34 Questions
Dlaczego zainteresowano się enzymami?
Ze względu na ich zdolności katalityczne poza komórką.
Co to jest oczyszczanie enzymów?
Oczyszczanie enzymów to proces usuwania zanieczyszczeń i innych substancji towarzyszących, mający na celu uzyskanie czystego preparatu enzymu.
W jakich warunkach zazwyczaj przebiegają reakcje katalizowane przez enzymy? Temp. poniżej $100^oC$, ciśn. atmosferyczne, i pH ok. ___.
7.0
Połącz poniższe techniki z ich zastosowaniem w chromatografii:
Filtracja żelowa (sączenie molekularne) = Służy do rozdzielenia cząsteczek o różnej wielkości i kształcie Chromatografia jonowymienna = Rozdziela cząsteczki na podstawie ładunku powierzchniowego Chromatografia hydrofobowa = Rozdziela cząsteczki na podstawie ich hydrofobowości Chromatografia powinowactwa = Opiera się na specyficzności biologicznej
Co to jest biotechnologia?
Wykorzystanie organizmów biologicznych w technologii do otrzymania konkretnego produktu.
Kto wymyślił termin 'biotechnologia' i w którym roku?
Karl Ereky, 1919
Biotechnologia integruje nauki przyrodnicze i techniczne.
True
Enzymy to związki wielkocząsteczkowe wykazujące właściwości __________ umożliwiające prawidłowe tempo przemian metabolicznych w organizmach żywych.
katalityczne
Zgadnij pary:
Biotechnologia tradycyjna = Wykorzystuje do produkcji przemysłowej drobnoustroje, komórki i ich enzymy bez zmian w aparacie genetycznym. Biotechnologia nowoczesna = Wykorzystuje organizmy, komórki czy enzymy modyfikowane za pomocą technik inżynierii genetycznej. Biała biotechnologia = Zajmuje się głównie ochroną środowiska i zastosowaniem w przemyśle.
Na czym polega chromatografia jonowymienna?
Rozdział białek na podstawie różnicy ładunku elektrycznego
Na czym polega do oczyszczania białek rekombinowanych?
Na oddziaływaniu białek/enzymów z jonami metali
Połącz pary: (Match the pairs)
DEAE = Dietyloaminoetylo- CM = Karboksymetylo-
Filtracja żelowa jest stosowana do rozdzielenia białek na podstawie różnicy ich masy cząsteczkowej.
False
Jakie ligandy mogą tworzyć trój- lub czterokleszczowe chelaty z jonami niklu lub kobaltu?
kwas iminodioctowy (IDA), kwas nitrylotrioctowy (NTA)
PEGylacja enzymów polega na ich wewnętrznej modyfikacji chemicznej.
False
Jakie są główne zalety chromatografii powinowactwa?
bardzo wysoka specyficzność, możliwość uzyskania w czystej postaci molekuł, które często nie mogą być izolowane innymi metodami
Co to jest pułapkowanie?
Metoda unieruchamiania enzymów w usieciowionym polimerze lub kapsułkach z półprzepuszczalnych błon.
Pogrupuj metody immobilizacji enzymów z odpowiadającymi im zaletami i wadami:
Metody fizyczne = Zachowanie struktury enzymu Metody chemiczne = Większa stabilność układu enzym-nośnik
Jak obliczyć czas przebywania τ w h?
τ = 750 h
Jak obliczyć szybkość przepływu substratu przez reaktor F w l/min?
F = 0,0062 l/min
Jak obliczyć dobową produkcję jako liczba moli otrzymanego produktu?
0,08064 mola/dobę/280 l
Jakie cechy charakteryzują enzymy w analityce medycznej? Wybierz wszystkie poprawne odpowiedzi.
Ogromna czułość
Jakie metody analityczne z udziałem enzymów są stosowane w analityce medycznej?
Metody jakościowe – testy paskowe, metody ilościowe z użyciem enzymów rozpuszczalnych (oznaczenia metabolitów), metody ilościowe z zastosowaniem enzymów immobilizowanych, metody immunochemiczne.
Z jakich elementów składa się każdy system ekspresyjny?
Gospodarza i wektora
Bakterie Escherichia coli są najtańszym systemem ekspresyjnym.
