite être homogénéisés et les tests effectués sans délai. Le temps de décongélation est à adapter au volume de l’échantillon (par exemple pour un aliquote de 500µL, 2 à 4min maximum). Le GFHT et le CLSI insistent sur l’importance de l’homogénéisation qui ne doit pas être réalisée à l’aide d’un vortex, mais par retournements (6 allers retours) (Lima-Oliveira et al. 2016). G. Stabilité Tableau 1 : Stabilité des paramètres (sang total et plasma), d'après la littérature et les propositions du GFHT Paramètre Sang total Plasma frais Plasma frais à T°C ambiante à T°C ambiante à T°C réfrigérée Fibrinogène au moins 24h au moins 24h au moins 24h D-dimères au moins 24h DI DI Antithrombine (activité et antigène) au moins 24h ≤24h au moins 24h Protéine C (activité et antigène) au moins 24h au moins 4h au moins 4h Protéine S (activité) au moins 4h ≤24h DI Protéine S libre antigène au moins 24h au moins 4h DA Résistance à la protéine C activée ≤ 48h ≤ 48h DA ≤ 4h et double centrifugation Recherche d’anticoagulant circulant au moins 4h ou DA de type lupique simple centrifugation si plaquettes T et -215G>A (nomenclature HGVS) qui sont associés significativement au taux de PC circulante. Les homozygotes pour l’allèle CG ont des taux de PC légèrement plus bas que les porteurs d'autres génotypes. Le risque relatif de thrombose associé à la présence de cet allèle est significatif mais très modeste (homozygotie pour CG comparée à l'homozygotie pour TA: RR 1,4) (Pomp et al. 2009) et la recherche systématique de ce polymorphisme chez les sujets qui présentent une MTEV n’est pas recommandée. Peu de données sont disponibles concernant l'influence du taux de PC ou du type de déficit sur le risque thrombotique. Selon une étude récente, le type de déficit ne semble pas avoir d'influence sur le risque (Alhenc-Gelas et al. 2020). Mais ces résultats doivent être vérifiés sur une plus large cohorte, certains déficits qualitatifs étant faiblement représentés. Le génotypage de PROC (séquençage des régions codantes et recherche de grand remaniement génique) ne permet pas d'expliquer la totalité des anomalies constitutionnelles de la PC. Des déficits en PC liés à des anomalies constitutionnelles de la glycosylation peuvent être associés à des évènements thrombotiques comme décrits dans le CDG syndrome (Linssen et al. 2013). 2. Diagnostic biologique d'un déficit en protéine C a) Mesure de l’activité anticoagulante De nombreux coffrets commerciaux permettent de réaliser cette mesure chronométrique. D'après l'ECAT évaluant 75 laboratoires en juin 2021, les réactifs les plus utilisés étaient : Stago Staclot Protein C® (n=27), Siemens Protein C reagent® (n=19), Werfen Hemosil IL Proclot C® (n=15), Hyphen Hemoclot Protein C® (n=13). Le Tableau 7 reprend quelques caractéristiques de coffrets et leurs interférences. Toutes les techniques comportent une première étape de transformation de la PC en PCa à l’aide du Protac, qui est une enzyme spécifique extraite du venin d’Agkistrodon contortrix. Toutes mesurent ensuite l’activité anticoagulante de la PCa, dans un mélange du plasma du patient et d’un plasma commercial spécifiquement déplété en PC, mais elles diffèrent par le niveau de déclenchement de la coagulation (test de type TCA ou temps de coagulation secondaire à l'activation du FX par le venin de vipère Russel (RVV)). Quel que soit le test, l'activité du site protéasique de la PCa intervient. Dans les tests de type TCA, les interactions avec les cofacteurs Va, VIIIa, la PS, les phospholipides et le calcium sont prises en compte. Ces réactifs ne sont pas tous équivalents en terme de sensibilité aux variants thrombogènes (Cooper et al. 2011). Cette méthode est soumise à des interférences plus nombreuses et à une incertitude plus grande qu'avec la méthode amidolytique ( Tableau 8). 50 Tableau 7 : Caractéristiques des principaux réactifs de mesure de l'activité anticoagulante de la protéine C. Interférences signalées par le fabricant Dilution Nb plasma utilisateurs Réactif Type d'activation (fournisseur) ECAT (juin Anticoagulant HNF FV Leiden 2021) FVIII (%) circulant type (UI/mL) hétérozygote lupîque Venin vipère Russell Cryocheck Clot C® 1/10 >600 >1,2 - - 1 (RVV-X) Werfen TCA pur >250 >1,5 + + 15 Hemosil IL Proclot® (silice+PL synthétiques) Hyphen Hemoclot TCA 1/10 + >1 + ? 