genetica curs 2

Curs 2: Genetica Umană

• Subiect: Structura genomului uman
• Genomul uman (GU) este conţinutul ADN celular sau ansamblul integrat al celor 25 de molecule diferite de ADN (24 în nucleu: 22 autosomi + X + Y și 1 în mitocondrii).
• Genomul uman conţine 3,2 miliarde de perechi de baze (pb).
• Genomul uman este format din genom nuclear (99,5% ADN, complex) și genom mitocondrial (0,5% ADN, simplu și mic).

Structura genomului uman

• Genomul uman este format din genom nuclear (complex, 99,5% ADN) + genom mitocondrial (simplu şi mic, 0,5%).
• Genomul nuclear conţine 25.000 gene, cu 3,2 miliarde de perechi de baze.
• ADN genic (25%) + ADN extragenic (75%).
• Genomul mitocondrial conţine 16,6 Kb 37 gene, ADN circular, compact, fără proteine, 97% secvenţe codante.

Genomul nuclear

• Enorm (3,2 miliarde pb).
• Fragmentat: 22A + X + Y molecule de ADN + proteine cromozomiale.
• Complex, heterogen:
  • ADN nerepetitiv
  • ADN moderat repetitiv
  • ADN înalt repetitiv
  • ADN genic (25%) + ADN extragenic (75%)

ADN genic (25%)

• Gena este unitatea de informaţie genetică.
• Codifică un produs primar specific (proteine sau ARN).
• Structura genelor este complexă – ADN genic.
• ADN codant = exoni (10%).
• ADN necodant (90%) = introni, secvenţe reglare, gene nefuncţionale (pseudogene) sau fragmente de gene.

ADN extragenic (75%)

• Secvenţe netrasncrise (necodante).
• Funcții puţin cunoscute: rol "tampon" a mutaţiilor, împerecherea corectă a cromozomilor omologi în meioză şi recombinarea genică - sursă de variabilitate.
• Alcătuit din:
  • ADN nerepetitiv (secvenţe unice sau un număr mic de copii - 60%)
  • ADN repetitiv (40%).

ADN extragenic nerepetitiv (60%)

• Secvențe unice sau un număr mic de copii.
• Duplicații segmentale (5% GU) - blocuri (~ 10Kb) ce flanchează genele (pe același cromozom).
• Rol în sinapsa corectă a omologilor în meioză.
• Importanța: fiind identice - pot genera erori de împerechere a cromozomilor omologi. CO inegal → mutații: duplicații / deleții genice - boli genomice.

ADN extragenic repetitiv (40%)

• ADN moderat repetitiv (~30%): secvențe scurte repetate, dispersate în genom (ex. SINEs şi LINEs)
• ADN înalt repetitiv (~10%): secvențe foarte scurte, repetate în tandem →, de milioane de ori (ADN satelit, minisatelit şi microsatelit)

Genomul mitocondrial

• ADNmt – câteva mii de copii per celulă = 0,5%.
• Genomul mitocondrial diferă de genomul nuclear prin: mărime (mic, 16569 pb), forma circulară, lipsa proteinei asociate, absența ADN repetitiv, compact - 97% secvenţe codante, 37 gene contigue fără introni. Codul genetic mitocondrial diferă puţin de cel nuclear.

Genomul mitocondrial (continuare)

• Genomul mitocondrial al zigotului provine, exclusiv de la mamă.
• ADNmt poate suferi mutații germinale sau somatice.
• Mutațiile germinale produc o serie de boli degenerative in SNC, SNP, mușchi, etc., care se transmit maternal.
• ADNmt poate suferi mutații somatice după naștere (produse de radicalii liberi de O2 generați în mitocondrii), favorizate de structura ADNmt (absența histonelor). Mutațiile se acumulează rapid, determină scăderea producției de energie → boli degenerative, cancer și senescență.

Aparatul genetic al celulei

• Structuri celulare cu ADN: nucleul (99,5% ADN) și mitocondrii (0,5% ADN).
• Nucleu:
  • ADN + proteine = cromatină
  • Cromatina/cromozomi = organizare morfo-funcțională a materialului genetic în interfază și diviziune.
• Mitocondrii: origine exclusiv maternă.

Cromatina (v. LP)

• Cromatina = ADN + proteine.
• Exclusiv în nucleu.
• Două tipuri morfo-funcționale distincte:
  • Eucromatină (activă genetic, dispersată)
  • Heterocromatină (inactivă genetic, condensată).

Cromatina sexuală

• Cromatina X – rezultat al inactivarea unui cromozom X (la femeile XX).
• Ipoteza Lyon (1961): inactivarea cromozomului X este totală; un singur X activ (corect = parțială*).
• Se produce precoce și este definitivă (posibil uneori reversibilă).
• Loc la întâmplare (XM sau XP) și independent în fiecare celulă (posibil = uneori ne întâmplătoare);

Cromatina Y

• Reprezintă heterocromatina de pe 2/3 distale braţ lung cromozom Y.
• Colorată cu flurocromi (vizibilă la microscop UV).
• Corpuscul F.
• Exclusiv la bărbați.
• Nr. corpusculi F = nr. cromozomi Y.

Structura supramoleculară a cromatinei

• Analiza cromatinei la microscopul electronic evidențiază un sistem ierarhizat de compactare a moleculei de ADN.
• Fibre de cromatină, de dimensiuni diferite, alcătuite din ADN, histone și proteine nehistonice.

