Kimia Analisis Farmasi 2021/2022 PDF

KIMIA ANALISIS FARMASI Tahun Akademik 2021/2022 Prodi : D-3 Dosen : Dr. apt. Zuhelmi Aziz, M.Si. Fakultas : Farmasi Esti Mulatsari., M.Sc Semester: III (TIGA)...

KIMIA ANALISIS FARMASI Tahun Akademik 2021/2022 Prodi : D-3 Dosen : Dr. apt. Zuhelmi Aziz, M.Si. Fakultas : Farmasi Esti Mulatsari., M.Sc Semester: III (TIGA) Mata Kuliah rmasi, D3 Farmasi, FFU Materi Pembelajaran Mata Kuliah Kimia Analisis Farmasi, D3 Farmasi, FFUP III.2.E. SPEKTROFLUOROMETER SPEKTROFLUOROMETRI A. PENDAHULUAN B. TEORI DASAR C. INSTRUMENTASI D. APLIKASI  4. PENDAHULUAN ◼ Suatu zat pada suhu kamar umumnya berada pada level energi tingkat dasar (ground state energy level). ◼ Emisi cahaya terjadi bila zat berada pada level energi eksitasi (excited state energy level). ◼ Ada 3 cara mengeksitasi zat: 1. Reaksi Kimia a. Bioluminesensi (bioluminescense): bakteri, fungi, kunang-kunang. b. Kemiluminesensi (chemiluminescence): oksidasi luciferins dengan katalisator enzim, reaksi ATP dengan ekstrak kunang-kunang. 2. Dengan Panas: nyala api atau plasma pada Emission Spectroscopy. 3. Dengan Cahaya: Fotoluminisensi (Photoluminescnce) a. Fluoresensi : relaksasi berlangsung lebih kurang 10-9 detik. b.Fosforesensi: berlangsung lebih lama, 10-4 detik sampai berhari- hari ◼ Fluoresensi mengikuti Hukum Stoke yaitu energi cahaya yang diemisikan oleh suatu zat lebih kecil (λ lebih besar) dari energi cahaya yang diserap waktu proses eksitasi (λeksitasi < λemisi). Sebagian energi cahaya yang diserap hilang karena kolisi dengan molekul pelarut (vibrational relaxation) atau perpindahan energi dari second excited electronic state ke first excited electronic state (internal conversion). ◼ Spektrofluorometri adalah spektrofotometri emisi molekul dimana cahaya yang diukur adalah intensitas fluoresensi yang terjadi pada panjang gelombang tertentu (λemisi) setelah analit dieksitasi dengan cahaya pada panjang gelombang tertentu (λeksitasi). ◼ Spektrofluorometri digunakan untuk analisis senyawa yang berfluoresensi. ◼ Keunggulan: -Sensitif: batas deteksi 1000 X spektrofotometri UV-Vis. -Selektif: Komponen lain tidak mengganggu. -Analisis campuran dengan λem beda dimungkinan. ◼ Kelemahan: - Penggunaan terbatas untuk senyawa berfluoresensi. - Intensitas fluoresensi dipengaruhi oleh intensitas sumber cahaya. - Investasi mahal.  B. TEORI DASAR ◼ Gambar 3.1 Transisi Energi pada Fluoresensi Second excited λex< λem VR electronic state Sebagian energi eksitasi VR IC hilang karena adanyai VR konversi internal dari VR level energi eksitasi First excited VR tingkat dua ke level electronic state energi eksitasi tingkat VR satu dan/atau karena terjadinya kolisi dengan Eex= λ ex pelarut atau yang Eex= λex dikenal dengan relaksasi Eem= λem vibrasional. Oleh karena Ground electronic state With vibrational sublevels Fluoresensi itu λ eksitasi lebih kecil dar λ emisi atau fluoresensi. VR= Vibrational relaxation IC = Internal conversion  TEORI DASAR (lanjutan) ◼ Peryaratan Fluoresesnsi - Molekul menyerap cahaya dengan kuat: senyawa aromatik, heterosiklik, dan sistem konyugasi. - Transisi energi hingga ketingkat kondisi eksitasi terendah pasangan elektron singlet adalah transisi ∏ ∏*. - Molekul yang tereksitasi kembali ke kondisi dasar (groundstate) dengan melepaskan cahaya dengan waktu relaksasi lebih kurang 10-9 detik. Kebanyakan zat kembali ke kondisi dasar dengan melepaskan panas sehingga tidak berfluoresensi.  