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Questions and Answers
¿Cuál es la principal diferencia entre la secuenciación por síntesis de Illumina y la de Ion Torrent?
¿Cuál es la principal diferencia entre la secuenciación por síntesis de Illumina y la de Ion Torrent?
- Ion Torrent mide la corriente generada por protones liberados, mientras que Illumina mide la fluorescencia emitida. (correct)
- Illumina utiliza un solo nucleótido a la vez, mientras que Ion Torrent utiliza múltiples nucleótidos simultáneamente.
- Illumina requiere una amplificación clonal previa, mientras que Ion Torrent no.
- Ion Torrent detecta la fluorescencia de los nucleótidos, mientras que Illumina mide cambios en el voltaje.
En la amplificación clonal utilizada en Ion Torrent, ¿qué papel desempeñan las beads?
En la amplificación clonal utilizada en Ion Torrent, ¿qué papel desempeñan las beads?
- Son el soporte donde se actúa la química de secuenciación. (correct)
- Sirven para amplificar diferentes fragmentos de ADN independientes.
- Son utilizadas para eliminar secuencias no deseadas durante la secuenciación.
- Almacenan la información genética de los nucleótidos incorporados.
Cuando se refiere a la eliminación del agente bloqueante en la secuenciación por síntesis de Illumina, ¿cuál es su impacto en el proceso?
Cuando se refiere a la eliminación del agente bloqueante en la secuenciación por síntesis de Illumina, ¿cuál es su impacto en el proceso?
- Aumenta la longitud de las cadenas de ADN secuenciadas.
- Crea una nueva cadena de ADN sin la necesidad de nucleótidos marcados.
- Detiene el flujo de nucleótidos hacia la cadena de ADN.
- Permite que los nucleótidos se incorporen a la cadena de ADN sin restricciones. (correct)
¿Cuál es una característica distintiva de la secuenciación por pares (paired-end sequencing) frente a las técnicas mencionadas?
¿Cuál es una característica distintiva de la secuenciación por pares (paired-end sequencing) frente a las técnicas mencionadas?
En la secuenciación por síntesis, ¿qué sucede con los nucleótidos no incorporados?
En la secuenciación por síntesis, ¿qué sucede con los nucleótidos no incorporados?
Qué técnica de secuenciación usa un marcado con un fluoróforo en cada nucleótido para la detección durante el proceso?
Qué técnica de secuenciación usa un marcado con un fluoróforo en cada nucleótido para la detección durante el proceso?
En términos de fragmentación y etiquetado en las plataformas descritas, ¿qué enfoque se utiliza comúnmente en Illumina?
En términos de fragmentación y etiquetado en las plataformas descritas, ¿qué enfoque se utiliza comúnmente en Illumina?
¿Cuál de las siguientes plataformas pertenece a la segunda generación de secuencionamiento?
¿Cuál de las siguientes plataformas pertenece a la segunda generación de secuencionamiento?
¿Qué proceso es necesario para obtener clones antes de la secuenciación?
¿Qué proceso es necesario para obtener clones antes de la secuenciación?
¿Qué significa la secuenciación 'Paired-end'?
¿Qué significa la secuenciación 'Paired-end'?
¿Cuál es el objetivo de la fragmentación y etiquetado en el proceso de secuenciación?
¿Cuál es el objetivo de la fragmentación y etiquetado en el proceso de secuenciación?
En la tercera generación de secuenciación, un ejemplo de plataforma es:
En la tercera generación de secuenciación, un ejemplo de plataforma es:
¿Qué característica es distintiva del secuenciador Ion Torrent en comparación con otras plataformas?
¿Qué característica es distintiva del secuenciador Ion Torrent en comparación con otras plataformas?
¿Qué ocurre en el primer paso de la amplificación clonal?
¿Qué ocurre en el primer paso de la amplificación clonal?
¿Cuál es una limitación común del método de Sanger comparado con las técnicas de la segunda y tercera generación?
¿Cuál es una limitación común del método de Sanger comparado con las técnicas de la segunda y tercera generación?
¿Qué se busca evitar al agregar una extensión dA en 3' de los fragmentos?
¿Qué se busca evitar al agregar una extensión dA en 3' de los fragmentos?
¿Cuál de las siguientes afirmaciones describe mejor el método de Sanger?
¿Cuál de las siguientes afirmaciones describe mejor el método de Sanger?
¿Cuál de las siguientes tecnologías se corresponde con la secuenciación de molécula individual?
¿Cuál de las siguientes tecnologías se corresponde con la secuenciación de molécula individual?
En la secuenciación por el método de Sanger, ¿qué permite la utilización de polimerasas termo-resistentes?
En la secuenciación por el método de Sanger, ¿qué permite la utilización de polimerasas termo-resistentes?
¿Qué implicación tiene la aparición de heterocigotos en organismos diploides en la secuenciación de Sanger?
¿Qué implicación tiene la aparición de heterocigotos en organismos diploides en la secuenciación de Sanger?
¿Cuál es la principal ventaja del método de secuenciación automatizada sobre el método manual?