True
Jakie są zalety grzybowych systemów ekspresyjnych?
szybki wzrost, niski koszt hodowli, przeprowadzają modyfikacje posttranslacyjne, możliwa sekrecja białka do medium hodowlanego, prawidłowe zwijanie białek
Chromatografia chelatująca z immobilizowanymi jonami metali to skrót IMAC, czyli Chromatografia Poi______.
nowactwa
Połącz system ekspresyjny z jego zaletami:
Bakterie Escherichia coli = szybki wzrost, prosta i tania hodowla System bazujący na Leishmania tarentolae = szybki wzrost, tania hodowla, glikozylacja białek Roślinne systemy ekspresyjne = wysoka ekspresja białek, tania hodowla w dostępnym środowisku System bakulowirusowy = efektywna sekrecja białek, modyfikacje posttranslacyjne
Jakie są zalety sieciowania enzymów?
brak nośnika, wysoka stabilność termiczna i mechaniczna, brak wymywania enzymów, łatwość separacji z mieszaniny reakcyjnej, uniwersalne zastosowanie
Podaj wady sieciowania enzymów.
powolna precypitacja, zmniejszenie aktywności, korzystniejsze sieciowanie agregatów enzymów lub ich kryształy
Co decyduje o ostatecznej przydatności immobilizowanego enzymu w procesach przemysłowych?
enzym, nośnik, metoda unieruchamiania
Dlaczego immobilizowany enzym stopniowo traci swoją produktywność w czasie procesu technologicznego?
wymywaniem enzymu, rozpuszczaniem lub ścieraniem matrycy, denaturacją enzymu, pogorszeniem kontaktu substratu z enzymem, zanieczyszczeniem mikrobiologicznym
Do jakich zastosowań znalazły się immobilizowane enzymy?
diagnostyka medyczna
Jakie są korzyści wynikające ze stosowania enzymów w środkach piorących?
lepszy efekt doczyszczenia, krótszy czas prania, oszczędność energii, oszczędność wody, ochrona środowiska
Study Notes
Biotechnologia
- Definicja biotechnologii: wykorzystanie organizmów biologicznych w technologii do produkcji konkretnego produktu
- Termin biotechnologia został wymyślony w 1919 roku przez Węgra Karla Ereky
- Biotechnologia jest nauką interdyscyplinarną, łączącą nauki przyrodnicze i inżynieryjne
Enzymy
- Definicja enzymu: związek chemiczny, który przyspiesza reakcję chemiczną bez utraty jego struktury
- Enzymy to katalizatory biologiczne, które mogą przyspieszyć reakcję chemiczną nawet o 10^6 razy
- Enzymy są specyficzne dla określonej reakcji chemicznej
Klasfikacja enzymów
- Enzymy zostały sklasyfikowane przez Komisję Enzymową Międzynarodowej Unii Biochemicznej w 1961 roku na 6 klas:
- EC 1 - oksydoreduktazy
- EC 2 - transferazy
- EC 3 - hydrolazy
- EC 4 - liazy
- EC 5 - izomerazy
- EC 6 - ligazy
- W 2018 roku wprowadzono siódmą klasę enzymów - translokazy (EC 7)
Charakterystyka enzymów
- Centrum aktywne enzymu to miejsce, gdzie dochodzi do reakcji chemicznej
- Centrum aktywne jest specyficzne dla określonej reakcji chemicznej
- Enzymy wykazują stereospecyficzność, co oznacza, że mogą rozróżniać izomery przestrzenne substratu
Kinetyka reakcji enzymatycznej
- Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężenia enzymu, stężenia substratu, temperatury i pH środowiska
- Wpływ stężenia enzymu: przy dużym stężeniu enzymu szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia enzymu
- Wpływ stężenia substratu: przy stałym stężeniu enzymu, szybkość reakcji zależy od stężenia substratu
Inhibicja aktywności enzymatycznej
- Inhibicja odwracalna: inhibitor może być oddzielony od enzymu, co przywraca aktywność enzymu
- Inhibicja nieodwracalna: inhibitor wiąże się trwale z enzymem, niszcząc jego strukturę
Analiza ilościowa aktywności enzymatycznej
- Miara aktywności enzymatycznej to szybkość reakcji enzymatycznej
- Aktywność enzymu można określić, mierząc ilość powstałego produktu lub ubytek substratu w jednostce czasu
- Jednostką aktywności enzymu jest unit (U) - ilość enzymu, która powoduje powstanie 1 μmola produktu w ciągu 1 minuty
Oczyszczanie enzymów
- Oczyszczanie enzymów to proces uzyskiwania czystego enzymu z materiału biologicznego
- Etapy oczyszczania enzymów: ekstrakcja, homogenizacja, wytrącanie, oczyszczanie chromatograficzne
- Oczyszczanie enzymów jest procesem trudnym i czasochłonnym, ale koniecznym do uzyskania czystego enzymu o wysokiej aktywności### Polimerizacja i chromatografia
- Polieter polietylenu glycolu (PEG) - ogólny wzór: H-O-[-CH2-CH2-O-]n-H, gdzie n = 4-120
- W zależności od masy cząsteczkowej może być cieczą (m.cz. = 200-600) lub ciałem stałym