13 Protein C® Siemens Protein C TCA (acide ellagique 1/10 + >2 + + 19 reagent® +PL soja) Stago Staclot PC® TCA 1/10 >250 >1 ? - 27 PL : phospholipides Tableau 8 : CV moyen du dosage de la protéine C par méthode chromogénique et chronométrique des évaluations externes de la qualité ECAT en 2020 et 2021. Taux de Protéine C CV moyen des méthodes CV moyen des méthodes chromogéniques chronométriques (340 laboratoires) (80 laboratoires) 90 - 110 % 5% 8% 40 – 60 % 6% 11 % < 20 % 16 % 26 % Le génotypage réalisé dans le cadre d'enquête familiale a démontré les limites des tests plasmatiques. En effet, des taux subnormaux, voire normaux, ne permettent pas d’exclure avec certitude la présence de mutations délétères (Allaart et al. 1993). De plus, les mesures d'activité sont réalisées dans des conditions non physiologiques (activation de la PC par le Protac) qui peuvent conduire à une interprétation erronée en présence de certaines mutations de type II. C'est le cas pour le variant p.Thr357Ala dont l'activation est anormale lorsqu'elle est réalisée à l'aide du Protac, mais plutôt augmentée lorsqu'elle est réalisée à l'aide du complexe thrombine-thromboduline. Ce variant pourrait ne pas être thrombogène (Ding et al. 2015). A l’inverse, compte tenu du mode d'activation de la PC, aucun coffret disponible n'évalue les capacités de la PC à interagir avec le complexe thrombine-thrombomoduline ou avec son récepteur endothélial. b) Mesure de l’activité amidolytique La mesure de l’activité amidolytique évalue la capacité fonctionnelle du site catalytique. Il existe de nombreux coffrets commerciaux aux performances équivalentes. D'après l'ECAT évaluant 335 laboratoires en juin 2021, les réactifs les plus utilisés étaient : Berichrom Protein C® (n=144), IL Hemosil Protein C® (n=104), Stago Stachrom Protein C® (n=53). Ils utilisent tous le Protac pour transformer la PC en PCa et étudient la capacité de la PCa à cliver un substrat chromogène. Il y a peu de causes d'interférences (Tableau 6). 50 A noter, le substrat contenu dans le kit Chromogenix Coamatic Protein C® peut-être clivé par d'autres enzymes que la PCa comme le facteur XIIa, la kallicréine, la thrombine, la plasmine et le tPA, lié à un prélèvement difficile, la présence d'une CIVD ou après fibrinolyse thérapeutique. Ainsi, en cas de PC > 200 UI/dL ou de suspicion d'activation du prélèvement, l'activité amidolytique non spécifique peut être mise en évidence en répétant le test en remplaçant le Protac par du sérum physiologique (Cooper et al. 2020). c) Dosage immunologique L'antigène de la PC peut être évalué à l'aide de techniques ELISA ou ELFA (sur Vidas® bioMérieux). D'après l'ECAT évaluant 67 laboratoires en juin 2021, les réactifs les plus utilisés étaient : Stago Asserachrom Protein C® (Stago) (n=26) et Vidas Protein C® Biomerieux (n=14). Il y a peu de causes d'interférences (Tableau 6). d) Place du génotypage Le génotypage de PROC est nécessaire pour permettre le conseil génétique et des diagnostics anténataux précoces dans la forme récessive du déficit. Il peut être utile pour affirmer l'origine constitutionnelle d'un déficit franc, devant des phénotypes plasmatiques d'interprétation difficile, pour le conseil thérapeutique dans le cadre d'enquêtes familiales ou même en l'absence d'anomalie plasmatique chez des sujets présentant une histoire thrombotique majeure, après concertation multidisciplinaire. La place d'une recherche génétique d'anomalie constitutionnelle de glycosylation n'est pas établie. Il est recommandé de discuter la réalisation d'une étude du gène de la protéine C (PROC) avec un centre expert. e) Valeurs usuelles et variations physiologiques La PC est basse à la naissance. A partir de 16 ans, et quelle que soit la méthode utilisée, les valeurs de référence sont comprises entre 70 et 140% (Andrew et al. 1992). Le taux de PC est indépendant de l’âge et du sexe ( 50 Tableau 4). f) Stratégie diagnostique du déficit en PC Les résultats des dosages doivent être interprétés en tenant compte des valeurs de référence (Tableau 4), de la sensibilité des coffrets (Tableau 3), des causes d’interférences (Tableau 6), des causes d'anomalies acquises (Tableau 9). Taux subnormal ou normal avec Protéine C activité Oui histoire thrombotique majeure, Technique anticoagulante ou amidolytique* génotypage envisageable après Taux normal? concertation multidisciplinaire Non Oui Cause