Requerimientos de la Expresión Génica

Requerimientos de la Expresión Génica

• La expresión de secuencias génicas se utiliza para analizar señales reguladoras con genes reporteros
• Los fenotipos cambian las características físicas de la célula y les dan nuevas propiedades, como la proteína GFP o la enzima Beta-Gal

Aplicaciones de la Expresión de Secuencias

• Localización: se pueden marcar las proteínas para seguir su localización en la célula
• Producción (purificación): se puede producir RNA, proteínas o péptidos de interés industrial o científico
• Aislamiento: se generan proteínas de fusión que facilitan su purificación
• Análisis: se estudia el producto de expresión para comprender sus mecanismos

Expresión in vitro e in vivo

• Expresión in vitro: se utiliza extractos celulares crudos
• Expresión in vivo: se utiliza expresión transitoria (plásmido, multicopia) o expresión permanente (monocopia, inserción)

Transcripción in vitro

• Se sintetiza RNA mediante la incubación de un DNA clonado bajo un promotor y una RNA polimerasa capaz de reconocerlo
• Usos:
  • Generación de sondas para northern o ISH
  • Síntesis de RNA antisentido
  • Producción de pre-mRNA para estudio de maduración
  • Traducción in vitro o in vivo

Sistemas de Transcripción in vitro

• Sistema SP6: utiliza RNA polimerasa y promotor, y vectores como pSP64, pSP65 y pSP64PolyA
• Sistema SP6 y T7: utiliza dos promotores, y vectores como pGEM, pGEMZ, pGEM-Zf y pCRII-TOPO
• Sistema T3 y T7: utiliza dos promotores, y vectores como pBluescript y pTS1
• Sistema pTRIPLEscript: posee 3 promotores en tándem (SP6, T7 y T3) para la expresión

Traducción in vitro

• Se utiliza mRNA aislado de células o tejidos o sintetizado in vitro para la síntesis de proteínas in vitro
• Se utilizan extractos de células de diferentes tipos, como E. coli, germen de trigo, reticulocitos de conejo, levadura, Drosophila y células tumorales