Filamentul cu nucleozomi (10 nm)

• Un segment de ADN (146 pb) se înfășoară (1 tur și 3/4) în jurul unui miez histonic cilindric (8 mol.).
• Nucleosomii legați printr-un segment de ADN liniar (60 pb) → filamentul cu nucleozomi (~ "șirag de mărgele").
• Menținut împachetat de către histona H1.
• Rata de compactare a ADN nativ este de circa 10:1

Fibra de cromatină (30 nm)

• Filamentul cu nucleozomi se spiralizează în solenoid → fibra de cromatină (FC) (30 nm).
• Rata de compactare a filamentului cu nucleozomi este de circa 5:1

Fibra pliată în bucle laterale (300 nm)

• FC (30 nm) se pliază în bucle laterale ataşate la un "schelet" de proteine nonhistoince → FPBL = 300nm
• O buclă (domeniu crs) – de ~75Kb – câteva gene = unitate funcţională (de transcripţie şi replicare).
• Rată de compactare este de circa 10:1

Cromozomul metafazic (300 nm)

• Fibra de cromatină se condensează (20:1) → cromatida (700 nm), reprezentând un cromozom.
• Cromozomii – grad maxim de condensare în metafaza diviziunii.

Structura supramoleculară a cromatinei (sinteză)

• Fiecare cromatidă are o singură moleculă de ADN organizată ierarhic și compactată în mai multe structuri succesive, permitând localizarea în nucleu și distribuția corectă a materialului genetic în diviziune.

Buclele fibrei de 300 nm

• Buclele fibrei de 300 nm se fixează neregulat de scheletul proteic: zone cu mici aglomerări = cromomere, zone mai laxe.
• Condensarea cromatidelor în profază, unirea cromomerelelor și formarea benzilor intens colorate (benzi G + = heterocromatină).
• Alternanța cu benzi mai puțin condensate (benzi R + = eucromatină).

Fiecare cromozom este o structură internă eterogenă caracteristică

• Fiecare cromozom are o structură internă eterogenă caracteristică.
• Permiti precizarea cromozomilor.

Cromozomii umani

• Cromozomi = organite nucleare care fixează intens coloranți bazici ("chroma" + "soma").
• Funcții: Transportă + distribuie materialul genetic → stabilitate procese ereditare.
• Asigură recombinarea genetică în meioză.

Cromatidele(continuare)

• Crz = bicromatidian← după replicare.
• Cromatidele surori = 1 moleculă de ADN + Pr.

Centromerul

• Locul de atașare a cromatidelor surori (prin proteina ISS).
• Unic → constricție primară.
• Împarte cromatidele în brațele "p" și "q".
• Poziție fixă determinată de o secvență ADN repetitiv (ADN satelit) identică la toți cromozomii).
• ADN specific fiecărui cromozom.

Centromerul (continuare)

• Rol esenţial pentru SEGREGAREA cromozomilor din cursul diviziunii celulare.
• ADN cen se fixează proteine CENP = kinetocorii → locul de fixare pentru filamente fus de diviziune.
• Tracta cromatidele la poli (în anafază).

Telomerele

• Structuri specializate, formate din ADN repetitiv + proteine asociate.
• Acoperă și protejează capetele cromozomilor.
• Funcții: menținerea integrității structurale; asigurarea replicării complete; poziționare cromozomilor omologi în nucleu.

Elemente caracteristice unor cromozomi

• Satelit = mase mici de heterocromatina ataşate pe braţele scurte ale cromozomilor acrocentrici (exceptând Y).
• Constrictii secundare = blocuri de heterocromatină.
• Situsuri fragile = lacune necolorate pe cromatidele unor cromozomi.

Elemente specifice fiecărui cromozom (BENZILE)

• Benzile reflectă structura internă, heterogenă, a cromozomilor.
• Fiecare cromozom are un model caracteristic de benzi → identificarea precisă.

Tehnici de analiză cromozomială

• Obținerea de celule în diviziune (culturi celulare, amniocenteză, biopsie).
• Obținerea de celule în metafază (blocare cu colchicină).
• Obținerea preparatelor: hipotonizare, fixare, etalare pe lame, colorare (eventual + marcaj în benzi).
• Analiza preparatelor → cariotip.

Evoluția tehnicilor de analiză cromozomială

• Generația I (1956): cromozomi uniform colorați, identificare imprecisă.
• Generația II (1970): marcaj în benzi G sau R (400 benzi), identificare precisă.
• Generația III (1977): înaltă rezoluție (550-850 benzi), o bandă = 3-5 Mb.
• Generația IV (1991): citogenetică moleculară (FISH metafazic / interfazic), identificarea precisă a remanieriilor cromozomiale şi microdeleţiilor.

Ce este FISH?

• Tehnică de analiză cromosomica prin hibridizare fluorescentă in situ (FISH).
• Hibridizare (formarea de legături de hidrogen) între o sondă specifică de ADN (marcată fluorescent) și secvența complementară din segmentul cromosomic.

Avantajele tehnicii FISH

• Sensibilitate și specificitate crescute.
• Timp scurt de obținere a rezultatelor definitive.
• Posibilitatea analizei de celule în diviziune sau interfază.
• Rezoluție mare (sonde până la 40 kb).

Dezavantajele tehnicii FISH

• Cost ridicat al sondelor și reactivilor.
• Cost ridicat al aparatelor folosite.
• Gradul înalt de tehnicitate.