T11Técnicas de Separación: Introducción y Principios

Introducción a las Técnicas de Separación

• Las técnicas de separación de sustancias y/o moléculas dan la habilidad de cuantificar los componentes individuales dentro de una muestra biológica después de haberlos separado.
• Inicialmente, la cromatografía y la extracción con disolventes se usaron para separar componentes.
• La separación a través de disolventes depende de la solubilidad de las moléculas.
• Se pueden hacer estudios de extracción de macromoléculas como lípidos (usando disolventes orgánicos), proteínas (usando agentes de precipitación) y ácidos nucleicos (usando extracciones de cloroformo).

Principios Básicos de las Técnicas de Separación

• Las técnicas de separación dependen de las propiedades físicas de las moléculas y sustancias, incluyendo polaridad, tamaño, carga y afinidad.
• La polaridad depende del número de enlaces y de la distribución de las cargas de una molécula.
• Una mayor polaridad resulta en mayor interacción entre moléculas polares, afectando la volatilidad, solubilidad y adsorción.
• El tamaño de las moléculas ayuda a diferenciar los analitos.
• Las sustancias con diferentes tamaños se separan usando técnicas como la centrifugación y la diálisis.
• Las moléculas pueden tener carga dependiendo del pH del medio, lo que permite la separación basada en la afinidad a dicho medio.

Metodos Basicos de Separacion de Sustancias

• Las técnicas de separación se utilizan en laboratorios para aislar analitos de una muestra.
• Una muestra es una combinación de dos o más sustancias.
• Las mezclas heterogéneas permiten la separación mecánica debido a las diferencias entre los analitos que las componen.
• Las técnicas utilizadas para las mezclas heterogéneas son la filtración, la centrifugación, y la decantación.
• Para separar mezclas homogéneas, se usan métodos difusionales como la cromatografía.
• Las técnicas de separación se clasifican también según la solubilidad, la densidad y la movilidad eléctrica.
• Las propiedades físicas emplean la filtración, la centrifugación y la decantación por diferencias en la densidad y el tamaño de las partículas.
• Las propiedades electroquímicas permiten examinar la movilidad de las moléculas a través de un campo eléctrico.
• La solubilidad facilita la separación de los analitos según su solubilidad a través de la cromatografía o la extracción.

Técnicas Cromatográficas

• La cromatografía separa los analitos de una muestra basándose en la migración de sus componentes para determinar su concentración e identidad.
• Los componentes son arrastrados por una fase móvil a través de una fase estacionaria porosa, dependiendo de su afinidad.
• Los tipos de cromatografía incluyen la cromatografía en papel o plana y la cromatografía en columna, según el contacto entre la fase móvil y la fija.
• También incluye la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases, según el estado de las fases.
• La cromatografía se clasifica en cromatografía de adsorción, de intercambio iónico y de afinidad de acuerdo a cómo los analitos interactúan con la fase fija.
• Mijaíl Tswett fundó el término "cromatografía" en 1906 tras la separación de pigmentos vegetales.
• La cromatografía basada en la polaridad es de las más utilizadas en los laboratorios
• La cromatografía de intercambio iónico separa los analitos en función de su carga con respecto al pH del medio en el que se encuentran.
• La cromatografía de permeabilidad, también llamada cribado molecular, clasifica las moléculas de acuerdo con el tamaño y la forma,utilizando materiales como el dextrano, la agarosa y la poliacrilamida.

Cromatografía Basada en la Polaridad

• Con la cromatografía basada en la polaridad se separan moléculas utilizando la polaridad de las fases móvil y estacionaria.
• Las moléculas se desplazan según su polaridad entre dos fases obteniéndose un coeficiente de reparto (K).
• La fórmula del coeficiente de reparto es K = [disolvente 1] / [disolvente 2].
• Los distintos tipos de cromatografía de polaridad varían en características y estados.
• La cromatografía de adsorción causa que la migración de los analitos ocurra por la fase estacionaria sólida y requiere seleccionar un absorbente polar o apolar.
• En la cromatografía gas-líquido (GLC) la separación de los analitos sucede por volatilidad. a más volatilidad tenga la muestra, mayor relación con la fase móvil gaseosa.
• En la cromatografía líquida de alta precisión (HPLC) ambas fases son líquidos inmiscibles, por lo que los componentes de la muestra se desplazan en función de la solubilidad y polaridad en cada una de ellas.