acquise**? Contrôle en l absence de cause Dosage FVII, FV, FII ou FX ± PS, AT à envisager acquise, si possible Non Contrôle ± PC antigène Enquête familiale à envisager Génotypage à discuter*** *La technique amidolytique peut conduire à un défaut de diagnostic des déficits de type IIb (Type II anticoagulant) ** Causes acquises : Tableau 9 *** Le génotypage de PROC est nécessaire pour permettre le conseil génétique et les diagnostics anténataux précoces dans la forme récessive du déficit. Il peut être utile pour affirmer l'origine constitutionnelle d'un déficit franc, devant des phénotypes plasmatiques d'interprétation difficile. Les recommandations de l'ISTH préconisent d'utiliser la technique amidolytique en première intention et de compléter le bilan par une mesure d'activité chronométrique en cas de résultat normal si une thrombophilie constitutionnelle est fortement suspectée (Cooper et al. 2020). En effet, la mesure de l'activité anticoagulante est soumise à des interférences plus nombreuses et à une incertitude plus grande qu'avec la méthode amidolytique (Tableau 8). Cependant, cette attitude peut conduire à un défaut de diagnostic des déficits de type IIb. Dans le cas où l’activité anticoagulante n’a pas 50 pu être réalisée et que le résultat de l’activité amidolytique est dans les valeurs de référence, il est important de mentionner que ce résultat ne permet pas d’exclure tous les types de déficits en PC. Tableau 9 : Causes d’anomalies acquises de la protéine C Insuffisance hépato-cellulaire Diminution de synthèse des protéines de la coagulation Hypovitaminose K Diminution de la synthèse de protéine C active Consommation La protéine C est consommée lors de la formation de caillots (chirurgie, thrombose étendue, CIVD, LAM3, pré-éclampsie) Selon certains auteurs, PC inchangée ou augmentation modérée Grossesse (de 20% maximum, entre la 6ème et la 20ème semaine), persistant quelques jours en post partum (Said et al. 2010) Alcoolisme sévère Défaut de glycosylation Plasmaphérèse ; CEC Hémodilution et consommation La protéine C est diminuée chez les patients souffrant d’une Drépanocytose homozygote drépanocytose homozygote (Awoda et al. 2017) Auto-anticorps anti-protéine C Très rare Traitement par AVK Diminution de la synthèse de protéine C active Traitement par L-asparaginase Probable diminution de synthèse hépatique de la protéine C CIVD coagulation intra-vasculaire disséminée ; LAM3 leucémie aigüe myéloïde type 3 ; CEC circulation extra-corporelle ; AVK anti-vitamine K C. Protéine S 1. Généralités La PS est une glycoprotéine vitamine K dépendante de 676 AAs. Sa forme circulante de MM 70 kDa, comporte 635AAs. Sa concentration plasmatique est d’environ 25 mg/L et sa demi-vie est de l'ordre de 48 heures. Le gène codant la PS (PROS1) est sur le chromosome 3. Il comporte 15 exons s'étendant sur plus de 80 kb. Il existe un pseudogène (PROS2P), non codant qui a 97% d'homologie par rapport au gène codant. La synthèse de la PS n’est pas exclusivement hépatocytaire ; elle est produite par les cellules endothéliales, les mégacaryocytes, les cellules de Leydig et le cerveau. La partie N terminale de la protéine mature contient un domaine GLA qui lie les ions calcium et dont la présence conditionne l'affinité de la PS pour les phospholipides membranaires. Elle est suivie par une boucle sensible à la thrombine. La partie C terminale comporte un domaine de liaison à la C4b binding protein (C4bBP). Dans le plasma, la PS circule principalement sous deux formes, une forme libre (PSL) (40%) et une forme liée (60%) à la C4bBP. La PSL est un cofacteur non enzymatique de la PCa pour la protéolyse des facteurs Va et VIIIa (Dahlbäck 2008). Le clivage par la thrombine entraîne la perte de cette fonction. De plus, la PS possède des activités anticoagulantes indépendantes de la PCa en agissant comme cofacteur du TFPI pour inhiber le FXa, et en inhibant directement les FXa et FVa au sein du complexe prothrombinase (Hackeng et al. 2006; Chattopadhyay et al. 2012). 