Biologia Molecolare 13.1 - 28/11 PDF

Biologia molecolare 13.1 28/11/2023 All’inizio della lezione la prof.ssa spiega che ha intenzione di concludere le lezioni una settimana prima rispetto al calendario ufficiale. Inoltre, organizzerà una lezione (penultima o ultima lezio...

Biologia molecolare 13.1 28/11/2023 All’inizio della lezione la prof.ssa spiega che ha intenzione di concludere le lezioni una settimana prima rispetto al calendario ufficiale. Inoltre, organizzerà una lezione (penultima o ultima lezione) dove verrà emulata una simulazione dell’esame in modo da comprendere le modalità di svolgimento. APPLICAZIONI DELLA TECNOLOGIA ANTISENSO CAMBIAMENTO DEI MEZZI DI SOMMINISTRAZIONE Il trattamento con molecole di RNA (RNA technology) usate come farmaci non rispecchia il modello farmacologico canonico. Ci si sta rendendo conto che il mondo, interpretato come un “mondo a proteine” è ormai diventato obsoleto perché la regolazione degli mRNA che vengono tradotti, e quindi la caratterizzazione dell’individuo cellulare in sé, avviene tramite infiniti mezzi che sono a disposizione della cellula. In primis tra questi ci sono i miRNA che possiedono un’estrema variabilità, sia propria che negli effetti che essi sortiscono nei diversi tipi cellulari. Inoltre, bisogna considerare i mezzi con cui vengono somministrati i farmaci al giorno d’oggi. Una volta essi venivano forniti al paziente attraverso iniezioni o pillole. Ora i mezzi di “delivery” nell’organismo in toto, nel tessuto e nelle cellule sono le micelle lipidiche (soprattutto per le sindromi complesse). Ormai nei laboratori di ricerca, la componente chimica si sta allargando sempre di più. Ciò avviene perchè, sfruttare la macchina dell’endocitosi clatrino-mediata e della fusione delle membrane, risulta essere il mezzo più efficace per spostare materiale all’interno delle cellule e permette, inoltre, di andare a impattare direttamente con i meccanismi molecolari che guidano fenomeni importanti all’interno delle cellule. Cos’è l’endocitosi clatrino-mediata? L’endocitosi è basata sul fatto che il simile scioglie il simile. Una micella lipidica a doppio strato di fosfolipidi si fonde naturalmente con le membrane cellulari. In alcuni casi, questa fusione è automatica (non ha bisogno di catalizzatori) e in altri c’è una macchina molecolare (di cui fa parte la proteina clatrina), all’interno del citoplasma delle cellule, che aiuta la fusione della vescicola. Non è così moderna l’idea di sfruttare particelle lipidiche per il trasporto di farmaci. Esiste, nella lettura scientifica clinica, una serie di classici esempi di trattamento di patologie che hanno subito un’evoluzione nel corso degli anni correlata allo sviluppo della tecnologia degli RNA antisenso. APPLICAZIONE IN CAMPO TRASLAZIONALE Sbobinatore: Loseri Luna Revisore: Radina Ilaria Biologia molecolare 13.1 28/11/2023 Una delle molecole che più viene presa di mira nei trattamenti avanzati di patologie specifiche è VEGF (“fattore di crescita vasculo-endoteliale”). Essa è una molecola proteica che viene secreta nell’ambiente extracellulare, nei liquidi biologici e nell’intorno tra cellula e cellula. Essa si lega a un recettore di superficie nelle cellule endoteliali ed è in grado di guidare la neoangiogenesi. VEGF ha un ruolo fondamentale nella colonizzazione da parte dei vasi di distretti vecchi, cioè tessuti non irrorati estensivamente che rischiano di diventare terreno sterile (se irrorati possono perdere le proprie caratteristiche nocive, un esempio è il tessuto cicatriziale), e nuovi, ossia tessuti che sono in corso di formazione. Uno dei primi trial clinici in cui è stata usata l’interferenza a RNA nel trattamento di una patologia ha coinvolto la molecola bersaglio VEGF nei casi di carcinoma epatico. L’obiettivo era quello di evitare che il tumore venisse irrorato dai vasi e che, quindi, potesse crescere. Questo processo ha portato a un successo inaspettato, aprendo una ricerca relativa all’importanza dell’irrorazione sanguigna. In