Técnicas de separación: Introducción y principios

Introducción a las técnicas de separación

• Las técnicas de separación de sustancias y moléculas permiten cuantificar los componentes de una muestra biológica después de su separación.
• Inicialmente, la cromatografía y la extracción con disolventes fueron las primeras técnicas empleadas para la separación de componentes.
• La separación se basa en la solubilidad de las moléculas.
• Se pueden utilizar disolventes orgánicos para extraer lípidos, agentes de precipitación para proteínas y cloroformo para ácidos nucleicos.

Principios básicos de las técnicas de separación

• Las técnicas de separación se basan en las propiedades físicas de las moléculas y sustancias de una muestra, como polaridad, tamaño, carga y afinidad.
• La magnitud de la polaridad influye la interacción entre moléculas polares, la volatilidad, la solubilidad y la capacidad de adsorción
• Se pueden separar analitos según su tamaño mediante centrifugación y diálisis.
• Los analitos se pueden separar según la afinidad por el pH del medio en el que se encuentran.

Métodos básicos de separación de sustancias

• Los laboratorios usan técnicas de separación para aislar analitos de una muestra que puede contener dos o más sustancias.
• Las mezclas heterogéneas permiten la separación mediante sistemas mecánicos como filtración, centrifugación y decantación.
• Las mezclas homogéneas requieren métodos difusionales como la cromatografía para separar sus componentes.

Clasificación de técnicas de separación

• Las técnicas de separación se clasifican según la solubilidad, la densidad y la movilidad eléctrica:
• Las propiedades físicas utilizan filtración, centrifugación y decantación para separar por diferencias de densidad y tamaño de partículas.
• Las propiedades electroquímicas se utilizan para estudiar la movilidad de moléculas mediante un campo eléctrico.
• La separación por solubilidad usa técnicas como la cromatografía o la extracción.

Técnicas cromatográficas

• La cromatografía separa analitos de una muestra basándose en la migración de sus componentes para determinar su concentración e identidad.
• Los componentes son arrastrados por con una fase móvil (eluyente o disolvente) a través de una fase fija (material poroso), según la afinidad con las fases.
• Tipos de cromatografía según el contacto entre fases:
• Cromatografía en papel o plana.
• Cromatografía en columna.
• Tipos de cromatografía según el estado de las fases:
• Cromatografía líquida de alta precisión (HPLC).
• Cromatografía de gases.
• Tipos de cromatografía según la interacción de los analitos con la fase fija:
• Adsorción.
• Intercambio iónico.
• Afinidad.
• Mijaíl Tswett acuñó el término "cromatografía" en 1906 para la separación de pigmentos vegetales.
• Gracias a diferencias en solubilidad los pigmentos migraban a distintas velocidades al entrar en contacto con el eluyente.
• La cromatografía basada en la polaridad es ampliamente utilizada en laboratorios siendo uno de los tipos de cromatografías más comunes.
• Es posible utilizar la cromatografía de intercambio iónico, que separa analitos según su carga con relación al pH del medio, y la cromatografía de permeabilidad o cribado molecular, que separa las moléculas por tamaño y forma utilizando materiales como dextrano, agarosa y poliacrilamida.

Cromatografía basada en la polaridad

• Permite separar moléculas según la polaridad mediante una fase móvil y estacionaria con diferente polaridad, similar a dos líquidos inmiscibles.
• Las moléculas migran dependiendo de su polaridad entre ambas fases.
• El coeficiente de reparto (K) determina la concentración de los analitos en ambas fases y se expresa como K = [disolvente 1] / [disolvente 2].
• Los tipos de cromatografía de polaridad se basan en las características y estados de las fases (gaseoso, líquido o sólido).

Tipos de cromatografía y principios de separación:

• Cromatografía de adsorción: la migración de los analitos se produce por la fase estacionaria (sólida) y se debe elegir un tipo de absorbente polar o apolar para influir en la velocidad de separación.
• Cromatografía gas-líquido (GLC): los analitos se separan por volatilidad y la afinidad con la fase móvil (gas como helio o nitrógeno) determinará la relación.
• Cromatografía líquida de alta precisión (HPLC): la polaridad y solubilidad influyen en el desplazamiento de los componentes de la muestra ya que ambas fases son líquidos inmiscibles (disolventes orgánicos).