50 Le déficit constitutionnel en PS, facteur de risque de MTEV, est de transmission autosomale dominante, à pénétrance variable. Sa prévalence dans la population générale pourrait être comprise entre 0,03 et 0,13% (Middeldorp 2011). Des déficits en PS hétérozygotes seraient retrouvés chez 2 à 3% des patients thrombophiliques. D'après la méta-analyse des données observationnelles de Di Minno et coll., le risque relatif de 1ère thrombose associé au déficit en PS serait de l'ordre de 5 et le risque relatif de récidive de l'ordre de 2,5 (non significatif) (Di Minno et al. 2015). Ces données sont probablement relativement inexactes car elles ne sont pas obtenues à partir d'études tenant compte des génotypes. Des déficits homozygotes en PS avec absence de protéine circulante ont été rapportés ; la symptomatologie est identique à celle du déficit homozygote en PC (Schwarz et al. 1984; ten Kate and van der Meer 2008). Plusieurs études ont montré que les déficits constitutionnels thrombogènes sont ceux pour lesquels la PSL plasmatique est fortement diminuée, avec un seuil de risque (30-40%) plus bas que la limite inférieure des valeurs de référence (Lijfering et al. 2009; Alhenc-Gelas et al. 2016). Les déficits héréditaires sont de types quantitatifs (I et III) ou qualitatifs (plus rares). Les déficits qualitatifs de type II associent un taux de PSL normal et une activité cofacteur de la PCa diminuée. Dans le type I, la PST et la PSL sont diminuées de façon équivalente ; dans le type III, seule la PSL est basse. Les déficits de type I et III peuvent être des variants phénotypiques d'une même mutation. Le dosage de PS libre apparaît plus pertinent que le dosage de PS totale pour le diagnostic de déficit en PS et l'évaluation de la thrombogénicité (Zöller et al. 1995; Simmonds et al. 1998). Les bases moléculaires du déficit en PS ont été établies et de nombreuses mutations de PROS1 ont été identifiées (http://www.hgmd.cf.ac.uk). Le génotypage de PROS1 (séquençage des régions codantes et recherche de grands remaniements géniques) ne permet pas d'expliquer la totalité des anomalies constitutionnelles de la PS. Des déficits en PS liés à des anomalies constitutionnelles de la glycosylation peuvent être associés à des évènements thrombotiques comme décrits dans le CDG syndrome (Linssen et al. 2013). Quelques données concernant les relations génotype-phénotype clinique sont disponibles (Alhenc-Gelas et al. 2010, 2016). Toutes les mutations ne semblent pas équivalentes en termes de thrombogénicité. Ainsi, les variants de type II pourraient être moins thrombogènes que les variants de type quantitatif. La présence d'une mutation délétère de type quantitatif et le taux de PS libre circulante ont une influence conjointe sur le risque d'évènements thrombotiques (Marlar et al. 2021). La mutation Heerlen (p.Ser501Pro, nomenclature HGVS) modifie un site de glycosylation ce qui entraîne une réduction de sa durée de vie dans la circulation et une diminution modeste de la concentration plasmatique de PS. Les données de la littérature concernant ses conséquences cliniques sont à ce jour contradictoires (Bertina et al. 1990; Alhenc-Gelas et al. 2016; Suchon et al. 2017). 2. Diagnostic biologique du déficit en protéine S a) Mesure de l’activité (cofacteur de la PCa) de la PS L'activité de la PS présente l'intérêt de détecter les déficits qualitatifs (type II) et quantitatifs (types I et II) avec une sensibilité supérieure à 90% mais avec une spécificité de 40 à 70% (risque de faux-positifs liés à de nombreuses interférences) (Marlar et al. 2021). D'après l'ECAT évaluant 170 laboratoires en juin 2021, les réactifs les plus utilisés étaient : Staclot PS® Stago (n=69), HemosIL PS activity® Werfen (n=50) et Protein S AC® Siemens (n=39). 50 Le Tableau 10 reprend quelques caractéristiques des coffrets et leurs interférences. Les tests mesurent l’allongement du temps de coagulation d’un mélange de plasma à tester et d’un plasma commercial déplété en PS, en présence de PCa. La coagulation est déclenchée par du facteur tissulaire, du FIXa, ou par activation endogène du FX par du RVV en présence de calcium et de phospholipides. D'après l'ECAT évaluant 170 laboratoires sur l’année 2021, le CV de la méthode était de 12% pour les taux de PS > 60% et 22% pour les taux de PS < 60%. Tableau 10 : Caractéristiques des principaux réactifs de mesure de l'activité anticoagulante de la protéine S. Dilution du Interférences signalées par le fabricant Type d'activation plasma HNF Anticoagulant FV Leiden Réactif FVIII (%) (fournisseur) (UI/mL) circulant type lupîque hétérozygote Cryocheck ClotS® PCa/RVV/PL/Ca 1/10 >600 >1 + + Cryopep Hyphen Hemoclot PS® PCa/FIXa/PL/Ca 1/10 >200 >1 + + Sysmex HemosIL PS activity® PCa/rhTF/PL/Ca pur ? >1,6 ? ? Werfen Staclot PS® PCa/FVa/PL/Ca 1/10 >150 >1 + ? Stago Protein S AC® PCa/RVV/PL/Ca 1/10 >400 >3 + + Siemens Ca : calcium ; PCa : Protéine C activée ; PL : Phospholipides ; RVV : Venin de Vipère Russell ; rhTF : facteur tissulaire recombinant humain b) Dosages immunologiques de la PS Les dosages immunologiques comprennent : le dosage de la PS libre (PSL) et la protéine S totale (PST). La PSL peut être dosée avec une technique immunoturbidimétrique automatisée ou avec une technique ELISA classique de type sandwich. D'après l'ECAT évaluant 321 laboratoires en juin 2021, les réactifs les plus utilisés étaient : Coamatic free PS® / HemosIL free Protein S® (n=120), Siemens Innovance free PS antigen® (n=112) et Stago Liatest free Protein S® (n=62) et Stago Asserachrom free PS® (n=15). Tous emploient des anticorps monoclonaux pour la capture de la protéine et sa révélation, excepté les techniques IL® pour lesquelles la capture se fait à l'aide de particules de latex recouvertes de C4bBP et Asserachrom®, pour laquelle elle se fait à l'aide de fragments F(ab')2 d'un anticorps monoclonal. D'après l'ECAT évaluant 320 laboratoires sur l’année 2021, le CV de la méthode était de 7.5%, indépendamment du taux de PS. Pour le dosage de la PST, d'après l'ECAT évaluant 54 laboratoires en juin 2021, les réactifs les plus utilisés étaient Stago Asserachrom total PS®(n= 23) et Stago Liatest Protein S® (n=11). c) Place du génotypage Le génotypage de PROS1 est nécessaire pour permettre le conseil génétique et des diagnostics anténataux précoces. Il peut être utile pour affirmer l'origine constitutionnelle d'un déficit franc ou lorsque les résultats des dosages sont d'interprétation difficile et pour le conseil thérapeutique dans le cadre d'enquêtes familiales. La place d'une recherche génétique d'anomalie constitutionnelle de glycosylation n'est pas 50 établie. Il est recommandé de discuter la réalisation d'une étude du gène de la protéine S (PROS1) avec un centre expert. d) Valeurs usuelles et variations physiologiques La PS est basse à la naissance. Chez l’adulte, les valeurs de référence diffèrent en fonction du sexe, et de l'âge chez les femmes ( 50 Tableau 4) (Faioni et al. 1997; Liberti et al. 1999; Dykes et al. 2001). e) Stratégie diagnostique du déficit en PS Les résultats des dosages doivent être interprétés en tenant compte des valeurs de référence (Tableau 4), de la sensibilité des coffrets (Tableau 10Tableau 3), des causes d’interférences (Tableau 6), des causes d'anomalies acquises (Tableau 11). PS antigène libre PS activité cofacteur de la PCa Taux normal? Taux normal? Oui Non* Non* Oui Déficit Type II non exclu Déficit Type I ou III Déficit Type I, II ou III Absence de déficit PS activité : PS antigène libre : Taux normal? Taux normal? Oui Non* Non* Oui Absence de déficit Déficit Type II Déficit Type I ou III Déficit Type II Contrôle sur un nouveau prélèvement ± PS antigène totale pour différencier types I et III Enquête familiale à envisager Génotypage à discuter** * Après exclusion des causes acquises (Tableau 11) et interférences (Tableau 6) ** Le génotypage de PROS1 est nécessaire pour permettre le conseil génétique et les diagnostics anténataux précoces. Il peut être utile pour affirmer l'origine constitutionnelle d'un déficit franc, devant des phénotypes plasmatiques d'interprétation difficile. Les recommandations de l'ISTH préconisent d'utiliser la technique de dosage de la PSL en première intention à cause des nombreuses causes d’interférence lors du dosage de l’activité. Si la PSL est normale et la suspicion clinique de thrombophilie est forte, un dosage de la PS activité doit être associé pour ne pas méconnaitre un déficit de type II (Marlar et al. 2021). Dans le cas où l’activité anticoagulante n’a pas pu être réalisée et que le résultat de la PSL est dans les valeurs de référence, il est important de mentionner que ce résultat ne permet pas d’exclure tous les types de déficits en PS. Il n’y a pas lieu de doser systématiquement la C4bBP ou la PS totale. En effet, ces dosages n’apportent pas à ce jour, d'information susceptible d’avoir une influence sur l'évaluation de la thrombogénicité. 