Procesamiento Histológico: Fijación

• La observación microscópica de una muestra biológica requiere un procesamiento que conserve su morfología y estructura.
• El procesamiento histológico consta de cuatro pasos fundamentales:
  • Fijación
  • Inclusión
  • Microtomía (corte)
  • Tinción
• Cada uno de estos pasos presenta diferencias entre la microscopía óptica y la electrónica.

Fijación

• Detiene la degradación post-mortem de los tejidos.
• Preserva su estructura.
• Endurece la pieza para su posterior manipulación.

Métodos de fijación

• Físicos: Criofijación o congelación a temperaturas inferiores a -70°C.
  • Ventajas: rapidez y utilidad en diagnósticos urgentes (biopsias intraoperatorias).
  • Desventajas: reversibilidad y posible daño por formación de cristales de hielo (evitable con crioprotectores como sacarosa o glicerol).
• Químicos: Uso de agentes químicos para estabilizar macromoléculas.
  • Entrecruzantes: Formaldehído (microscopía óptica) y glutaraldehído (microscopía electrónica).
  • Oxidantes: Tetróxido de osmio (OsO4) (microscopía electrónica, fija lípidos y resalta membranas celulares).

Inclusión

• Consiste en eliminar el agua del tejido y reemplazarla con un medio sólido para facilitar el corte.
• Microscopía óptica: Se usa parafina (mezcla de ceras con punto de fusión de 50°C). Se requiere deshidratación previa.
• Microscopía electrónica: Se usan resinas (más duras que la parafina), polimerizan con calor o luz ultravioleta. Permiten cortes más finos y la realización de cortes semifinos (1 µm) para observación con microscopio óptico.

Microtomía

• Proceso de corte de los tejidos para su observación microscópica.
• Microscopía óptica: Se usa un microtomo para cortes de 3-5 µm de grosor.
• Microscopía electrónica: Se usa un ultramicrotomo para cortes ultrafinos (10-100 nm) sobre redes de cobre o níquel.
• Técnicas por congelación: Se usa un criostato a -20°C para cortes de 6-8 µm sin necesidad de deshidratación.
• Algunas muestras como frotis sanguíneos y fluidos biológicos pueden observarse sin inclusión ni corte.

Tinción

• Las estructuras biológicas tienen escaso contraste, por lo que se aplican tinciones para resaltar sus componentes.
• Microscopía óptica: Uso de colorantes.
  • Hematoxilina-eosina: Diagnóstico anatomopatológico.
  • Papanicolaou: Citología exfoliativa.
  • Impregnación argéntica: Sistema nervioso.
• Microscopía electrónica: Contraste con metales pesados como acetato de uranio y citrato de plomo.

Técnicas Inmunohistoquímicas

• Permiten detectar proteínas específicas en los tejidos mediante anticuerpos.
• Son fundamentales en el diagnóstico de enfermedades.
• Técnicas directas: Se emplea un anticuerpo primario conjugado con una molécula detectable (enzima, fluorocromo o partícula de oro).
• Técnicas indirectas: Utilizan un anticuerpo secundario que se une al primario y está conjugado a una molécula detectable. Método más utilizado por su mayor sensibilidad y flexibilidad.

Marcaje Indirecto con Anticuerpos Secundarios y Peroxidasa

• La técnica más utilizada en laboratorios de diagnóstico es el marcaje indirecto con anticuerpos secundarios unidos a la enzima peroxidasa.
• Esquema del Procedimiento:
  • Desparafinado e hidratación de los tejidos.
  • Incubación con anticuerpo primario.
  • Lavado para eliminar inmunoglobulinas no unidas específicamente.
  • Incubación con anticuerpo secundario unido a peroxidasa.
  • Lavado para eliminar el anticuerpo secundario no unido.
  • Revelado: demostración histoquímica de la peroxidasa.
  • Observación al microscopio.

Revelado con Peroxidasa

• Se añade H2O2 (sustrato) y diaminobencidina (DAB) (donador de electrones).
• La actividad de la peroxidasa oxida la DAB, generando un precipitado marrón.
• Si el antígeno está presente, se observa la coloración marrón en las células correspondientes.
• Se pueden usar colorantes de contraste como hematoxilina para mejorar la visualización.