particolare, nel caso della molecola bersaglio VEGF, ha portato a una svolta nel trattamento di altre patologie come quelle oculari in cui si ha una perdita progressiva di visione nella parte centrale del campo visivo dovuta a un’anomala irrorazione di questa zona che blocca la fototrasduzione e, di conseguenza, la visione nei pazienti affetti. Questa tipo di tipologia ha insorgenza in età pediatrica e si trascina fino in età avanzata con un profilo clinico che peggiora di anno in anno. Essa normalmente viene trattata con una terapia di anticorpi monoclonali. Ciò sfrutta il fatto che l’occhio, essendo un distretto circoscritto, può essere trattato con molecole che vanno a bersagliare proteine specifiche, senza correre il rischio che il trattamento venga disperso Sbobinatore: Loseri Luna Revisore: Radina Ilaria Biologia molecolare 13.1 28/11/2023 all’interno del corpo. Gli anticorpi monoclonali sono in grado di riconoscere in maniere specifica solo e soltanto VEGF. Esse, quindi venivano iniettate all’interno dell’occhio, bloccavano VEGF rallentando massicciamente la formazione dei vasi a livello retinico che impedivano la visione. Questo tipo di trattamento doveva essere ripetuto nel tempo e, soprattutto, comportava un incompleto benessere al paziente (gli anticorpi risultavano non ideali a lungo termine dal punto di vista clinico). Il cambiamento si è avuto con la terapia a RNA, infatti un RNA di 20 nucleotidi è ben più tollerabile di una proteina che pesa 250kb. Si è, quindi, testata l’efficacia della terapia antisenso nei confronti di VEGF su questa tipologia di patologia oculare e i risultati sono stati pazzeschi: poche molecole di RNA funzionano con effetto catalitico e, avendo complementarietà imperfetta con la molecola bersaglio, vanno a innescare la degradazione totale del mRNA. VEGF non viene completamente prodotto e la perdita della visione è minima nel corso del tempo, tanto che questo è diventato il trattamento migliore. In questo tipo di terapia farmacologica si è passati direttamente dalla fase 1 alla fase 3 grazie all’estrema efficacia (colpisce una singola molecola specifica) e agli effetti collaterali irrisori. APPLICAZIONE IN CAMPO AGRICOLO Un altro campo di applicazione di questa nuova tecnologia è quello agricolo (oltre al campo traslazionale visto precedente). Uno dei primi esempi è il pomodoro a grappolo, vegetale ingegnerizzato con la tecnologia antisenso. L’avvizzimento di esso è guidato da una proteina che determina la perdita di turgore, e quindi di liquido, dal frutto. Inoltre, con esso si avrà la perdita delle caratteristiche organolettiche del pomodoro stesso. Si è deciso di affrontare il problema andando a creare una versione ingegnerizzata del frutto in cui il gene dell’avvizzimento è stato silenziato, rendendolo inossidabile al naturale processo di degenerazione dei tessuti (mantenimento caratteristiche organolettiche inalterate). ORGANIZZAZIONE E SCOPO DEI LABORATORI AUTOMATIZZATI I miRNA, le cui varianti vengono scoperte ogni giorno, sono in continua evoluzione e quindi studiarle diventa molto complesso. Qual ora venisse identificato un tipo di miRNA specifico, per andarne a valutare tutti gli effetti e i target possibili in tutti i diversi tipi cellulari, vi è la necessità di un impegno, sia dal punto di vista della struttura che intellettuale per affrontare un argomento così vasto. I laboratori, ad oggi, sono altamente robotizzati in modo da rendere la vagliabilità legata all’individuo ridotta al massimo. C’è una cappa cellule ma la manualità dell’operatore ormai è ridotta al minimo, soprattutto quando si intraprendono degli studi che devono essere standardizzati il più possibile. Un esempio di questa tipologia di ricerche è lo studio avente lo scopo di testare, in maniera uniforme, i diversi effetti dei miRNA sui vari tipi cellulari. Sbobinatore: Loseri Luna Revisore: Radina Ilaria Biologia molecolare 13.1 28/11/2023 Dall’immagine si può vedere come vi è la presenza di un dispensatore di