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Aquí están los apuntes solicitados:

• El tema principal es la introducción al proceso analítico.

Introducción al Análisis Instrumental en Bioquímica

• Compuesto por biomoléculas (agua, polisacáridos, aa, proteínas) y bioelementos (C, H, N, O, S, Fe, Ca...).
• Las composiciones están relacionadas en cromosomas (ác.nucleicos + proteínas) y lipoproteínas (lípidos + proteínas).
• Las relaciones experimentan transformaciones como aa en glucosa, y glúcidos en ác.grasos.
• La regulación de estos procesos se realiza mediante la velocidad de transformación y la activación/inhibición de rutas metabólicas.
• Las técnicas instrumentales son necesarias para cumplir con los objetivos.
• La instrumentación y técnicas de laboratorio permiten estudiar, indirectamente, los procesos moleculares internos de los seres vivos.

Proceso Analítico

• Se trata de la manera de enfrentarse a un problema, donde todos los pasos son igualmente importantes.
• Comienza con la existencia de un problema, pasando de algo general a algo más específico.
• Se deben poner en relación distintas disciplinas a la vez.
• Se parte de algo general (alimentación) para llegar a lo específico (analizar plasma).

Definición de los Objetivos Analíticos

• Se debe definir la naturaleza del objeto, ya sea un estudio in vivo, una disección, o si se va a utilizar plasma o realizarlo in vitro.
• Determinar si el análisis es cualitativo (presencia/ausencia) o cuantitativo (determinar cuánto).
• Considerar la disponibilidad de la muestra y el orden de concentración, teniendo en cuenta la cantidad disponible.
• Identificar la matriz (agua, plasma, orina, suero) y cómo de compensada está, decidiendo si se debe purificar.
• Determinar si el análisis es mono o multicomponente, analizando uno o varios componentes.
• Tener en cuenta la temporalidad y el número de muestras.
• Importa la integridad de la muestra, reservando una parte por si el proceso necesita repetición.

Selección del Procedimiento

• Se elige la técnica debido a la gran variedad existente, optando por el procedimiento óptimo.
• Criterios de selección incluyen Precisión (RSD %), Exactitud (error absoluto/relativo sistemático), Sensibilidad (de calibración o analítica), Límite de detección (mínima cantidad detectable), Intervalo de concentración (rango de linealidad) y Selectividad (coeficiente de selectividad, prueba de selectividad).
• En técnicas no selectivas, todos los componentes de la muestra responden a la prueba, dificultando el resultado específico.
• Se debe considerar el costo del equipamiento (inversión), el costo por muestra, el tiempo de análisis, los requisitos de personal, la seguridad y la necesidad de formación de los operadores, así como la productividad.
• El muestreo requiere una reflexión profunda sobre qué se desea detectar.
• La etapa crítica es Muestra mala → Resultado malo ←→ Protocolos.

Factores a Considerar en el Muestreo

• Representatividad: si la muestra no es representativa, no dará una respuesta inicial.
• Evitar alteraciones en la muestra (analito-matriz) e integridad durante el transporte y almacenamiento.
• Considerar el estado físico de la muestra, siendo importante tener protocolos para muestras sólidas.
• El etiquetado es crucial para la correcta identificación de la muestra.
• En muestras de sangre, se monitoriza la punción venosa, arterial o cutánea, cada una con diferente composición.
• Se considera si se quiere sangre total, plasma o suero, y se adicionan anticoagulantes y conservantes.
• En orina, se evita la descomposición o la creación de compuestos no deseados mediante refrigeración/congelación.
• Se utilizan agentes antibacterianos/antimicóticos, se reduce la descomposición química, se solubilizan constituyentes urinarios y se evita la oxidación de compuestos inestables.

Preparación de la Muestra

• Implica reducir la muestra de laboratorio a un tamaño adecuado, cuidando la contaminación de muestras líquidas o sólidas.
• Las interferencias se eliminan según la selectividad del muestreo, utilizando reactivos que desenmascaran la interferencia.
• La pre-concentración, diluyendo la muestra, ajusta la composición para obtener una concentración óptima.