Electroforesis

• La electroforesis es una técnica fundamental en el laboratorio que sirve para separar analitos cargados en una muestra a través de un campo eléctrico.
• Lo anterior permite que las partículas migren con distinta velocidad dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas, intensidad del campo eléctrico, y características del medio.
• Con esta técnica se pueden separar proteínas, ácidos nucleicos, aminoácidos y péptidos de acuerdo con su carga, forma y tamaño.
• Los componentes del equipo son: fuente de alimentación eléctrica, cubeta y soporte.
• Con la fuente de alimentación eléctrica, compuestos por un ánodo y por un cátodo, los analitos migran.
• La cubeta está conformada por un puente que sostiene la muestra, y por una disolución tampón.
• El soporte contiene la muestra y no tiene carga.
• El soporte puede ser de acetato de celulosa, de gel de agarosa, de poliacrilamina o de almidón.
• Los factores que afectan la velocidad de migración de los analitos en la electroforesis son el soporte, el tampón, la naturaleza de los analitos (tamaño y forma), el campo eléctrico y el tiempo.
• Entre los tipos de electroforesis se encuentran: electroforesis de acetato de celulosa, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de poliacrilamina, inmunoelectroforesis y electroforesis capilar.
• La electroforesis de acetato de celulosa es un método para estudiar las proteínas plasmáticas.
• Los resultados obtenidos se les denomina proteinograma.
• La electroforesis en gel de agarosa es la técnica utilizada para el estudio de ADN luego de la extracción y amplificación mediante PCR.
• Durante la electroforesis en gel de agarosa se utiliza bromuro de etidio para observar los resultados.
• Durante la electroforesis en gel de agarosa se utiliza una disolución tampón TAE (tris, acetato y EDTA) y marcadores de color azul de bromofenol.
• La electroforesis en gel de poliacrilamida también es utilizada para el estudio de proteínas y fragmentos pequeños de ADN y ARN.
• La inmunoelectroforesis ayuda a cuantificar la concentración de inmunoglobulinas de la sangre.
• La electroforesis capilar se usa en estudios de ADN y proteínas gracias a que separa los analitos según su movilidad electroforética.

Interpretación de Resultados de Electroforesis

• Después de finalizar con cada técnica, se deben observar y llevar a cabo interpretaciones para su análisis.
• Para la electroforesis de proteínas de suero en acetato de celulosa, los resultados se pueden interpretar de dos formas:
  • Espectrofotometría, que nos permite medir la absorbancia (longitud de onda) de cada una de las franjas establecidas en la electroforesis.
  • Densitometría, que nos permite estudiar con un proteinograma cada parte de la proteína fragmentada.
• Si se procede con electroforesis en gel de agarosa, el bromuro de etidio es imprescindible para visualizar cada banda de ADN, calcular su migración y cuantificar su peso molecular una vez obtenidos los resultados,.
• Durante la cuantificación y visualización molecular se debe tener en cuenta que durante unos instantes la muestra estará sometida a luz ultravioleta, por lo que es necesario protegerse debido a que es perjudicial para la salud.

Diálisis

• La diálisis es una técnica para la separación de moléculas de tamaño diferente.
• La diálisis separa analitos de una muestra mediante membranas semipermeables.
• Las membranas semipermeables permiten el paso de biomoléculas pequeñas a través de poros por la diferencia de concentración a ambos lados de la membrana.
• El movimiento browniano es el movimiento aleatorio de analitos y compuestos en la muestra debido a choques entre sí y con las paredes del recipiente.

Filtración

• La filtración separa los componentes de una muestra basándose en el tamaño.
• Durante el proceso de filtración se obtienen las siguientes fracciones:
  • Efluente: muestra a filtrar.
  • Filtrado: muestra que pasa a través del filtro.
  • Torta: partículas de residuo que quedan en el filtro.
• Los materiales para cada filtración dependerá del tipo de filtración.
• Si se necesita obtener la parte sólida de una muestra, se utilizaran filtros cónicos y embudo cónico.
• Si lo que se quiere obtener es una gran cantidad de sustancia, se utilizaran filtros planos y un embudo Büchner.
• Algunos tipos de los tipos de filtración son la microfiltración, ultrafiltración y nanofiltración, que se diferencian por el tamaño de partículas que separan.
• La microfiltración retiene sólidos, moléculas de gran tamaño y bacterias con un tamaño de poro del filtro de 0,1 – 10 μm
• La ultrafiltración retiene macromoléculas y virus con un tamaño de poro del filtro entre 50 – 1000 Å.
• La nanofiltración iones y moléculas de pequeño tamaño con un tamaño de poro del filtro entre 2 – 50 Å.
• La ultrafiltración es la más utilizada permitiendo separar proteínas de muestras biológicas como sangre y orina.