cellule ma esse vengono piastrate in maniera automatizzata, i reagenti vengono distribuiti da un braccio robotizzato e il microscopio analizza i diversi campi usando gli stessi parametri per tutti i pozzetti (sono 384 per piastra di 3mm di lato) da analizzare (le acquisisce, le conta, guarda la diversa morfologia). Le diverse piastre vengono analizzate in modo seriale. Il microscopio acquisisce per ogni pozzetto un numero di immagini che stabilisce l’operatore (normalmente 16). Sono possibili diversi ingrandimenti e vengono acquisite 10 milioni di cellule all’ora. Dopodiché sarà l’operatore a scegliere come analizzare i tratti che, però, sono stati acquisiti in maniera completamente automatizzata. Quando si tratta di studiare fenomeni complessi, come l’effetto dei miRNA nei confronti dei diversi tipi cellulari, il tipo di studio è relegato a sortire risultati standardizzati al massimo e una visione orizzontale (dei diversi effetti). Nell’immagine si intuiscono i quadratini che corrispondono ai singoli pozzetti. Se guardiamo ad alto ingrandimento le cellule che sono state piastrate, si riescono a vedere in blu i nuclei e le cellule (in rosso o in verde) che sono state colorate in modi diversi in base a cosa l’operatore vuole analizzare. In questo modo vengono evidenziate anche cellule gialle, cioè sia verdi che rosse, che esprimono tutti e due gli antigeni di cui si era interessati a studiare. La conta e l’analisi morfologica vengono fatte in modo automatizzato. PROGETTO DI RICERCA: RIATTIVAZIONE DIVISIONE IN CELLULE POST MITOTICHE Si pone di avere un problema scientifico: è possibile riattivare la divisione cellulare nei cardiomiociti (cellule post-mitotiche) usando i miRNA? Ipotesi dei colleghi:  Sintetizzare siRNA avente perfetta/imperfetta complementarità con mRNA che codificano per le proteine che bloccano la divisione cellulare, in questo modo esse verranno degradate e la cellula ritornerà a dividersi (silenziamento proteine dei checkpoints così che si abbia entrata in fase M). Insorge, però, un problema: vi è “qualcosa di extra” che non permette ciò, infatti le cellule post-mitotiche che vengono “forzate” a entrare in ciclo vanno incontro a “catastrofe mitotica”: entrano in mitosi, si dividono estremamente e poi muoiono. Ciò avviene perché la natura ha stabilito che queste cellule escano dal ciclo: per rispettare vengono bloccate le proteine presenti tra i punti di passaggio tra una fase e l’altra, rendendole così un obiettivo non target per il silenziamento.  Riportare il cardiomiocita in forma pluripotente indotta e osservare i cambiamenti tra questa situazione e quella della cellula post-mitotica. Problema: non sto usando i miRNA. A partire da una domanda, la prof.ssa ha spiegato come sia stato completamente disapprovato che a livello cardiaco esista un compartimento staminale. Le cellule del cuore dei roditori, di fatto, vanno incontro a proliferazione nei primi 10gg della vita post-natale e la capacità proliferativa delle cellule è influenzata dalla plasticità nella prima finestra post-natale (non influenzata da ambiente circostante). Le cellule nei primi 7gg post-natale proliferano un po’ e poi escono dal ciclo. La soluzione migliore è quella di andare a realizzare uno screening di tutti i miRNA, che sono ad oggi stati isolati in Homo Sapiens, e osservare se uno di questi ha la capacità di far entrare in ciclo il cardiomiocita (il meccanismo con cui avverrà è di secondaria importanza) evitando tutti gli effetti collaterali (in parte elencati precedentemente). Il miRNA ha la capacità di colpire/silenziare tanti bersagli, molti dei quali sono ignoti, e questo dev’essere sfruttato per ottenere un fenotipo predominante. In questo caso non vengono usati i siRNA perché essi Sbobinatore: Loseri Luna Revisore: Radina Ilaria Biologia molecolare 13.1 28/11/2023 colpiscono un solo mRNA e non mi permettono di svolgere un “attacco” da più fronti (necessario vista la vastità del problema) Sbobinatore: Loseri Luna Revisore: Radina Ilaria