50 Tableau 11 : Causes d’anomalies acquises de la protéine S Dysfonction hépatique Diminution de synthèse des protéines de la coagulation Hypovitaminose K Diminution de la synthèse de protéine S active Consommation La protéine S est consommée lors de la formation de caillots (chirurgie, thrombose étendue, CIVD, LAM3, pré-éclampsie) Grossesse Dès 13 à 20 semaines de grossesse, la protéine S est diminuée chez 50 % des femmes enceintes. La recherche d’un déficit constitutionnel en protéine S n’est pas recommandée pendant la grossesse et jusqu’à 3 mois en post partum, car l’interprétation des résultats des dosages est très délicate (Szecsi et al. 2010). Alcoolisme sévère Défaut de glycosylation Protéinurie Fuite urinaire imparfaitement compensée (syndrome néphrotique) Drépanocytose homozygote La protéine S est diminuée chez les patients souffrant d’une drépanocytose homozygote (Awoda et al. 2017) Auto-anticorps anti-protéine S Très rare Syndrome inflammatoire Risque de faux diagnostic (positif ou négatif, en fonction des médiateurs de l’inflammation mis en jeu) (García de Frutos et al. 1994; Criado García et al. 1995) Traitement par AVK Diminution de la synthèse de protéine S active Traitement oestrogénique diminution moyenne de l’ordre de 20 %, en fonction de la classe de l’oestrogène (contraceptifs oraux, hormono- substitution de la ménopause) Traitement par L-asparaginase Probable diminution de synthèse hépatique de la protéine S CIVD coagulation intra-vasculaire disséminée ; LAM3 leucémie aigue myéloïde de type 3 ; AVK anti-vitamine K 18e QUESTION : Quelles méthodes et quelle stratégie pour explorer les inhibiteurs AT, PC et PS ? Proposition # 59 : Il est recommandé d’interpréter les résultats en tenant compte des valeurs de référence, des pathologies sous-jacentes, du contexte hormonal chez la femme (grossesse, COC, THS) et des co- médications (notamment les anticoagulants). Antithrombine (cf algorithme) Proposition # 60 : Pour le dépistage d’un déficit en antithrombine, il est recommandé en première intention, de mesurer l’activité cofacteur de l’héparine de l’AT à l'aide d'un réactif de sensibilité optimale. Proposition # 61 : Si l'activité cofacteur de l’héparine est diminuée, il est proposé dans un second temps, de réaliser un dosage immunologique pour distinguer les déficits en AT de type I de ceux de type II. Proposition # 62 : En cas de déficit de type II, il est proposé de réaliser un génotypage de SERPINC1, plus informatif qu’une mesure de l'activité AT progressive pour évaluer le risque associé de thrombose. Protéine C et Protéine S (cf algorithmes) Proposition # 63 : Pour le dépistage d’un déficit en PC, il est recommandé en première intention de mesurer l’activité de la PC (anticoagulante ou amidolytique). La technique amidolytique peut conduire à un défaut de diagnostic des déficits de type IIb (type II anticoagulant). Proposition # 64 : Pour le dépistage d’un déficit en PS, la mesure de l'activité anticoagulante permet de dépister les déficits quantitatifs et qualitatifs. Le dosage immunologique de la PS libre ne permet pas de 50 dépister les déficits qualitatifs. En cas de diminution de l’activité, le dosage immunologique de la PS libre est à réaliser pour caractériser le déficit (anomalie quantitative ou qualitative). Proposition # 65 : En cas de déficit en PC ou PS, ou de phénotypes plasmatiques d'interprétation difficile, il est recommandé d’évaluer avec un centre expert la pertinence de réaliser un génotypage de PROC ou PRO1S. Dépistage des anomalies rares Proposition # 66 : En cas d’histoire personnelle et familiale de thromboses documentées et sévères associée à un bilan de thrombophilie négatif, il est proposé d’évaluer avec un centre expert la pertinence de réaliser un génotypage (SERPINC1, PROC, PROS1). Comment rechercher un déficit en AT, PC, PS lorsque le patient est traité par anticoagulant ? Proposition # 67 :  HNF / HBPM : une diminution de l’AT plasmatique mise en évidence lors d’un traitement curatif par HNF ou par une HBPM doit entraîner un contrôle après 5 à 10 j d’arrêt du traitement.  AVK : la recherche de déficit en PC ou PS sous AVK n’est pas recommandée. Les contrôles programmés après arrêt des AVK doivent être réalisés à au moins 2 semaines de l’arrêt pour la PC et 3 semaines pour la PS.  