TEORI DASAR ◼ Intensitas Fluoresensi Fraksi energi radiasi eksitasi yang diemisikan kembali sebagai fluoresensi dinamakan efisiensi fluoresensi atau quantum yield of fluorescense, Φ. Φ = Jml foton (cahaya) yang diemisikan / Jml. foton (cahaya) yang diserap Φ = F / (Io – IT) = F/Ia = F/2,3I0Єbc F = 2,3I0Φ Єbc Pada larutan cukup encer (bpj) fluoresensi dan konsentrasi merupakan hubungan linier. F=fluoresensi, I0=Intensitas radiasi eksitasi, IT= Intensitas radiasi eksitasi yang diterukan, F = kc Ia=Intensitas radiasi yang diserap, Φ = efisiensi fluoresens, Є=daya serap molar, b=tebal sel, c=konsentrasi,M, b=tebal sel, k= tetatapan dari berbagai faktor. ◼ Faktor yang mempengaruhi Intensitas Fluoresensi -Kadar: Pada larutan pekat, fluoresensi makin kecil bila kadar makin tinggi (Inner Filter Effect). -Energi eksitasi (intensitas, kemonokromatisan, λ): Makin kecil intensitas sumber cahaya, makin lemah fluoresensi. -Struktur molekul (efisiensi fluoresensi): Molekul planar dengan sistem konyugasi meningkatkan fluoresensi -Metode Iluminasi: Metode tegak-lurus lebih baik dari metode frontal karena nilai blangko akibat cahaya percikan dan fluoresensi dari dinding wadah, kecil. - Oksigen dalam larutan (quencher): Makin tinggi kadar quencher dalam larutan, makin lemah fluoresensi. -pH: Penurunan pH meningkatkan fluoresensi bentuk molekul dan menurunkan bentuk ion dari fenol. -Fotodekomposisi: Makin kuat serapan radiasi pada λ eksitasi yang dipilih, makin besar kesalahan karena penguraian oleh radiasi. -Suhu dan Viskositas: Makin tinggi suhu dan makin kecil kekentalan, makin lemah fluoresensi karena deaktivasimolekul tereksitasi oleh kolisi.  ◼ Gambar 3.2 The Inner-Filter Effect # Bila konsentrasi makin tinggi, hubungannya dengan fluoresensi tidak linier. Fluoresensi λex λex # Larutan encer # Larutan pekat C,bpj ◼ Quenching -Quenching adalah deaktivasi non-radiatif dari molekul tereksitasi oleh suatu zat sehingga menurunkan intensitas fluoresensi. Zat tersebut dinamakan quencher. Molekul Molekul analit + Quencher analit + Quencher + Panas terksitasi ground state - Quencher dapat berasal dari matrik sampel maupun pelarut. Oksigen yang terlarut dalam pelarut yang digunakan adalah quencher yang serius bagi beberapa senyawa hidrokarbon aromatik yang berfluoresensi. Oleh karena itu larutan dibebaskan dari oksigen. ◼ Sensitivitas - Limit deteksi 1000 X UV-Vis Spectrophotometry: bpm (ppb). Limit deteksi UV-Vis Spektrophotometry = 10-8 M (A = 0,001, Єmax = 105). Pada kondisi ideal limit deteksi Spektrofluorometri dapat mencapai 10-12M - Dengan iluminasi menyiku I0 tidak mengganggu karena tidak ikut diukur (lihat instrumentasi). - Sensitivitas dibatasi oleh intensitas maksimum sumber cahaya. - Spektrofluorometri cocok untuk sampel dengan konsentrasi kecil, misalnya sampel biomedik (famarmakokinetik, toksikologi).  TEORI DASAR (lanjutan) ◼ Selektivitas - Tidak semua zat yang menyerap cahaya berfluoresensi. - Menggunakan dua panjang gelombang pilihan (λex dan λem). - Identitas zat dapat dibedakan berdasarkan spektrum eksitasi (λex tertentu vs Intensitas emisi pada rentang λem tertentu) dan spektrum fluoresensi (Intensitas fluoresensi pada λem tertentu vs λex dengan rentang tertentu). - Selektivitas dapat ditingkatkan dengan tehnik dervatif.  