Sistematica 4

Nozioni di base sulla sistematica molecolare

• La sistematica molecolare si basa sullo studio del DNA e dell'RNA.
• Gli strumenti di analisi degli acidi nucleici hanno fornito informazioni più affidabili e risolutive sui cambiamenti che si verificano direttamente nei geni.
• La sistematica molecolare si basa su un numero di caratteri più ampio rispetto a quelli morfologici o biochimici, rendendo l'interpretazione più quantificabile.

Progressi e applicazioni della sistematica molecolare

• La disponibilità di dati molecolari è legata allo sviluppo di tecniche e metodi come il DNA ricombinante, la PCR e il sequenziamento.
• I dati molecolari hanno sostenuto le conoscenze morfologiche, confermando la monofilia di gruppi come le famiglie Poaceae, Fabaceae e Rosaceae.
• È stato possibile risolvere conflitti e dubbi, individuando quali gruppi erano effettivamente "sister" in un sistema classificativo.
• In rari casi, i dati molecolari hanno permesso interpretazioni nuove e impreviste, come la monofilia del clado dei glucosinolati (Brassicales) e l'inclusione della famiglia Vochysiaceae nelle Myrtales.

Genomi nelle piante

• In una pianta si trovano tre genomi:
  • Cloroplasto: 135-160 kbp, ereditarietà materna.
  • Mitocondrio: 200-2500 kbp, ereditarietà materna.
  • Nucleo: 1.1 x 10^6 – 110 x 10^9 kbp, ereditarietà biparentale.
• Mitocondri e plastidi hanno genoma organizzato in cromosomi circolari.
• L'ordine dei geni sul cromosoma mitocondriale è variabile e i geni sono divisi da ampie zone di DNA non codificante, pertanto l'ordine dei geni mitocondriali non ha significato sistematico.
• L'organizzazione dei geni plastidiali è stabile sia a livello di organismo, sia di specie.
• Sul cromosoma plastidiale sono presenti due regioni che codificano gli stessi geni, ma in direzione opposta (ripetizioni invertite – IR).
• Riorganizzazioni della sequenza dei geni sul plastidio sono rare e possono essere sfruttate per delimitare i gruppi più importanti.
• L'introduzione o la perdita di geni (o di loro introni) può essere utilizzata per la sistematica.

Analisi dei siti di restrizione

• L'analisi dei siti di restrizione permette di tracciare mappe di singoli geni o di interi genomi.
• Il DNA viene estratto da una pianta e tagliato con enzimi di restrizione, che tagliano in corrispondenza di una precisa sequenza nucleotidica.
• Esempi di enzimi di restrizione:
  • BamHI taglia il DNA in corrispondenza di ogni sequenza GGATCC.
  • EcoRI lo taglia in corrispondenza di GAATCC.
• Tagliando prima con un enzima, poi con un secondo e infine con la coppia di enzimi, si procede all'analisi dei frammenti generati mediante dei gel.
• È possibile riconoscere la sequenza dei siti di restrizione lungo il DNA e quindi distinguere i diversi genomi in base alla posizione dei siti di restrizione.
• Il nome degli enzimi di restrizione deriva dai batteri dai quali sono estratti, come Bacillus amyloliquefaciens e Escherichia coli.

Southern blotting

• Dopo aver ottenuto alcuni genomi di plastidi, non è più necessario ripetere il processo per ogni nuova specie in studio, ma si possono utilizzare i genomi noti come sonde.
• Il frammento di DNA plastidiale noto, marcato con fosforo radioattivo, viene posto su una membrana e denaturato per passare a singolo filamento.
• Si mette poi il tutto a contatto con un DNA plastidiale oggetto di studio anche esso denaturato: le sequenze si possono accoppiare in modo ibrido, indicando le zone di corrispondenza di sequenza, rilevata con emulsione fotografica in corrispondenza delle bande radioattive.
• Questa tecnica prende il nome di Southern blotting, dal suo inventore.

Sequenziamento e PCR (Reazione a catena della polimerasi)

• Il sequenziamento identifica precisamente la corretta sequenza nucleotidica di un tratto di DNA.
• La principale sfida è la disponibilità di sufficienti quantità di DNA di partenza.
• In passato, le porzioni di DNA venivano clonate dentro ai genomi batterici e poi moltiplicate.
• La PCR è usata per aumentare la quantità di DNA per le analisi molecolari.
• La PCR duplica il DNA enzimaticamente, senza ricorrere al clonaggio.
• La PCR si compone di tre fasi ripetute ciclicamente: denaturazione ad alta temperatura, annealing degli inneschi e estensione.
• Occorre disporre di informazioni relative alla sequenza del DNA da moltiplicare, per disegnare gli inneschi (primer) e di una polimerasi resistente alle alte temperature (Taq-polimerasi).
• Nel tampone di reazione si aggiungono il DNA da moltiplicare, i nucleotidi liberi e la Taq-pol.
• Poiché ad ogni ciclo ogni doppia catena iniziale viene duplicata, il procedere della reazione è esponenziale. un singolo doppio filamento, dopo 20 cicli, risulta amplificato fino ad ottenere oltre 2 milioni di filamenti!.

Considerazioni sul sequenziamento

• Per il sequenziamento è possibile disporre di sufficienti quantità di materiale e quindi confrontare geni omologhi di specie e gruppi diversi.
• La PCR introduce errori di replicazione casuali, quindi è opportuno non eccedere nel numero di cicli.
• Per ridurre il rischio di errori, si procede al sequenziamento di entrambi i filamenti di una molecola di DNA.

Scelta del gene e allineamento

• La scelta del gene è critica perché i geni accumulano mutazioni con velocità diverse.
• La differenza di accumulo di mutazioni dipende dal fatto che i prodotti dei geni (proteine o RNA) possono tollerare quantità limitate e differenti di cambiamenti mantenendo ancora la loro funzionalità.
• I geni che codificano per gli istoni sono conservati e mostrano un basso tasso di accumulo di mutazioni.
• Lo spaziatore interno (ITS) dell'RNA può indurre un ripiegamento corretto della molecola anche a fronte di un cambiamento di molti nucleotidi.
• Se un gene cambia lentamente saranno necessari moltissimi dati; al contrario, geni che tollerano un alto numero di mutazioni permettono di studiare gruppi più vicini.
• Una volta scelto un gene e ottenute le sequenze dai diversi gruppi, le sequenze devono essere allineate.
• L'allineamento di un gene è compiuto con alcuni software e successivamente rivisto manualmente.

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