AOD : l’activité de l’AT doit être évaluée à l’aide d’une méthode basée sur l’inhibition du facteur Xa, en cas de traitement par dabigatran ou par une méthode basée sur l’inhibition de la thrombine en cas de traitement par un AOD anti-Xa. Les méthodes chronométriques de mesure de l’activité de PC et PS ne doivent pas être utilisées, car elles peuvent conduire à une surestimation de la PC ou PS. 50 III. FV Leiden et mutation G20210A (c.*97G>A) du gène F2 (Middeldorp and van Hylckama Vlieg 2008) A. Généralités La mutation Leiden du facteur V (FV), qui résulte du remplacement du nucléotide G par un A en position 1601 (ancienne nomenclature 1691) du gène du FV, affecte l'Arg 534 (ancienne nomenclature 506) du cofacteur V de la coagulation. Le FV possède des fonctions pro- et anti-coagulantes. En effet, il est procoagulant en tant que cofacteur de l'action du FXa sur la prothrombine et anticoagulant en tant que cofacteur de la PCa vis-à-vis de la dégradation du FVIIIa. La PCa dégrade le FVa par clivage au niveau des Arg 334 (306), 534 (506), 707 (679). Le clivage en 534 intervient en premier et il est prépondérant lorsque le FVa et la PCa sont présents en faible concentration mais l’inactivation n’est totale qu’après clivage en 334. L'activité du FV en tant que cofacteur de la PCa pour la dégradation du FVIIIa nécessite le clivage en 534. Lorsque la mutation Leiden est présente, l’Arg 534 est remplacée par une glutamine, ce qui entraîne un gain de fonction du FV. Cette mutation engendre une « résistance plasmatique à l’action de la PCa » (RPCA) qui peut être mise en évidence par des tests de coagulation. L’importance du rôle anticoagulant du FV est bien démontrée par le phénotype RPCA pseudo-homozygote des patients hétérozygotes composites porteurs de la mutation Leiden du FV sur un allèle et d’une mutation « null » sur l’autre allèle qui abolit complètement l’activité du gène. La répartition géographique de la mutation Leiden du FV est hétérogène. La mutation est présente à l’état hétérozygote dans le nord de l’Europe et aux Etats-Unis, avec une fréquence moyenne de 5% dans la population générale ; sa fréquence diminue du nord au sud de l’Europe, avec des fréquences de l’ordre de 2% chez les hispaniques ; elle est plus faible chez les noirs américains et africains (1%) et chez les asiatiques (0,5%). La fréquence des homozygotes a été évaluée à 0,02% chez les caucasiens. Les porteurs du FV Leiden ont un risque accru de présenter des accidents thromboemboliques (risque relatif (RR) de 1ère thrombose de l’ordre de 3 à 5 chez les hétérozygotes) ; l'influence de la mutation sur le risque de récidive est faible (RR 1.5). La mutation Leiden du FV est responsable d'au moins 95% des RPCA FV dépendantes d’origine génétique. La mutation c.*97G>A (ancienne nomenclature G20210A) du gène de la prothrombine (FII) se situe en aval de la séquence codante, dans la région 3’ non traduite (3'UTR). Elle est située dans une région fonctionnelle qui conditionne la maturation des ARN messagers (ARNm). La mutation augmente l’efficacité du clivage et de la maturation, entraîne une accumulation d’ARNm mature dans le cytoplasme et une augmentation de la synthèse protéique. Ce mécanisme explique l’association significative de la mutation à des taux de FII 30% plus élevés chez les hétérozygotes que chez les non-mutés. Cette augmentation de concentration pourrait, par son impact sur la génération de thrombine, expliquer l'influence de la mutation sur le risque thrombotique. La prévalence de la mutation en Europe est aux alentours de 2%, avec un gradient croissant Sud-Nord. Elle est rare dans les populations d’Afrique et d’Asie. Le risque relatif de 1ère thrombose veineuse chez les hétérozygotes est de l’ordre de 2 à 3 ; l'influence de la mutation sur le risque de récidive est faible (RR 1,5). B. Comment rechercher ces anomalies ? La recherche de ces 2 mutations ponctuelles est simple et de nombreuses méthodes peuvent être employées (PCR-RFLP, PCR spécifique d'allèle, flap endonuclease +FRET, analyse de courbes de fusion, PCR en temps réel, discrimination allélique à l'aide de sondes fluorescentes...). Certains laboratoires ont 50 développé des techniques "maison". D'autres travaillent à l'aide de réactifs commerciaux. En Europe, les techniques de PCR en temps réel sont maintenant plus utilisées que les techniques RFLP (EEQ DGKL RFP 2017-18). Une enquête auprès des laboratoires français hospitaliers et privés réalisant ces analyses nous a permis d'identifier cinq trousses commerciales employées en