- Rozpuszczalniki organiczne (aceton, etanol) - większość białek wytrąca się w przedziale 25-60% rozpuszczalnika
- Enzymy można także wytrącić, zmieniając pH
Oczyszczanie enzymów
- Cel: otrzymanie czystego enzymu z ekstraktu
- Etapy:
- Ekstrak wyjściowy
- Oznaczenie aktywności enzymu
- Oczyszczony preparat
- Oznaczenie aktywności w oczyszczonym preparacie
- Obliczenie wydajności metody oczyszczania i stopnia oczyszczenia enzymu
Chromatografia
- Technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdziału lub badania składu mieszanin związków chemicznych
- Rozdzielenie składników ulega podziałowi pomiędzy dwie fazy: fazę nieruchomą (stacjonarną) i fazę ruchomą (mobilną)
- Techniki chromatograficzne wykorzystywane są do separacji białek (makromolekuł) na podstawie parametrów:
- Wielkości i/lub kształtu cząsteczki
- Ładunku powierzchniowego
- Hydrofobowości
- Specyficznej biologicznej
Rodzaje chromatografii
- Filtracja żelowa (sączenie molekularne)
- Wykorzystuje żel
- Służy do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową
- Stosowana do oddzielania białek od składników niskocząsteczkowych
- Sephadex, Sepharose, biogel
- Chromatografia jonowymienna
- Wykorzystuje wymianę jonową ze znajdującymi się w roztworze, obdarzonymi ładunkiem przeciwnym jonami wymieniacza jonowego
- Stosowana do rozdziału związków/białek na podstawie różnicy ich ładunku elektrycznego
- DEAE, CM
- Chromatografia hydrofobowa
- Wykorzystuje hydrofobową naturę niektórych białek
- Stosowana do rozdziału białek na podstawie różnic w sile oddziaływania obszarów hydrofobowych białka z ligandami
- Siarczan amonu
- Chromatografia powinowactwa
- Wykorzystuje wzajemne powinowactwo dwóch substancji
- Stosowana do izolowania glikoprotein poprzez ich adsorpcję na nośnikach z immobilizowanymi lektynami
- Konkanawalina A, Sephadex, Sepharose
Kryterium czystości
- Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
- Stosowana do:
- Sprawdzenia homogenności preparatu białka
- Wyznaczania mas cząsteczkowych białek### Rodzaje wektorów
- Stosowana do:
- Plazmidy: pozachromosomalne, koliste cząsteczki DNA, które mogą replikować się samodzielnie w komórkach bakteryjnych
- Wektory fagowe: wykorzystują fakt, że bakteriofagi wnikają do komórek bakteryjnych i wprowadzają swój DNA
- Kosmidy: powstają z połączenia plazmidów i fagów, posiadają regiony cos bakteriofagowego lambda
- Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC) i bakteryjne (BAC)
Elementy wektora ekspresyjnego
- Sekwencja promotora inicjująca transkrypcję (promotor)
- Miejsce wiązania rybosomu (RBS)
- Miejsce insercji klonowanego DNA (MCS, polilinker)
- Kodon inicjujący translację (ATG) i kodon stop (UAAU)
- Miejsce inicjacji replikacji (ori)
- Gen umożliwiający selekcję (najczęściej warunkujący oporność na antybiotyk)
Promotory
- Wybór promotora zależy od:
- Rodzaju
- Siły
- Możliwości kontroli ekspresji
- Sposobu i kosztu indukcji
- Kompatybilności z wieloma szczepami bakteryjnymi
- Używa się silnych promotorów pozwalających na wydajną produkcję heterologicznych białek
Znaczniki (tagi)
- Krótkie peptydy lub domeny dołączone do rekombinowanego produktu
- Ułatwiają izolację, detekcję i rozpuszczalność
- Nie powinny wpływać na aktywność i strukturę białka
- Przykłady znaczników: His-tag, GST-tag, Strep-tag, CBP-tag, MBP-tag
Usuwanie znaczników
- Metody chemiczne i enzymatyczne
- Chemie: bromocyjan lub hydroksylamina
- Enzymatyczne: endoproteazy i egzopeptydazy
Modyfikacje enzymów
- Chemiczne modyfikacje:
- PEGylacja: przyłączenie polietylenu glikolu do białek/enzymów
- Immobilizacja enzymów: wiązanie z nośnikiem
- Przykłady: PEGylowana L-asparaginaza z E. coli, PEGylowana deaminaza adenozyny
Immobilizacja enzymów
- Metody fizyczne: adsorpcja, pułapkowanie
- Metody chemiczne: wiązanie kowalencyjne
- Zalety immobilizacji:
- Możliwość wielokrotnego użycia
- Zwiększenie stabilności struktury białka enzymatycznego
- Wydłużenie aktywności enzymu
- Wady immobilizacji:
- Wysoki koszt uzyskania wysokooczyszczonego preparatu enzymatycznego
- Częściowa utrata aktywności enzymu
Biotechnologia to wykorzystanie organizmów biologicznych w technologii do otrzymania konkretnego produktu. Poznaj definicje i historię tej dziedziny!
Make Your Own Quizzes and Flashcards
Convert your notes into interactive study material.
Get started for free
