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Questions and Answers
¿Cuál es una ventaja del método simplificado de transformación por colonias en comparación con el método clásico?
¿Cuál es una ventaja del método simplificado de transformación por colonias en comparación con el método clásico?
¿Qué factor reduce la eficiencia de transformación de ADN ligado en el método de colonias?
¿Qué factor reduce la eficiencia de transformación de ADN ligado en el método de colonias?
¿Cuál es el marcador de resistencia a antibióticos más práctico en la demostración de la transformación de E.coli?
¿Cuál es el marcador de resistencia a antibióticos más práctico en la demostración de la transformación de E.coli?
¿Qué ocurre con el crecimiento del número de transformantes si las células de E.coli son pasadas repetidamente?
¿Qué ocurre con el crecimiento del número de transformantes si las células de E.coli son pasadas repetidamente?
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¿Qué condiciones son necesarias para almacenar adecuadamente las colonias de E.coli MM294?
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¿Cuál es el propósito de la solución de cloruro de calcio (CaCl2) en la preparación de E.coli para la transformación?
¿Cuál es el propósito de la solución de cloruro de calcio (CaCl2) en la preparación de E.coli para la transformación?
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¿Qué evento representa cada colonia en la placa de LB/Amp?
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Durante qué etapa se produce el choque térmico a 42 °C?
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Cuál es la función del medio LB durante la recuperación de las células transformadas?
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Qué efecto tiene la rápida alteración de temperatura en el proceso de transformación?
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Study Notes
Transformación de E. coli
- Método rápido para la transformación: Se usa E. coli competente para incorporar ADN plasmídico (pAMP) con gen de resistencia a la ampicilina.
- Detección de transformantes: Se identifica por resistencia a la ampicilina.
- Preparación de células: Se toman de placas de agar nutritivo (o LB) y se resuspende en CaCl2.
- Adición del plásmido: Se añade el plásmido pAMP a una de las suspensiones.
- Incubación: 15 minutos a 0°C, luego choque térmico a 42°C.
- Placas de cultivo: Posteriormente se cultivan en medio LB con ampicilina (LB/Amp) y medio sin antibiótico.
- Observación: Las colonias resistentes crecerán en el medio LB/Amp, representando un evento de transformación.
Pasos principales de la transformación
- Pre-incubación: Las células se incuban en una solución de cationes (CaCl2), lo que facilita la entrada del ADN.
- Incubación: Se añade el ADN y se continúa la incubación a 0°C.
- Choque de temperatura: Un breve choque a 42°C facilita la entrada del ADN en las células.
- Recuperación: Se añade medio LB, se incuba a 37°C y se plaquea en medio selectivo.
Método de transformación simplificado (colonias)
- Omite pre-incubación y recuperación.
- Se inicia con colonias directamente del agar.
- Elimina la necesidad de cultivos líquidos y equipo para agitación.
- Ventajas: menor tiempo y menor necesidad de equipos.
Ineficiencia del método de colonias
- Eficiencia de transformación (5x10³ a 5x10⁴ colonias/µg) 200 veces menor que el método clásico (5x10⁴ a 10⁶ colonias/µg) .
- Adecuado para ADN plasmídico intacto, pero marginal con ADN ligado o lineal.
Mantención de líneas celulares de E. coli
- Importante monitorear las células usadas.
- Los cultivos con baja transformación deben descartarse.
- Pases repetidos pueden perder la competencia celular.
- La congelación inapropiada reduce la competencia.
- Conservación óptima: Temperatura ambiente en medio inclinado o placas estriadas.
Plásmido pAMP
- Para demostración de transformación a resistencia a antibióticos.
- Derivado de pUC (alta capacidad de replicación).
- Mayor rendimiento que pBR322.
- Construcción didáctica para uso con pKAN (fragmentos de restricción identificables).
Selección con ampicilina
- Marcador de resistencia práctico.
- Mata solo células en replicación, al atacar la pared celular.
- Las células transformadas pueden ser plaqueadas con ampicilina directamente después del choque.
Selección con kanamicina
- Requiere etapa de recuperación (antes del plaqueado).
- Mata todas las células que no expresan la proteína de resistencia.
Colonias de E. coli MM294
- Provee buen rendimiento de ADN plasmídico.
- Tipo salvaje, sin plásmidos.
- Óptima utilización dentro de las 2 semanas; almacenar a 4°C.
- Incubación de 12 a 24 horas a 37°C para mejores resultados; incubación a temperatura ambiente (máximo 24 horas) también es aceptable.
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Description
Este cuestionario explora el proceso de transformación de E. coli utilizando ADN plasmídico. Se cubren desde la preparación de células competentes hasta la identificación de transformantes a través de la resistencia a la ampicilina. Ideal para estudiantes de biología molecular y genética.