Aplicación en Diagnóstico

• Ejemplo:
  • Cáncer de mama:
    • Tumores con receptor de estrógenos positivo tienen mejor pronóstico y responden a tamoxifeno.
    • Tumores Her-2/ErbB2 positivos tienen peor pronóstico, pero pueden tratarse con trastuzumab.

Otras Tecnologías de Marcaje

• Fluorescencia: anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes, observables con microscopio de fluorescencia.
• Microscopía Electrónica: anticuerpos marcados con partículas de oro o ferritina.
• Aplicaciones: investigación más que diagnóstico.

Tecnología del ADN Recombinante y Aislamiento de Ácidos Nucleicos

• La tecnología del ADN recombinante permite manipular y modificar el ADN para aplicaciones científicas y terapéuticas.
• Aislamiento de Ácidos Nucleicos:
  • Separa ADN o ARN de tejidos o células.
  • Método clásico:
    • Extracción en fases orgánicas.
    • Precipitación con soluciones alcohólicas.

Análisis de Calidad del ADN

• Electroforesis en gel de agarosa:
  • Separa los fragmentos según su tamaño.
  • El ADN migra por el gel debido a su carga negativa.
  • Se utiliza bromuro de etidio y luz ultravioleta para visualización.
  • Permite verificar si el ADN está intacto o degradado.
• Cuantificación del ADN:
  • Se mide la absorbancia a 260 nm (debido a las bases nitrogenadas).
• Enzimas de Restricción y Clonación del ADN
  • Endonucleasas de restricción:
    • Cortan el ADN en secuencias específicas llamadas secuencias palindrómicas.
    • Tipos de extremos generados:
      • Extremos cohesivos (escalonados).
      • Extremos romos.
    • Ligasa de ADN: une fragmentos de ADN.
• Clonación del ADN
  • Clonación celular: uso de bacterias para replicar fragmentos de ADN en plásmidos.
  • Clonación acelular (PCR): amplificación de ADN en tubo de ensayo.

Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante

• Terapia génica: modificación de genes para tratar enfermedades.
• Producción de insulina recombinante: fabricación en bacterias para tratar diabetes tipo I.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

• La PCR fue desarrollada en 1985 por Kary Mullis, quien recibió el Premio Nobel de Química en 1993.
• Permite la amplificación exponencial de un fragmento específico de ADN.
• Se requiere conocer la secuencia de los extremos del fragmento para diseñar cebadores (primers).
• Ha sido un gran avance en biomedicina, con aplicaciones en diagnóstico y terapia.

Etapas de la PCR

• Desnaturalización:
  • Separación de las hebras de ADN a 90-94 °C.
  • Se rompen los puentes de hidrógeno, generando ADN monocatenario.
• Hibridación:
  • Descenso de la temperatura a 40-60 °C.
  • Los cebadores se unen a las secuencias complementarias del ADN molde.
  • La temperatura de hibridación debe ser 5-8 °C menor a la temperatura de fusión (Tm).
• Extensión
  • Ocurre a 72 °C con la polimerasa Taq.
  • Se incorporan desoxirribonucleótidos (dATP, dGTP, dCTP y dTTP).

Componentes de la Reacción PCR

• ADN molde
• Cebadores (primers): P1 y P2
• Taq polimerasa (termoestable)
• dNTPs (nucleótidos)
• Solución tamponada y cofactor de magnesio
• Se lleva a cabo en un termociclador.
• Se obtiene una cantidad exponencial de copias: 2^n (n = número de ciclos).

Variantes de la PCR

• PCR anidada: Amplificación dentro de otra amplificación para mayor especificidad.
• PCR multiplex: Amplificación simultánea de varios fragmentos.
• PCR-RFLP: Identificación de polimorfismos con enzimas de restricción.
• RT-PCR: Conversión de ARN en ADNc antes de la amplificación.
• qPCR: Cuantificación del ADN amplificado en tiempo real.