France au 1er trimestre 2019. Leurs principales caractéristiques et performances sont rapportées dans le Tableau 12. De plus, LACAR® et Vienna Lab® commercialisent des trousses permettant la recherche simultanée des deux mutations ainsi que pour Vienna Lab, un tampon (D2PCRTM Buffer) qui permet d'éviter l'extraction préalable d'ADN (Nauck et al. 2000; Notomi et al. 2000; Didenko 2001; Mamotte 2006; Gessoni et al. 2012; Marturano et al. 2014; Navarro et al. 2015). D'après les données de la littérature, les performances analytiques (sensibilité, spécificité) des techniques sont globalement bonnes, supérieures à 98% (Zhang et al. 2018). Avec les techniques commerciales, pour éviter les faux-diagnostics, il convient de lire attentivement les informations données par le fabricant et d'examiner systématiquement les données brutes d’analyse (profil des courbes de fusion, valeur de Ct…) avant de conclure quant au génotype. De façon générale, des variations de séquence proches des mutations recherchées peuvent en effet induire des profils anormaux. Ils sont généralement interprétés comme invalides par les systèmes de mesure. Cependant, dans certains cas, de faux-diagnostics sont possibles (Tableau 12). Toute discordance ou ambiguïté doit être levée par l’utilisation d’une autre méthode de détection voire par le séquençage bidirectionnel de la région d’intérêt du gène (Segal et al. 2009). En tant qu’examen touchant les caractéristiques génétiques d’une personne à des fins médicales, la recherche des mutations thrombogènes de F2 et F5 est réglementée par le code de la santé publique (titre III, partie législative articles L1131-1 à 3 et réglementaire articles R 1131-1 à 21) que ce soit pour les conditions de prescription, de réalisation de l'analyse, de communication et de conservation des résultats. De plus, devant l’importance d’établir un diagnostic fiable à 100% et d'après le rapport d'évaluation technologique de 2011 de l'HAS concernant les recherches de ces mutations, "tout au moins lorsque le résultat d’une recherche est positif, un contrôle sur un deuxième prélèvement parait devoir être conseillé". 50 Tableau 12 : Mutations thrombogènes de F5 et F2 : coffrets commerciaux CE-IVD, utilisés en France en 2019 LC-FII-LP_24 FV Leiden kit # Lightmix In vitro Diagnostics kit ou LC-FII-LP_96 FII (prothrombin) G20210 Xpert HemosIL FII & FV test FV Leiden RealFastTM assay Coffret (rs1799963) kit# FII G20210 (FDA 2009) PTH 20210G>A RealFastTM assay LC-FV_24 (FDA 2003) FV (Leiden) ou LC-FV_96 (rs6025) Fournisseur Roche Diagnostic Tibmolbiol (vendu par Roche) LACAR Cepheid Vienna Lab Diagnostics GmbH PCR Amplification isotherme PCR PCR PCR Méthode d' amplification temps réel (LAMP, «Loop-mediated isothermal temps réel temps réel temps réel amplification DNA») (74) Méthode d'analyse Analyse de courbe de fusion Analyse de courbe de fusion Analyse de courbe de fusion Analyse de Ct, courbe d’amplification Discrimination allélique Sondes FRET (70-73) Hybridization SimpleProbe ® Hybridation simple: sonde Sonde Hydrolyse -1 sonde d’ancrage canal 519 reconnaissant: Méthode d'identification Sondes Scorpion (70-72) TaqMan® -1 sonde spécifique de reconnaissant allèle allèle muté (FII), allèle sauvage (FV) (70-72) l'allèle sauvage « sauvage » (72) (72 LC®1.x LC®2.0 LC®480 I et II LC-GENIE III TM AB 7500 Fast ABStepOneTM Appareillages et compatibilité LC®2.0 LC® Nano LC®96 CFX96 TM GENEXPERT INFINITY CFX96TM Cobas z480 LC®480I et II LC®480 Mx3005P Rotor-Gene®6000 Sang total EDTA ou citrate frais, conservé à Sang total Sang total EDTA Type d'échantillon ADN ADN +4°C jusqu'à l'analyse* EDTA ADN ou congelé ADN Préparation échantillon Oui: Plateforme intégrée automatisée Oui: manuelle avec utilisation du Non Non Oui: manuelle intégrée? autonome et fermée tampon D2PCRTM Synthétiques: Synthétiques: ADN synthétique des FII et V contenu dans Synthétique: Synthétique: -hétérozygote CIQ - sauvage une matrice équivalente au sang - sauvage hétérozygote -homozygote muté - homozygote muté (hétérozygote) - homozygote muté -homozygote sauvage Oui avec trousse Analyse simultanée Oui avec trousse Non Non Lamp Human FII&FVL Duplex KIT Oui des mutations FII et FV? FV-PTH mpx RealFastTM assay (rs1799963/rs6025) Durée du test

2022-04-28-GFHT-Thrombophilie-aspects-biologiques.pdf

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