Medición

• Involucra técnicas absolutas y comparativas, requiriendo patrones de referencia para calibración y conocimiento de la concentración.
• Se evalúan los datos, obteniendo datos primarios como la concentración, información estructural (IR, MS) y validando el software.

Pasos Finales

• Incluye conclusiones para solucionar el problema, y la creación un informe completo, claro, y fiable (trazabilidad, exactitud).

Preparación Adicional de la Muestra

• Subetapas dependen del estado físico, matriz, analito y técnica.
• Es crucial medir la masa/volumen con exactitud para determinaciones cuantitativas.
• Se realizan disoluciones/disgregaciones de muestras sólidas, extracciones y purificaciones.
• Pueden ser necesarias reacciones químicas para mejorar las respuestas.
• Se ejemplifica con ratones sometidos a dietas altas en grasa y fructosa, añadiendo polifenoles, para estudiar la enfermedad del hígado graso.
• La extracción se guarda en un baño frío para mantener la temperatura baja y la integridad de la muestra.

Objetivos de la Preparación de la Muestra

• Reducir el tamaño de la muestra de laboratorio para facilitar su manejo.
• Lograr homogeneidad y facilitar la medición en muestras sólidas.
• Compatibilizar la muestra con la técnica de medición según el tipo de analitos (orgánico volátil/no volátil, inorgánico).
• Se realizan ataques progresivos en muestras sólidas para determinar analitos inorgánicos, incluyendo disolución, digestión (ácido/base), uso de calor, recipientes abiertos o cerrados, y fusión alcalina.

Métodos de Extracción Selectiva

• No siempre se necesita disolver toda la muestra para analizarla.
• El método Kjeldahl se basa en la digestión del nitrógeno orgánico con ácido sulfúrico y un catalizador de cobre, transformando todo el nitrógeno en amonio. Este se hace reaccionar con sosa y se destila, valorándose con ácido clorhídrico para relacionar la cantidad total de nitrógeno con el contenido proteico.
• Muestras líquidas: la compatibilidad técnica analítica varía; los inorgánicos son más directos, mientras que los orgánicos requieren separación/concentración, ELL o adsorción/intercambio.
• Muestras gaseosas: se analizan directamente si la concentración y volatilidad son altas, o mediante atrapamiento/liberación para concentrar volátiles de muestras sólidas o líquidas.

Volátiles

• Se pueden analizar atrapando en una bolsa de plasma y calentando para vaporizarlos y analizarlos.
• También se pueden analizar analitos volátiles en material particulado o en muestras sólidas mediante filtrado/extracción o "head space".
• Se deben eliminar las interferencias, que modifican la respuesta (+/-), dependiendo de la selectividad, para evitar respuestas erróneas.
• Una falta de especificidad requiere purificación, extracción o disolución.

Técnicas Específicas

• Incluyen propiedad analítica mesurada (enmascarando con F, EDTA, CN) y separación física (precipitación, extracción, destilación, cromatografía).
• Otras operaciones incluyen la preconcentración para análisis de trazas, y la derivatización del analito para mejorar la respuesta del instrumento.
• La extracción líquido-líquido es un método sencillo, limpio, eficaz, rápido y de bajo costo.

Extracción Líquido-Líquido

• Las fases implicadas son líquidas, basándose en procesos de distribución controlados termodinámicamente.
• Inicialmente, se añade el analito en una fase acuosa y luego una fase orgánica, mezclando y esperando la separación. El analito de interés se quedará en la fase orgánica dependiendo de su afinidad.

Cuantificación de la Extracción

• Se evalúa considerando el equilibrio (concentración del analito en equilibrio entre la fase orgánica y acuosa).
• La relación de concentración entre las fases se denomina constante de distribución (KD), indicando la afinidad del analito por la fase orgánica.
• Para evaluar el factor de recuperación (R), se considera la concentración inicial del analito en la fase acuosa y la relación de volúmenes de fase orgánica y acuosa (r).