Aplicaciones Biomédicas de la PCR

• Detección de mutaciones en enfermedades genéticas.
• Diagnóstico de patógenos bacterianos o virales (ej. VIH).
• Seguimiento de terapias retrovíricas.
• Identificación de polimorfismos genéticos.

Fingerprint de ADN

• Identificación de individuos mediante polimorfismos genéticos.
• Uso en medicina forense, pruebas de paternidad y estudios de enfermedades genéticas.
• Tipos de polimorfismos:
  • SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
  • VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)
  • STR (Short Tandem Repeats)

Secuenciación del ADN

• Permite determinar la secuencia exacta de nucleótidos.
• Método de Sanger:
  • Uso de didesoxinucleótidos (ddNTPs) para interrumpir la síntesis.
  • Separa fragmentos de ADN de diferente longitud.
• Aplicaciones:
  • Diagnóstico genético
  • Forense
  • Desarrollo de fármacos y terapias génicas

Hibridación in Situ de Ácidos Nucleicos

• La hibridación in situ (ISH) es una técnica utilizada para localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en cortes de tejidos.
• Es una herramienta clave en biología molecular y celular, aplicada en el estudio de la expresión génica y alteraciones genómicas en diversas patologías.

Fundamento ISH

• Se basa en la complementariedad de bases de los ácidos nucleicos, permitiendo que un polinucleótido marcado (sonda) se una a una secuencia complementaria (diana) en una sección histológica, en células aisladas o en cromosomas.

Tipos de Hibridación

• Dependiendo de las moléculas implicadas, existen tres tipos de uniones:
  • ADN-ADN
  • ADN-ARN
  • ARN-ARN
• Tipos de ISH:
  • ADN-ISH: Detecta cambios estructurales en el genoma.
  • ARN-ISH: Permite estudiar los niveles de expresión del ARN.

Marcaje de Sondas

• Las sondas pueden estar marcadas de dos maneras:
  • Radiactivo: Uso de isótopos radiactivos como 32P, 33P, 3H, 35S, 1251.
  • No radiactivo: Uso de biotina, digoxigenina o fluorocromos. Cuando se emplean fluorocromos, la técnica se denomina hibridación in situ fluorescente (FISH) y se visualiza con un microscopio de fluorescencia.
• Las sondas de ARN (ribosondas) son preferibles para la detección de ARN debido a su mayor estabilidad en la unión ARN-ARN.
• Se obtienen mediante transcripción in vitro a partir de una secuencia clonada en un vector con promotores de transcripción.
• El manejo del ARN es delicado debido a la presencia de ARNAsas.
• Para localizar ADN se emplean sondas de ADN, requiriendo un paso de desnaturalización para permitir la hibridación.
• También existen sondas LNA y PNA, formadas por análogos de ácidos nucleicos, que presentan mayor especificidad y estabilidad.

Aplicaciones en Diagnóstico Clínico ISH

• Detección de la expresión de ARNm en patologías
  • Identificación de tumores neuroendocrinos cuando la inmunohistoquímica es negativa.
  • Diagnóstico de tumores hepáticos y linfomas de células B.
• Virología
  • Identificación de infecciones víricas y su extensión.
  • Se usa para detectar infecciones por virus del papiloma humano (VPH), virus de la hepatitis B y C, y virus Epstein Barr.
  • La combinación de ISH con inmunohistoquímica permite detectar infecciones ocultas en pacientes inmunodeprimidos.

Terapia Génica

• La terapia génica es una técnica que busca tratar enfermedades mediante la introducción de genes terapéuticos en el organismo.
• Su objetivo es corregir defectos genéticos mediante la incorporación de genes "sanos" en lugar de los genes alterados o ausentes.

Estrategias de Terapia Génica

• Terapia de aumento génico (GAT): Introducción de un gen funcional en el tejido enfermo.
• Corrección de mutaciones: Modificación directa del gen defectuoso.
• Eliminación selectiva de células patológicas: Transferencia de genes "tóxicos" para destruir células enfermas.
• Activación del sistema inmunitario: Uso de ADN recombinante o citoquinas inmunoestimuladoras.
• Inhibición génica: Uso de ARN de interferencia o ácidos nucleicos "antisentido".