Centrifugación

• La centrifugación separa muestras heterogéneas a través de una fuerza centrífuga y es muy similar a la filtración.
• La fuerza centrifuga aleja las partículas del centro de rotación mediante un movimiento circular.
• Para distinguir los tipos se toma en cuenta la velocidad del giro o revoluciones por minuto (rpm):
  • La centrífuga de baja velocidad alcanza entre 4000 a 5000 rpm y separa minerales de muestras biológicas (sangre y orina).
  • La centrífuga de alta velocidad alcanza entre 18000 a 25000 rpm y necesita de un sistema de refrigeración y vacío.
  • La ultracentrifugación alcanza más de 50000 rpm usando también sistemas de refrigeración y vacío, y separan macromoléculas y virus.
• Según su función, la centrifugación se distingue en:
  • Microcentrífugas, que se utilizan en biología molecular.
  • Citocentrífugas, que separan muestras líquidas como orina y líquido cefalorraquídeo.
  • Microhematocrito, que se utilizan pruebas de sangre.
• Para los tipos de centrifugación, se distinguen la analítica y la preparativa.
• El personal de laboratorio debe conocer el funcionamiento y mantenimiento de las centrífugas utilizando procedimientos estandarizados

Material de Laboratorio Necesario para la Separación

• Para llevar a cabo la cromatografía es necesario un gas portador, bomba impulsora, inyector, columna, horno, detectores y sistema registrador integrador
• Para la filtración por gravedad se necesitan un matraz Erlenmeyer, un embudo cónico y papel de celulosa.
• Para la filtración al vacío se necesitan un embudo Büchner, matraz Kitasato y la bomba de vacío.
• Para la centrifugación es necesario una centrifugadora, tubos Eppendorf o específicos según el tipo de centrífuga.

Caso práctico 1: La Decantación

• La decantación separa los componentes de las muestras heterogéneas según sus diferencias de densidades
• Si se deja reposar la muestra por un tiempo determinado, las fases de la muestra se separarán según su densidad. La fase de mayor densidad se precipitará y la fase de menos densidad se sedimentará al fondo del recipiente.
• En los laboratorios clínicos se utiliza para clarificar líquidos y decantar suspensiones entre un sólido y un líquido (muestra de sangre).
• La técnica se utiliza para hacer una separación de sólidos, para luego realizar una filtración o centrifugación posterior.
• La decantación líquido-líquido se hace utilizando un embudo de decantación.

Caso Practico 2: Técnicas de separación y análisis de las proteínas

• La electroforesis capilar es de las técnicas más utilizadas hoy en día en laboratorios clínicos.
• Con la electroforesis es más fácil separar las proteínas y llevar a cabo un análisis más ordenado y con resultados más sólidos, por ejemplo, es capaz de separar cualquier tipo de tamaño molecular sin tener que generar grandes cantidades de muestras.
• Después de que la muestra es introducida al equipo, es sometida al campo eléctrico lo que genera la separación de proteínas en tubos capilares del producto.
• El control y adquisición de los datos son almacenados en un ordenador luego de ser almacenados en un detector.

Aplicaciones en el Laboratorio Clínico y Anatomopatológico

• En laboratorios, las técnicas de separación permiten obtener analitos separados de cada muestra.
• Con estas técnicas se puede determinar la concentración de los analitos o si están presentes en una muestra.
• Las aplicaciones de separación abarcan técnicas de purificación (separación de impurezas), extraer sustancias concretas para futuros estudios, identificar analitos en mezclas y medir la concentración de sustancias.
• La centrifugación es una de las técnicas más utilizadas, en centrifugaciones preparativas y analíticas.
• Las centrifugaciones preparativas se utilizan para la separación de biomoléculas según la densidad. Las centrifugaciones analíticas permiten obtener información sobre las partículas, utilizada material muy similares.
• Por medio de la extracción de componentes de la sangre es más fácil realizar estudios de laboratorio sobre leucocitos, plasma, componentes celulares, estudios de orina entre otros.

Este texto explora las técnicas de separación de sustancias y moléculas, destacando su importancia en la cuantificación de componentes en muestras biológicas. Se discuten métodos iniciales como la cromatografía y la extracción con disolventes, así como la influencia de las propiedades físicas de las moléculas, incluyendo polaridad, tamaño y carga, en los procesos de separación.