Selectividad de la Separación

• Interesa cuando se tienen múltiples analitos.
• Se requiere una ELL para separar dos sustancias con valores de KD suficientemente distintos.
• El factor de separación indica la selectividad de la extracción. El objetivo es que el analito A se quede en la fase orgánica y B en la acuosa, preconcentrando el analito y eliminando interferentes.
• Ajustar el parámetro α mejora la separación, distinguiendo mejor los analitos.

Relación de Distribución

• Es similar a la constante de distribución (KD), pero considera que la forma química del analito puede variar en las fases acuosa u orgánica.
• Controlar el pH de la fase acuosa es importante para asegurar que el analito esté en la forma química adecuada para pasar a la fase orgánica neutra.

Extracción Líquido-Líquido por Etapas

• Se separa la fase orgánica del analito A, añadiendo una nueva fase orgánica a la fase acuosa para una segunda extracción.
• Dicho proceso por etapas es preferible si la fase orgánica queda en la parte inferior.
• Se calcula la concentración que queda en cada fase acuosa tras cada extracción. A mayor valor de D, menos extracciones se necesitan.
• Son mejores más extracciones con volúmenes pequeños que una sola con un volumen grande.

Aspectos Prácticos a Considerar

• A medida que se realiza cada extracción, hay una dilución del soluto en la fase orgánica combinada.
• Si la fase orgánica es menos densa, la ELL repetitiva puede ser más difícil.
• El factor de recuperación (R) se calcula mediante una fórmula específica.

Extracción en Fase Sólida (EFS)

• También conocida como extracción líquido/gas-sólido.
• Consiste en la retención de solutos por adsorción en un adsorbente y la posterior desorción mediante elución química o desorción térmica.

Pasos Principales de la Extracción en Fase Sólida

• Acondicionamiento del cartucho con un disolvente para activarlo.
• Paso de la muestra a través del cartucho, reteniendo los analitos de interés.
• Lavado para eliminar los interferentes con un disolvente específico.
• Elución con un disolvente que tenga afinidad por los analitos.
• Una alternativa es un método de tres pasos: acondicionamiento, paso de muestra y elución con un disolvente específico.

Adsorbentes

• Cuentan con una gran variedad de características a considerar.
• Funcionalidad, tamaño de partícula y área superficial se toman en consideración.
• También tamaño de poro e inercia química deben ser tomados en cuanto.
• Los materiales más utilizados son sílice y derivados, intercambiadores iónicos, polímeros y carbón entre otros.
• El mecanismo de retención se basa en la adhesión a grupos silanoles en el polímero.

Fases en EFS

• Una fase normal implica una parte polar y apolar, interactuando con las moléculas desde la parte polar, con muestras disueltas en disolventes no polares eluidas con disolventes polares.
• Una fase reversa utiliza una fase estacionaria no polar, con muestras disueltas en solventes polares eluidas con disolventes apolares.
• También es viable un intercambio con grupos catiónicos o aniónicos.
• Durante la elución catiónica, se retienen los catiónicos y se liberan con cationes más afines. Durante la elución aniónica, se retienen los aniónicos y se liberan con aniones más afines.

Limitaciones

• Los disolventes pueden saturarse, afectando la cuantificación. Calcular la cantidad de absorbente adecuada es clave.
• Existen cartuchos variados, utilizando gravedad o vacío, siendo este último más eficiente para el análisis de agua.
• Los disolventes se pueden saturar por lo que afecta la cuantificación e interfiere la cantidad del absorvente.
• La comparación entre EFS y ELL muestra ventajas en la preparación de la muestra, la rapidez y simplicidad y desbentajas con procesos competitivos que absorben agua entre otras caracteristicas.

La Medida de la Señal Analítica

• Se fundamenta en la concentración de analito en condiciones de medición óptimas.
• La propiedad físico-química es proporcional a la concentración del analito, con métodos absolutos basados en la teoría y métodos relativos empíricos.
• La finalidad puede ser identificativa, cuantitativa o estructural, midiendo la propiedad analítica en función de la cantidad y/o calidad

Clasificaciones

• Métodos clásicos: Análisis cualitativo o análisis cuantitativo como gravimetría o volumetría.
• Técnicas instrumentales: Técnicas ópticas (emisión/absorción atómica/molecular, rayos X), eléctricas (potenciometría, voltamperometría, culombimetría, electrogravimetría, conductimetría), térmicas (termogravimetría, análisis térmico diferencial, DSC), radioquímicas (activación de neutrones, dilución isotópica) y de separación (cromatografía, electroforesis).

