EXAMEN FINAL LABO

Preparación de la Electroforesis

• Antes de sumergir los geles en el tanque, asegurarse de que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.
• Preparar una mezcla de 5 μL ADN con 1μL de buffer carga repartida en alícuotas según el número de muestras que se colocarán en los pocillos.
• Agregar densidad a la muestra con glicerol o sacarosa y colorantes que permiten monitorear el progreso de la corrida electroforética (azul de bromofenol y xilenecianol).

Carga de la Muestra

• Cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos del gel de agarosa evitando la contaminación del pocillo contiguo con puntas de 20 μL.
• Cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables de los electrodos en la fuente de poder, seleccionar el voltaje adecuado (entre 75 a 120 voltios) e iniciar el proceso de electroforesis.

Electroforesis

• Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) tienen un grupo fosfato (carga negativa) y migran hacia el polo positivo o ánodo en una solución a pH neutro o básico.
• La separación de los fragmentos de ADN por electroforesis se regula mediante la concentración de agarosa (o poliacrilamida) del gel y el voltaje aplicado durante la corrida electroforética.
• Los fragmentos de menor tamaño migran más rápido hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño y el incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.

Matrices (Geles)

• Poliacrilamida: soporte muy usado para electroforesis de muestras de ácidos nucleicos, tóxico pero con mayor resolución, se utiliza para fragmentos de ADN de bajo peso molecular (menos de 1000 pares de base).
• Agarosa: transparente, elástico, con porosidad controlable, permite buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado, se utiliza para fragmentos de ADN de mayor peso molecular.

Fraccionamiento Celular

• La estructura celular más grande es el núcleo y la estructura más común es la mitocondria.
• El fraccionamiento celular tiene como objetivo obtener fracciones de un determinante componente celular como núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, etc.
• Existen 3 etapas: homogenizado, filtrado y centrifugado.

Homogenizado

• Ruptura de células y tejidos para obtener un lisado celular sin daños, utilizando un buffer tris a un pH 7.5.
• Se utiliza un homogenizador potter para el aislamiento de estructuras y moléculas lábiles en tejidos animales.

Filtrado

• Separación de componentes no deseados presentes en la suspensión celular mediante un medio poroso que retire sólidos y permita el pasaje del líquido.
• Se realiza una filtración gruesa a través de una gasa para eliminar restos del tejido o células intactas que no hayan sido fraccionadas.

Centrifugado

• Técnica que nos ayuda a separar fracciones, existen dos tipos: centrifugado por la gradiente de densidad y centrifugación diferencial.