TEORI DASAR (lanjutan) ◼ Gambar 3.3 Spektrum Eksitasi dan Spektrum Emisi v2 Excited v1 state v0 λex λem v2 Ground v1 v0 state  INSTRUMENTASI Gambar 3.4 Spektrofluorometer λex Sel 3 Silika 1 2 Sumber Monokromator Cahaya Eksitasi* Monokromator Xe 4 Emisil* λem * Fluorometer atau Photofluorometer 5 6 7 menggunakan Detektor Amplifier Readout filter gelas. -PM Tube Printer / -Diode Array Recorder  INSTRUMENTASI (lanjutan) Bagian-bagian penting Spektrofluorometer 1. Sumber Cahaya Intensitas cahayanya harus kuat dan stabil, karena berpengaruh linier terhadap intensitas fluoresensi. Cahaya UV dari lampu tersebut berbahaya bagi mata. Jangan mengamati lampu UV yang menyala tanpa kaca pelindung. a. Xenon arc lamp : Nyala listrik terjadi karena ionisasi gas Xe dengan tegangan tinggi, kemudian arus dan tegangan dipertahankan 7,5A, 20 V (750 W). Nyala lampu mencakup panjang gelombang UV-Vis (200 – 900 nm). Kompartemen lampu didinginkan dengan kipas. Iradiasi UV terhadap O2 menghasilkan O3 yang toksis (perlu ventilasi). b. Lampu Merkuri: Sebagai alternatif dapat digunakan lampu uap raksa tekanan tinggi. Intensitas cahaya lampu ini terkonsentrasi pada 254 dan 365 nm yang bermanfaat sebagai radiasi eksitasi.  INSTRUMENTASI (lanjutan) 2. Filter dan Monokromator Komponen ini diperlukan untuk meningkatkan spesifisitas eksitasi dan mengurangi gangguan cahaya menyimpang (stray light). Instrumen klasik yang sederhana menggunakan filter dan yang lebih moderen menggunakan monokromator. a. Filter: Filter gelas menyerap hampir semua cahaya dan meneruskan cahaya pada daerah panjang gelombang tertentu yang sempit, misalnya dengan lebar pita radiasi 50-100nm. Filter dapat diganti-ganti tergantung λmax analit. Filter emisi digunakan untuk menyerap cahaya hamburan dari cahaya eksitasi. Instrumen klasik yang menggunakan filter dinamakan Fluorometer atau Filter Fluorometer. b. Monokromator Instrumen moderen atau Spektrofluorometer menggunakan monokromator sebagai pengganti filter. Sebagai monokromator digunakan kisi (grating). Dengan demikian Spektrofluorometer dapat digunakan untuk membuat spektrum eksitasi maupun emisi (fluoresensi). Disamping untuk identifikasi, kedua spektrum itu dapat digunakan untuk menetapkan λex dan λem optimum. Spektrum emisi sering diga anggu oleh emisi radiasi yang berasal dari cahaya hamburan (scatterred radiation) dari pelarut, yaitu Rayleigh scattering dan Raman scattering. Rayleigh scattering muncul pada λex, lalu Raman scattering pada λ yang lebih panjang, kemudian fluoresensi. Misalnya, spektrum emisi larutan asam salisilat dalam air dengan λex 300 nm, memperlihatkan maksima pada 300 nm (Raleigh), 333 nm (Raman) dan 402 nm (fluoresensi).  ISTRUMENTASI (lanjutan) 3. Sel Sel berfungsi sebagai wadah larutan sampel untuk pengukuran. Sel terbuat dari gelas atau silika, keempat sisi transparan, tebal 1 cm. - Gunakan sel dan pelarut yang cocok untuk fluoresensi. - Sel gelas umumnya dapat digunakan pada spektrofluorometri, namun dibawah 320 nm diperlukan sel kwarsa atau silika. 4. Detektor Detektor berfungsi mengubah energi cahaya menjadi energi (signal) listrik. Katode terbuat dari bahan yang mudah melepaskan elektron bila kena cahaya. Fluorometer biasanya menggunakan detektor phototube. Spektrofluorometer menggunakan photomultipliertube,atau diodearray detector.  