Tipos de Respuesta

• La respuesta total se relaciona con la concentración.
• Los parámetros medidos varian según la técnica empleada.

Instrumentación Analítica

• Generador de señal (muestra/energía), transductor de entrada (conversión de propiedad físico-química a señal eléctrica), procesador de señal (filtrado, amplificación), transductor de salida (señal comprensible).
• Un instrumento transforma una señal no detectable en una forma detectable.
• La calibración instrumental garantiza el funcionamiento correcto (estándares sin analito).
• La calibración metodológica establece una relación clara entre la respuesta instrumental y la concentración del analito (estándares con analito).

Cuantificación con Calibrado Metodológico

• Se utilizan instrumentos con relación clara entre señal y concentración, generando una curva de calibrado.
• Se utilizan estándares analíticos puros en métodos QA.
• La concentración del analito se obtiene interpolando la señal de la muestra en la curva de calibrado.

Calibrado Externo

• Los patrones se preparan en disolvente, sin matriz, cuando no hay efecto matriz.
• Un único calibrado es suficiente, utilizando interpolación.
• En matriz, los patrones se preparan usando una matriz "blanca" similar a la muestra, permitiendo corregir los efectos de exaltación o supresión de la señal.

Adiciones Estándares

• Se preparan los patrones utilizando la muestra y la extrapolación para contrarrestar efectos de exaltación o depresión.
• El resultado del análisis no debe depender de las cantidades de analito.
• Permite asegurar la similitud entre patrones y muestra, añadiendo los patrones sobre la muestra de analizar

Patrón Interno

• Se añade un analito diferente, comportamiento parecido, pero con características no preexistentes a la muestra.
• Se añade antes o después de la extracción para corregir la deriva de la señal, asegurando la reproductibilidad en la manipulación.

Calidad del Calibrado

• Se determina por precisión, veracidad y validez en el método empleado.
• La precisión y la veracidad aseguran la medicion.

Validación del Calibrado

• Hay que mesurar muestras con concentraciones ya cocnocidas.
• Las posibles soluciones son comprobar la exactitud con muestras ricas o materiales de reeferencia, o comparacion del metodo escogido con uno ya conocido.
• A los patrones hay que calibrarlos siempre.

Modelos

• y = b1 c es la manera más rapida de calibra, no tan habitual.
• y = b0 + b1 c es una manera más compleja de calibrar
• En relacion a los residuales, si hay una tendencia no se puede coger.

Restricciones

• La incertidumbre asociada y la homocedasticidad, tienen que estar presentes.
• Validacion del modelo de recta, se hace con el coeficiente de correlacion .

Validación de Métodos Analíticos

• Asegura que el ensayo sea para su uso.
• Consite en expermientos diseñados.
• Se realiza previamente para realizar experimentos.

Parámetros de Validación

• Especificidad, linealidad, precision y exactitud, limites de deteccion
• Hay que preparar un blamco , muestras fortificadvas entre otras cosas.

Linealidad y Corvas

• Permite establecer una relacion matematica o directa.
• Hay que medir una serie de diluciones entre 3 y 6.
• Usar un ajuste matematico de la regreison

Precisión y Exactitud

• Hay que hace en una serie de valores mesurados.
• Constarse de la repetibildad, reproducibilidad y concordancia
• Selecion de matriz blanda

Estudio de Recuperación

• hay que reducir la concentracion de la dilucion
• Hay que hacer la adiccion de analitos
• Analiss de réplicas y concentraciones.

Lmite Deteccion

• Ver la minima respuesta y saber que es diferente al rudio.
• Usar fortigicacion blanco y poner una relacion señal ruidao.

Pruch de Dixon

• Ornder los datod y evaluar el estistico.
• Rechazar al rechazar la formula.

Resultados del Analisis

• Se representan en valores absolutas y relativas.