Tipos de Terapia Génica

• In vivo: Introducción del gen directamente en el paciente.
• Ex vivo: Modificación de células fuera del cuerpo y reimplantación en el paciente.
• Somática: Modifica células del organismo sin afectar a la descendencia.
• Germinal: Modifica la línea germinal y es hereditaria (no permitida por razones éticas).

Métodos de Introducción de Genes

• Vectores virales:
  • Adenovirus
  • Virus adenoasociados
  • Retrovirus (descartados por riesgos de tumores)
  • Virus del herpes simple y lentivirus
• Métodos no virales:
  • Microbalas: Partículas metálicas recubiertas con ADN lanzadas con una "pistola génica".
  • Reactivos químicos: Transportadores de ADN a través de la membrana celular.
  • Anticuerpos: Vehiculizan el ADN hacia la célula diana.

Factores que Influyen en la Terapia Génica

• Complejidad genética: Las enfermedades monogénicas son más tratables que las poligénicas.
• Tipo de defecto: La ausencia de un gen es más tratable que una mutación.
• Penetrancia y dominancia: Los defectos recesivos tienen mayor probabilidad de tratamiento exitoso.

Aplicaciones y Avances en Terapia génica

• Primer caso exitoso (1990): Introducción del gen ADA en niñas con inmunodeficiencia combinada severa.
• Ensayos clínicos actuales: Tratamientos para fibrosis quística, cáncer, Parkinson, SIDA y desórdenes inmunológicos.

Microarrays y Microchips en Genómica

• Técnica para estudio de expresión génica.
• Tipos de ADN en microarrays:
  • Oligonucleótidos (20-65 pares de bases) para mutaciones y expresión génica.
  • ADNc (500-5000 pares de bases) para expresión génica.
  • ADN genómico (50,000 pares de bases) para detección de pérdidas o ganancias génicas.
• Aplicaciones:
  • Identificación de genes relacionados con enfermedades.
  • Evaluación de la evolución de una enfermedad.
  • Farmacogenómica: Identificación de biomarcadores para personalizar tratamientos.

Desarrollo de Animales Transgénicos y Knock Out

• Transfección: Introducción de ADN exógeno de manera directa.
• Transducción: Introducción de ADN mediante vectores virales.

Métodos de transfección

• Electroporación: Uso de corriente eléctrica para abrir poros en la membrana celular.
• Liposomas: Vesículas artificiales que transportan ADN a través de la membrana celular.
• Animales transgénicos: Incorporación de genes exógenos en cigotos implantados en hembras para su desarrollo.
• Knock out: Inactivación de genes específicos para estudiar su función.

Consideraciones Finales sobre la terapia genica

• Ética: La terapia génica germinal está prohibida por su impacto hereditario.
• Riesgos: Desarrollo de tumores, falta de eficacia en la transferencia génica, toxicidad de vectores.
• Futuro: Investigaciones en curso para mejorar seguridad y eficiencia en terapia génica.

Técnicas Citogenéticas

• Las técnicas citogenéticas permiten el estudio de los cromosomas dentro de una célula.
• Se dividen en:
  • Análisis citogenético convencional: basado en el estudio de cromosomas metafásicos.
  • Técnicas de citogenética molecular: como la hibridación in situ fluorescente (FISH) y la hibridación genómica comparada (CGH).

Fundamento del Análisis Citogenético Convencional

• Cultivo in vitro del tejido con fitohemaglutinina a 37°C para inducir mitosis.
• Adición de colchicina para detener la división en metafase.
• Tratamiento con solución hipotónica, fijación y tinción.
• Análisis de los cromosomas.

Tinción de Bandas G

• Uso de tripsina y colorante Giemsa.
• Permite observar patrones de bandas característicos de cada cromosoma.
• Detecta alteraciones numéricas (trisomías, monosomías) y estructurales (translocaciones, deleciones, inversiones).
• Limitaciones:
  • Requiere tejido fresco.
  • No detecta alteraciones menores a 5 Mb.

