Tema 6

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Questions and Answers

¿Cuál es la principal diferencia entre la secuenciación por síntesis de Illumina y la de Ion Torrent?

Ion Torrent mide la corriente generada por protones liberados, mientras que Illumina mide la fluorescencia emitida. (correct)

Illumina utiliza un solo nucleótido a la vez, mientras que Ion Torrent utiliza múltiples nucleótidos simultáneamente.

Illumina requiere una amplificación clonal previa, mientras que Ion Torrent no.

Ion Torrent detecta la fluorescencia de los nucleótidos, mientras que Illumina mide cambios en el voltaje.

En la amplificación clonal utilizada en Ion Torrent, ¿qué papel desempeñan las beads?

Son el soporte donde se actúa la química de secuenciación. (correct)

Sirven para amplificar diferentes fragmentos de ADN independientes.

Son utilizadas para eliminar secuencias no deseadas durante la secuenciación.

Almacenan la información genética de los nucleótidos incorporados.

Cuando se refiere a la eliminación del agente bloqueante en la secuenciación por síntesis de Illumina, ¿cuál es su impacto en el proceso?

Aumenta la longitud de las cadenas de ADN secuenciadas.

Crea una nueva cadena de ADN sin la necesidad de nucleótidos marcados.

Detiene el flujo de nucleótidos hacia la cadena de ADN.

Permite que los nucleótidos se incorporen a la cadena de ADN sin restricciones. (correct)

¿Cuál es una característica distintiva de la secuenciación por pares (paired-end sequencing) frente a las técnicas mencionadas?

Facilita la lectura de las dos cadenas complementarias de un fragmento de ADN. Signup and view all the answers

En la secuenciación por síntesis, ¿qué sucede con los nucleótidos no incorporados?

Son eliminados durante el lavado entre ciclos. Signup and view all the answers

Qué técnica de secuenciación usa un marcado con un fluoróforo en cada nucleótido para la detección durante el proceso?

Secuenciación por síntesis de Illumina. Signup and view all the answers

En términos de fragmentación y etiquetado en las plataformas descritas, ¿qué enfoque se utiliza comúnmente en Illumina?

Se utilizan adaptadores para unir fragmentos de ADN a domicilio. Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes plataformas pertenece a la segunda generación de secuencionamiento?

Ion Proton Signup and view all the answers

¿Qué proceso es necesario para obtener clones antes de la secuenciación?

Amplificación clonal Signup and view all the answers

¿Qué significa la secuenciación 'Paired-end'?

Secuenciación de dos cadenas diferentes Signup and view all the answers

¿Cuál es el objetivo de la fragmentación y etiquetado en el proceso de secuenciación?

Añadir oligonucleótidos de secuencia conocida Signup and view all the answers

En la tercera generación de secuenciación, un ejemplo de plataforma es:

Helicos Signup and view all the answers

¿Qué característica es distintiva del secuenciador Ion Torrent en comparación con otras plataformas?

Detecta cambios de pH durante la adición de nucleótidos Signup and view all the answers

¿Qué ocurre en el primer paso de la amplificación clonal?

Separación física de los fragmentos Signup and view all the answers

¿Cuál es una limitación común del método de Sanger comparado con las técnicas de la segunda y tercera generación?

Capacidad de obtener grandes volúmenes de secuencias Signup and view all the answers

¿Qué se busca evitar al agregar una extensión dA en 3' de los fragmentos?

Concatemerización de fragmentos Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes afirmaciones describe mejor el método de Sanger?

Requiere la utilización de cuatro series de reacciones que difieren en un único nucleótido dideoxido. Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes tecnologías se corresponde con la secuenciación de molécula individual?

PacBio Signup and view all the answers

En la secuenciación por el método de Sanger, ¿qué permite la utilización de polimerasas termo-resistentes?

Modificar la secuenciación para ADN de doble cadena. Signup and view all the answers

¿Qué implicación tiene la aparición de heterocigotos en organismos diploides en la secuenciación de Sanger?

Genera confusión sobre los datos obtenidos de la secuenciación. Signup and view all the answers

¿Cuál es la principal ventaja del método de secuenciación automatizada sobre el método manual?