Electroforesis: Fundamentos

• La electroforesis es una técnica de laboratorio común que separa analitos cargados mediante un campo eléctrico.
• Las partículas migran a diferentes velocidades según propiedades fisicoquímicas, intensidad del campo eléctrico y características del medio.
• Posibilita la separación de proteínas, ácidos nucleicos, aminoácidos y péptidos según carga, forma y tamaño.

Componentes del equipo de electroforesis:

• La fuente de alimentación eléctrica permite la migración de los analitos y está compuesta por electrodos (ánodo y cátodo) unidos a la cubeta.
• La cubeta cuenta con un puente para soportar la muestra y una disolución tampón para mantener acidificado el ánodo y basificado el cátodo.
• El soporte debe carecer de carga para evitar la variación de los resultados.
• El soporte puede ser acetato de celulosa, gel de agarosa, poliacrilamida o almidón.

Factores que influyen en la velocidad de migración de los analitos:

• Soporte y tampón.
• Naturaleza de los analitos (forma y tamaño): un mayor tamaño e irregularidad reducen la velocidad de migración.
• Campo eléctrico y tiempo: un mayor tiempo facilita el distanciamiento entre las moléculas.

Tipos de electroforesis:

• Electroforesis de acetato de celulosa: se utiliza para estudiar las proteínas plasmáticas, y los resultados se llaman proteinograma.
• Electroforesis en gel de agarosa: se usa para estudiar el ADN después de la PCR y usa bromuro de etidio para visualizar los resultados. El gel se prepara con agarosa al 1,5% y se solidifica antes de añadir la muestra.
• Electroforesis en gel de poliacrilamida: se utiliza para el estudio de proteínas, ADN y ARN.
• Existen métodos como la inmunoelectroforesis y la electroforesis capilar que se usan para cuantificar inmunoglobulinas en sangre y estudiar ADN y proteínas.

Interpretación de resultados de la electroforesis:

• Tras cada técnica, es fundamental interpretar los resultados.

Interpretación de electroforesis de proteínas de suero en acetato de celulosa:

• Se puede realizar mediante espectrofotometría para medir la absorbancia en longitudes de onda o densitometría para estudiar las partes fragmentadas con un proteinograma.
• La electroforesis en gel de agarosa requiere el uso de bromuro de etidio.

Electroforesis en gel de agarosa

• Es imprescindible el uso de bromuro de etidio para visualizar cada una de las bandas de ADN
• Saber la migración de las mismas y cuantificar su peso molecular.
• Se debe tener precaución con la luz ultravioleta ya que esta es perjudicial.

Diálisis

• La diálisis separa moléculas de diferentes tamaños mediante membranas semipermeables.
• Estas membranas permiten el paso de biomoléculas pequeñas a través de sus poros gracias a la diferencia de concentración a ambos lados.
• El movimiento browniano influye, generando un movimiento aleatorio entre analitos y paredes del recipiente.
• Las partículas pequeñas pueden atravesar la membrana, mientras que las macromoléculas como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos y glúcidos no pueden.

Filtración

• Una técnica común para separar los componentes de una muestra por tamaño.

Las fracciones obtenidas son:

• Efluente: muestra a filtrar.
• Filtrado: muestra que atraviesa el filtro.
• Torta: partículas de residuo que quedan en el filtro. El material necesario depende el tipo filtración. Si se quiere la parte sólida se utiliza filtros cónicos o de pliegues y embudo cónico (filtración por gravedad). Si se quiere una gran cantidad de sustancia, se utiliza filtros planos y un embudo Büchner (filtración al vacío).