INSTRUMENTASI (lanjutan) 4. Detektor (lanjutan) a. Phototube: Bila kena cahaya, katode yang fotosensitif melepaskan elektron hv ke anode yang dipercepat oleh perbedaan potensial diantara kedua elektroda tersebut sehingga terjadi arus listrik. An ode Cathode b. Photomultiplier Tube: Lebih responsif dan sensitif dari phototube karena -I mampu menggandakan elektron yang dilepaskan katode. Terdiri dari satu To Amplifier seri elektrode (dynode) dengan potensial yang makin positif dibandingkan R dengan katoda. Fotoelektron primer dari katode difokuskan ke elektrode kedua yang kemudian dilipatgandakan menjadi elektron-elektron sekunderyang kemudian lebih dilipatgandakan lagi oleh elektrode ke Phototube tiga yang lebih positif dan demikian seterusnya ke elektrode berikutnya hingga dihasilkan arus listrik yang cukup kuat. Untuk meningkatkan sensitivitas, arus tersebut diperbesar dengan amplifier. Peningkatan sensitivitas detektor, memungkinkan pengecilan celah (slit) monokromator agar resolusi sprektra meningkat. c. Diode Array: Sangat responsif dan sensitif serta mampu menghasilkan satu set data tiga dimensi, misalnya hubungan antara intesitas fluoresensi, λex dan λem. Hal ini sangat bermanfaat pada analisis campuran. Komputerisasi memungkinkan penyajian atau perekaman data analisis.  INSTRUMENTASI (lanjutan) ◼ Prinsip Kerja Spektrofluorometer 1. Cahaya polikromatis sumber cahaya diarahkan ke monokromator eksitasi. 2. Monokromator eksitasi diset pada λex dimana analit menyerap cahaya cukup kuat diarahkan ke larutan sampel. 3. Analit menyerap (absorpsi) λex lalu molekul analit berfluoresensi atau mengemisikan cahaya (λem) dengan panjang gelombang lebih besar dari λex. 4. Monokromator fluoresensi dengan posisi 900 diset pada λem untuk mencegah gangguan cahaya eksitasi dan cahaya hamburan dari sel atau pelarut. 5. Detektor kemudian mengubah energi fluoresensi menjadi signal listrik. 6. Amplifier memperbesar signal listrik agar dapat disajikan pada display atau direkam dengan printer dalam bentuk intensitas fluoresensi, spectrum eksitasi atau emisi.  APLIKASI ◼ Senyawa berfluoresensi. ◼ Analit konsentrasi kecil dalam campuran atau matriks kompleks: sampel biomedik, farmakokinetik, toksikologi. ◼ Contoh 1. Senyawa anorganik, ion uranil UO 22+, khelat metal Al, Be. 2. Adrenolutin yang berasal dari adrenlin, dalam suasana alkalis berfluoresensi kuat (λex 360 nm, λem 530 nm). 3.Vitamin: Riboflavin, Piridoksin danTiokrom yang berasal dari Tiamin setelah dioksidasi dengan larutan basa ferisianida (λex 365 nm, λem 440 nm. 4. Asam salisilat, Asetosal, Amfetamin, Barbiturat, Kuinin.. 5. Asam amino: Tirosin, Triptofan. Asam amino yang lain tidak berfluoresensi, tetapi derivatisasi dengan fluoresamin atau dansil klorida [5-(dimetilamino)naftalen- 1-sulfonil klorida) membentuk derivat yang berfluoresensi kuat. 6. Polutan: Hidrokarbon aromatik polisiklik.  APLIKASI (lanjutan) ◼ Penetapan Kadar Larutan Kuinin Sulfat Dalam suasana asam sulfat encer larutan kuinin sulfat befluoresensi. Larutan encer berfluoresensi dengan intensitas sebanding dengan konsentrasi sesuai persamaan , F = kc. Pada konsentrasi tertentu, bila konsentrasi ditingkatkan maka intensitas fluoresensi menurun. Quenching juga dapat terjadi bila dalam larutan terdapat quencher, misalnya oksigen. Larutan Stok Timbang saksama lebih kurang 10 mg kuinin sulfat baku, larutkan dalam asam sulfat 0,1N hingga 1000 ml. Larutan Uji Sampel larutan kuinin sulfat. Prosedur 1. Buat satu seri larutan dengan mengencerkan berturut- turut 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 dan 5.0 ml Larutan Stok hingga 100 ml. 2. Buat spektrum eksitasi pada 200-400nm λex maksimum dengan menggunakan larutan seri terpekat. 3. Buat spektrum emisi pada 400-600 nm dengan λem 450 nm. Set alat dengan larutan asam sulfat 0,1N hingga F = 0 pada λ ex maksimum dan λ em 450 nm. 4. Ukur fluoresensi seri larutan tersebut di atas. 5. Buat kurva kalibrasi. 6. Ukur fluoresensi larutan sampel. 7. Hitung kadar (%) larutan sampel.