¿Cuál es la principal ventaja del método de secuenciación automatizada sobre el método manual?
¿Qué técnica es específicamente utilizada para obtener genomas de referencia?
¿Qué técnica es específicamente utilizada para obtener genomas de referencia?
En comparación con Sanger, ¿cuál es una característica de las plataformas de secuenciación de segunda generación?
En comparación con Sanger, ¿cuál es una característica de las plataformas de secuenciación de segunda generación?
¿Cuál es el propósito del etiquetado diferencial de los dideoxynucleótidos en el método de Sanger?
¿Cuál es el propósito del etiquetado diferencial de los dideoxynucleótidos en el método de Sanger?
¿Qué limitación tiene el método de Sanger al secuenciar fragmentos de ADN más largos?
¿Qué limitación tiene el método de Sanger al secuenciar fragmentos de ADN más largos?
Flashcards
Sequencing by Synthesis
Sequencing by Synthesis
A DNA sequencing method that incorporates labelled nucleotides to a growing DNA strand, and fluorescence is measured to determine the identity of each nucleotide.
Ion Torrent
Ion Torrent
A DNA sequencing technology that measures the pH change caused by the release of protons during nucleotide incorporation.
Sanger Sequencing
Sanger Sequencing
A DNA sequencing method that uses dideoxynucleotides to terminate DNA synthesis, allowing for the identification of the base at each position.
Next-Generation Sequencing
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2nd Generation Sequencing
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3rd Generation Sequencing
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Single Molecule Sequencing
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Clonal amplification
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Paired-end sequencing
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SMRTbell
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Zero-Mode Waveguide (ZMW)
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Fragmentation and Labelling
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Study Notes
### Secuenciación por Síntesis
-
La secuenciación por síntesis utiliza nucleótidos marcados con un fluoróforo y bloqueados en 3' OH (de forma reversible).
-
Cada ciclo, se incorpora un solo nucleótido a la cadena y se eliminan los no incorporados.
-
Se mide la fluorescencia específica emitida por el nucleótido incorporado.
-
Para el siguiente ciclo, se eliminan el agente bloqueante y el fluoróforo del último nucleótido incorporado.
Ion Torrent
-
En Ion Torrent, un oligonucleótido complementario a P5 o P7 cubre beads (perlas) que están distribuidas en celdas.
-
Cada celda contiene una o ninguna partícula que lleva muchas copias de la misma secuencia.
-
Los protones liberados durante la polimerización generan una corriente eléctrica que se detecta.
Estrategias de Secuenciación
-
La secuenciación de Sanger es limitada en su capacidad de lectura (~1.000 pb).
-
Las estrategias de secuenciación de segunda y tercera generación abordan la secuenciación de fragmentos más largos.
Secuenciación de Segunda Generación
-
Amplified Single Molecule Sequencing (secuenciación de molécula individual amplificada)
-
Ejemplo de tecnologías:
- 454 (Roche)
- Illumina (Solexa)
- SOLiD (Applied Biosystems)
- Ion Torrent (Life Technologies)
Secuenciación de Tercera Generación
-
Next Next Generation (secuenciación de última generación)
-
Secuenciación de molécula individual
-
Ejemplo de tecnologías:
- Helicos (Helicos Genetic Analysis System)
- Pacific Biosciences
- Oxford Nanopore Technologies
Secuenciación Clonal
- Necesita la creación de muchas copias idénticas (clones) del fragmento que se va a secuenciar.
“Single Molecule”
- Los datos de secuenciación proceden de una única molécula.
Amplificación Clonal
-
Se separa físicamente los fragmentos.
-
La amplificación se realiza en dos pasos:
- Adición a los fragmentos de extremos de secuencia conocida.
- Amplificación enzimática de los fragmentos.
Adición de Secuencias Terminales
-
Para "Paired-end sequencing" (secuenciación de extremos pareados) se añaden secuencias conocidas en los extremos (diferentes en cada extremo).
-
Se pueden añadir códigos de barras para indicar la procedencia de la muestra.
Fragmentación y Etiquetado
- Fragmentación, reparación y modificación de los extremos del ADN:
- Fragmentación del DNA a ~200–600 pb.
- Reparación enzimática de los extremos de los fragmentos.
- Adición de una extensión dA en 3' para evitar concatenación de fragmentos.
- Adición de un adaptador (en forma de Y) con una cola dT para evitar la formación de dímeros de adaptador.
Pacific Biosciences
-
SMRTbell: es una molécula de DNA circular de cadena sencilla creada al ligar adaptadores de horquilla a los dos lados de un fragmento de DNA de doble cadena.
-
ZMW (zero-mode waveguide): es una minicelda donde se ubica cada molécula de DNA para la secuenciación.
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Description
Este cuestionario explora los principios de la secuenciación por síntesis y la tecnología Ion Torrent. Se abordan los métodos de incorporación de nucleótidos, medición de fluorescencia y la generación de corriente eléctrica en la secuenciación. Ideal para estudiantes que deseen profundizar en las estrategias de secuenciación avanzadas.