Aumenta la velocidad y la precisión en la lectura de secuencias. Signup and view all the answers

¿Qué técnica es específicamente utilizada para obtener genomas de referencia?

Shotgun Signup and view all the answers

En comparación con Sanger, ¿cuál es una característica de las plataformas de secuenciación de segunda generación?

Producen un volumen mayor de datos a un costo menor. Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito del etiquetado diferencial de los dideoxynucleótidos en el método de Sanger?

Identificar y leer específicamente cada nucleótido a través de láser. Signup and view all the answers

¿Qué limitación tiene el método de Sanger al secuenciar fragmentos de ADN más largos?

La lectura se vuelve imprecisa a partir de 1.000 pb. Signup and view all the answers

Study Notes

### Secuenciación por Síntesis

La secuenciación por síntesis utiliza nucleótidos marcados con un fluoróforo y bloqueados en 3' OH (de forma reversible).
Cada ciclo, se incorpora un solo nucleótido a la cadena y se eliminan los no incorporados.
Se mide la fluorescencia específica emitida por el nucleótido incorporado.
Para el siguiente ciclo, se eliminan el agente bloqueante y el fluoróforo del último nucleótido incorporado.

Ion Torrent

En Ion Torrent, un oligonucleótido complementario a P5 o P7 cubre beads (perlas) que están distribuidas en celdas.
Cada celda contiene una o ninguna partícula que lleva muchas copias de la misma secuencia.
Los protones liberados durante la polimerización generan una corriente eléctrica que se detecta.

Estrategias de Secuenciación

La secuenciación de Sanger es limitada en su capacidad de lectura (~1.000 pb).
Las estrategias de secuenciación de segunda y tercera generación abordan la secuenciación de fragmentos más largos.

Secuenciación de Segunda Generación

Amplified Single Molecule Sequencing (secuenciación de molécula individual amplificada)
Ejemplo de tecnologías:
- 454 (Roche)
- Illumina (Solexa)
- SOLiD (Applied Biosystems)
- Ion Torrent (Life Technologies)

Secuenciación de Tercera Generación

Next Next Generation (secuenciación de última generación)
Secuenciación de molécula individual
Ejemplo de tecnologías:
- Helicos (Helicos Genetic Analysis System)
- Pacific Biosciences
- Oxford Nanopore Technologies

Secuenciación Clonal

Necesita la creación de muchas copias idénticas (clones) del fragmento que se va a secuenciar.

“Single Molecule”

Los datos de secuenciación proceden de una única molécula.

Amplificación Clonal

Se separa físicamente los fragmentos.
La amplificación se realiza en dos pasos:
- Adición a los fragmentos de extremos de secuencia conocida.
- Amplificación enzimática de los fragmentos.

Adición de Secuencias Terminales

Para "Paired-end sequencing" (secuenciación de extremos pareados) se añaden secuencias conocidas en los extremos (diferentes en cada extremo).
Se pueden añadir códigos de barras para indicar la procedencia de la muestra.

Fragmentación y Etiquetado

Fragmentación, reparación y modificación de los extremos del ADN:
- Fragmentación del DNA a ~200–600 pb.
- Reparación enzimática de los extremos de los fragmentos.
- Adición de una extensión dA en 3' para evitar concatenación de fragmentos.
- Adición de un adaptador (en forma de Y) con una cola dT para evitar la formación de dímeros de adaptador.

Pacific Biosciences

SMRTbell: es una molécula de DNA circular de cadena sencilla creada al ligar adaptadores de horquilla a los dos lados de un fragmento de DNA de doble cadena.
ZMW (zero-mode waveguide): es una minicelda donde se ubica cada molécula de DNA para la secuenciación.

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Description

Este cuestionario explora los principios de la secuenciación por síntesis y la tecnología Ion Torrent. Se abordan los métodos de incorporación de nucleótidos, medición de fluorescencia y la generación de corriente eléctrica en la secuenciación. Ideal para estudiantes que deseen profundizar en las estrategias de secuenciación avanzadas.