Tipos de filtración:

• Microfiltración se distinguen distintos tipos como la microfiltración, ultrafiltración y nanofiltración.
• Ultrafiltración: es la más utilizada, permite separar proteínas de muestras biológicas como sangre y orina.
• Nanofiltración
• Microfiltración

Centrifugación

• La centrifugación separa muestras heterogéneas mediante fuerza centrífuga.
• La fuerza centrífuga es la fuerza que aleja las partículas del centro de rotación mediante un movimiento circular.
• Los tipos de centrífugas varían según su velocidad de giro (rpm).
• Centrífugas de baja velocidad (4000-5000 rpm) separan elementos celulares y minerales de muestras biológicas como sangre y orina.
• Centrífugas de alta velocidad (18000–25000 rpm): requieren refrigeración y vacío para evitar temperaturas elevadas y separan componentes subcelulares.
• Ultracentrífugas (más de 50000 rpm) requieren sistemas de refrigeración y vacío para separar macromoléculas y microorganismos como virus.
• Las microcentrífugas se usa en biología molecular.
• Las citocentrífugas se usa en estudios de orina, entre otros.
• Microhematocrito se usa en estudio de sangre.
• Existen las centrifugaciones analíticas y preparativas.
• Es importante conocer el funcionamiento y mantenimiento de las centrífugas.
• Existen procedimientos normalizados de trabajo (PNT) para todos los aparatos.
• El mantenimiento debe ser limpieza y desinfección, mensual para observar el mecanismo y anual por personal específico para un estudio exhaustivo de este.

Material de laboratorio.

• Cromatografía: gas portador, bomba impulsora, inyector, columna, horno, detectores y sistema registrador-integrador.
• Electroforesis: apartado 5.
• Filtración por gravedad: matraz Erlenmeyer, embudo cónico, papel de celulosa y la muestra.
• Filtración al vacío: embudo Büchner, matraz kitasato, bomba de vacío y muestra.
• Centrifugación: centrífuga, tubos Eppendorf o específicos y tubos filtrantes.

Caso práctico 1: La decantación

• La decantación separa los componentes de una muestra heterogénea basada en diferencias de densidades.
• Al dejar la muestra en reposo, la fase más densa precipita y la menos densa flota.
• Se puede realizar decantación líquido-líquido mediante embudo de decantación.

Caso práctico 2: Otras técnicas de separación y análisis de las proteínas

• En laboratorios clínicos, la electroforesis capilar es una técnica de separación usada para separar proteínas.
• Realiza un análisis preciso y con mayor resolución de la muestra.
• Esta técnica separa moléculas de cualquier tamaño sin necesidad de volúmenes grandes y detecta las proteínas mediante espectrofotometría.
• Se somete al campo eléctrico y se comienzan la separación.
• La información se recopila tras ser analizada por el detector.

Aplicaciones en el laboratorio clínico y anatomopatológico

• Se utilizan técnicas de separación para obtener componentes o sustancias separados de una muestra y determinar su concentración o presencia.
• Las aplicaciones en laboratorio incluyen técnicas de purificación, extracción de sustancias, identificación de analitos y medición de concentraciones.
• Las centrifugaciones preparativas y analíticas son comúnmente utilizadas, pese a la diversidad en sus objetivos.
• Las preparativas se usan para la separación de biomoléculas basadas en la densidad, mientras que los analíticos son esenciales para obtener información de las partículas.
• Se pueden hacer estudios mediante la obtención de componentes de la sangre como los leucocitos.

Resumen

• Existen diferentes técnicas de separación que se hace según las propiedades de la muestra como las físicas, electroquímicas y solubilidad.
• La filtración, centrifugación y decantación se basa en las propiedades físicas y se separan por tamaños.
• La electroforesis separa por un campo eléctrico y se basa en las electroquímicas.
• La cromatografía separa por migración para determinar la concentración y se basa en su solubilidad.
• Requiere una centrífuga y tubos.

Introducción a las técnicas de separación de sustancias y moléculas para cuantificar componentes biológicos. Se basan en propiedades físicas como polaridad, tamaño y carga. La polaridad influye en la interacción, volatilidad y solubilidad.