EXAMEN FINAL LABO

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Questions and Answers

Cuál es el propósito de agregar glicerol o sacarosa a la muestra de ADN?

Eliminar impurezas del ADN

Aumentar la velocidad de migración del ADN

Mejorar la resolución de las bandas en el gel

Dar densidad a la muestra (correct)

Qué es lo primero que se debe hacer antes de sumergir los geles en el tanque?

Conectar los cables de los electrodos a la fuente de poder

Preparar la mezcla de ADN y buffer de carga

Encender la fuente de poder

Asegurarse de que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer (correct)

Cuál es el propósito de utilizar un marcador de peso molecular estándar de ADN?

Para determinar la pureza del ADN

Para separar las muestras de ADN según su tamaño

Para comparar el tamaño de las muestras de ADN (correct)

Para medir la cantidad de ADN en la muestra

Qué debe hacerse con los cables de los electrodos después de finalizar la corrida de la electroforesis?

Desconectarlos de la fuente de poder Signup and view all the answers

A qué longitud de onda debe estar configurado el transiluminador para revelar las bandas de ADN?

420 nm Signup and view all the answers

Qué es lo que se utiliza para monitorear el progreso de la corrida electroforética?

Azul de bromofenol y xilenocianol Signup and view all the answers

Cuál es el rango de voltaje recomendado para la electroforesis?

75-120 voltios Signup and view all the answers

Qué debe hacerse con el gel de agarosa después de finalizar la corrida de la electroforesis?

Desplazarlo hacia el transiluminador Signup and view all the answers

¿Cuál es la dirección en la que migran los fragmentos de ácidos nucleicos en una electroforesis?

Hacia el polo positivo Signup and view all the answers

¿Qué factor regula la velocidad de migración de los fragmentos de ácidos nucleicos en una electroforesis?

Ambos, la concentración de agarosa y el voltaje aplicado Signup and view all the answers

¿Por qué los fragmentos de menor tamaño migran más rápido hacia el polo positivo en una electroforesis?

Porque tienen menor masa Signup and view all the answers

¿Cuál es el soporte más usado para la electroforesis de muestras de ácidos nucleicos?

Poliacrilamida Signup and view all the answers

¿Qué herramienta fue creada por Arne Tiselius?

Electroforesis Signup and view all the answers

¿Qué porcentaje de agarosa se utiliza en la solución de agarosa para una corrida electroforética?

2% de agarosa Signup and view all the answers

¿Cuál es la ventaja de utilizar geles de agarosa en lugar de poliacrilamida?

Mayor porosidad controlable Signup and view all the answers

¿Qué tipo de fragmentos de ADN se visualizan mejor con geles de poliacrilamida?

Fragmentos de bajo peso molecular Signup and view all the answers

¿Cuál es el objetivo principal del fraccionamiento celular?

Obtener fracciones de un determinante componente celular Signup and view all the answers

¿Qué estructura celular se encuentra en mayor cantidad en la célula?

Mitocondrias Signup and view all the answers

¿Cuál es el primer paso del fraccionamiento celular?

Homogenizado Signup and view all the answers

¿Qué se utiliza para mantener un pH relativamente constante durante la homogeneización?

Un buffer tris Signup and view all the answers

¿Qué tipo de estructuras se pueden obtener en el fraccionamiento celular?

Núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y restos de membrana celular Signup and view all the answers

¿Qué se realiza después de la homogeneización?

Filtrado Signup and view all the answers

¿Qué tipo de centrifugado se utiliza para separar fracciones?

Centrifugado por gradiente de densidad y centrifugación diferencial Signup and view all the answers

¿Qué se utiliza para evitar daños a las células durante la homogeneización?

Un homogenizador potter Signup and view all the answers

Study Notes

Preparación de la Electroforesis

Antes de sumergir los geles en el tanque, asegurarse de que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.
Preparar una mezcla de 5 μL ADN con 1μL de buffer carga repartida en alícuotas según el número de muestras que se colocarán en los pocillos.
Agregar densidad a la muestra con glicerol o sacarosa y colorantes que permiten monitorear el progreso de la corrida electroforética (azul de bromofenol y xilenecianol).

Carga de la Muestra

Cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos del gel de agarosa evitando la contaminación del pocillo contiguo con puntas de 20 μL.
Cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables de los electrodos en la fuente de poder, seleccionar el voltaje adecuado (entre 75 a 120 voltios) e iniciar el proceso de electroforesis.

Electroforesis

Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) tienen un grupo fosfato (carga negativa) y migran hacia el polo positivo o ánodo en una solución a pH neutro o básico.
La separación de los fragmentos de ADN por electroforesis se regula mediante la concentración de agarosa (o poliacrilamida) del gel y el voltaje aplicado durante la corrida electroforética.
Los fragmentos de menor tamaño migran más rápido hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño y el incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.

Matrices (Geles)

Poliacrilamida: soporte muy usado para electroforesis de muestras de ácidos nucleicos, tóxico pero con mayor resolución, se utiliza para fragmentos de ADN de bajo peso molecular (menos de 1000 pares de base).
Agarosa: transparente, elástico, con porosidad controlable, permite buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado, se utiliza para fragmentos de ADN de mayor peso molecular.

Fraccionamiento Celular

La estructura celular más grande es el núcleo y la estructura más común es la mitocondria.
El fraccionamiento celular tiene como objetivo obtener fracciones de un determinante componente celular como núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, etc.
Existen 3 etapas: homogenizado, filtrado y centrifugado.

Homogenizado

Ruptura de células y tejidos para obtener un lisado celular sin daños, utilizando un buffer tris a un pH 7.5.
Se utiliza un homogenizador potter para el aislamiento de estructuras y moléculas lábiles en tejidos animales.

Filtrado

Separación de componentes no deseados presentes en la suspensión celular mediante un medio poroso que retire sólidos y permita el pasaje del líquido.
Se realiza una filtración gruesa a través de una gasa para eliminar restos del tejido o células intactas que no hayan sido fraccionadas.

Centrifugado

Técnica que nos ayuda a separar fracciones, existen dos tipos: centrifugado por la gradiente de densidad y centrifugación diferencial.

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Description

Aprende a preparar la electroforesis, incluyendo la preparación de los geles, la carga de la muestra y la adición de colorantes y densidad.