Técnicas de Citogenética Molecular

• FISH:
  • Uso de sondas marcadas con fluorocromos para detectar secuencias específicas de ADN.
  • Permite estudiar cromosomas en metafase o interfase.
  • Aplicaciones en el diagnóstico de alteraciones génicas y translocaciones.
  • Limitación: no es una técnica de cribado, requiere conocer la región a estudiar.
• CGH:
  • Compara ADN problema con ADN de referencia marcados con fluorocromos.
  • Detecta ganancias o pérdidas de material genético con alta resolución.
    • Limitación: no detecta reordenaciones equilibradas.

Aplicaciones Biomédicas de la Citogenética

• Enfermedades Congénitas
  • Diagnóstico mediante cariotipo y FISH.
  • Uso de CGH en casos de microdeleciones y retraso mental.
• Enfermedades Adquiridas
  • Análisis citogenético en neoplasias hematológicas y tumores sólidos.
  • Importancia en:
    • Pronóstico de leucemias.
    • Respuesta a tratamientos (ej. t(15;17) en leucemia promielocítica).
    • Monitoreo de trasplantes de médula ósea.
  • Diagnóstico de tumores sólidos mediante FISH:
  • Sarcomas (ej. t(11;22) en sarcoma de Ewing).
  • Cáncer de mama (amplificación de ErbB2).
  • Cáncer de pulmón (sobreexpresión de EGFR).

Producción de Anticuerpos Policlonales y Monoclonales

• Anticuerpos Policlonales
  • Inyección de un antígeno en un animal.
  • Producción de anticuerpos contra múltiples epítopos.
  • Obtención de suero policlonal.
  • Purificación de anticuerpos específicos.
• Anticuerpos Monoclonales
  • Se busca obtener anticuerpos dirigidos contra un único epítopo.
  • Fusión de linfocitos B con células de mieloma para formar hibridomas.
  • Selección de hibridomas que producen el anticuerpo deseado.
  • Cultivo y producción a gran escala.

Ventajas de Anticuerpos Monoclonales

• Alta especificidad.
• Uso en diagnóstico y terapias dirigidas.

Aplicaciones de los anticuerpos

• Inmunohistoquímica.
• Diagnóstico de enfermedades infecciosas y cáncer.
• Desarrollo de tratamientos personalizados.

Técnicas de Análisis de Proteínas y Células ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

• Basado en la interacción antígeno-anticuerpo.
• Cuantifica una proteína en un fluido o extracto de tejido.
• Tipo más común: ELISA sándwich.

Procedimiento de ELISA

• Fijación de un anticuerpo monoclonal en una placa de 96 pocillos.
• Adición de suero del paciente.
• Unión de la proteína de interés al anticuerpo (si está presente).
• Adición de un segundo anticuerpo ligado a una enzima.
• Transformación del sustrato en un producto coloreado.
• Cuantificación de la intensidad del color para determinar la concentración de la proteína.
• Aplicaciones: Investigación y diagnóstico clínico.

Western Blot

• Detecta y cuantifica proteínas en muestras de tejido o células.
• Separa las proteínas según su tamaño mediante electroforesis en gel de acrilamida con SDS (SDS-PAGE).
• Procedimiento:
  • Aplicación de un campo eléctrico para la migración de proteínas.
  • Desnaturalización de proteínas con SDS y calor.
  • Transferencia a una membrana de nitrocelulosa (blotting).
  • Incubación con un anticuerpo primario específico.
  • Aplicación de un anticuerpo secundario con un cromógeno.
  • Revelado y obtención de imagen de bandas proteicas.
• Aplicaciones: Investigación biomédica, estudio de patologías.

Citometría de Flujo

• Analiza el número, tamaño y forma de células en suspensión.
• Utiliza láseres y detectores de luz para obtener información celular.
• Componentes principales:
  • Sistema Fluídico
  • Sistema óptico con láser
  • Detector electrónico que convierte la luz en señales digitales
• Parámetros analizados:
• FSC (Forward Scatter): Relacionado con el tamaño celular. -SSC (Side Scatter): Relacionado con la complejidad interna.

Ejemplos de aplicación de citometría de flujo

• Identificación de poblaciones celulares (linfocitos B, T y NK).
• Monitorización de linfocitos CD4+ en pacientes con VIH.
• Diagnóstico de leucemias y neoplasias hematológicas.