Molecular Biology Lab: PCR and Gel Electrophoresis

90 Questions

¿Cuál es el propósito de centrifugar rápidamente el Go Taq Green Master Mix antes de utilizarlo?

Para mezclar los componentes adecuadamente

¿Cuál es la concentración final del Forward primer en el Master Mix?

0.4µM

¿Para qué se utiliza el marcador de 1 kb en el protocolo de PCR?

Para separar los fragmentos de DNA por tamaño

¿Cuál es el propósito de transferir 24 μL del Master Mix a cada microtubo de PCR?

Para evitar contaminación con DNA ambiental

¿Qué es el buffer utilizado en el protocolo de PCR?

Buffer pH 8.5

¿Qué equipo se utiliza para visualizar los resultados de la electroforesis en gel de agarosa?

CHEMI DOC Touch Imaging System

¿Cuál es el propósito del 'loading dye' en el Go Taq Green Master Mix?

Visualizar la migración de las muestras en el gel de agarosa

¿Cuál es el tamaño del producto específico amplificado de 16S rDNA?

1.5 kb

¿Qué pasa si el 'primer' forward y 'everse' tienen secuencias de bases complementarias entre sí?

Se forma un dímero de primer

¿Cuál es el propósito del marcador 1 kb en la electroforesis en gel de agarosa?

Proporcionar un patrón de tamaño molecular

¿Cuántas copias se formaron del DNA original después de 30 ciclos de PCR?

2^30 copias

¿Cuál es el nombre del buffer que contiene el 'loading dye' necesario para visualizar la migración de las muestras?

Go Taq Green Master Mix

¿Cuál es el propósito de agregar 1 µL de agua ultrapura al control negativo?

Proporcionar un patrón de comparación para las muestras experimentales

¿Cuál es la temperatura de la etapa de desnaturalización en el ciclo de PCR?

95 ºC

¿Cuánto tiempo dura la etapa de extensión final en el ciclo de PCR?

7 min

¿Qué es la función del bromuro de etidio en la preparación del gel de agarosa?

Intensificar la fluorescencia de las bandas de DNA

¿Cuál es el propósito de la centrifugación antes de colocar los tubos en el termociclador?

Eliminar las burbujas de aire en los tubos

¿Cuál es el propósito de la electroforesis en gel de agarosa en este protocolo de PCR?

Separar las moléculas de DNA según su tamaño

¿Cuál es el tipo de cáncer del que se obtuvo la línea celular PANC-1?

Cáncer de páncreas

¿Cuál es el número de cromosomas presentes en la línea celular PANC-1?

¿Cuál es el medio de cultivo utilizado para cultivar las células PANC-1?

DMEM

¿Qué es un posible lugar de metástasis del cáncer pancreático?

Todos los anteriores

¿Cuál es el tiempo de ciclo celular de las células PANC-1?

52 horas

¿Qué es una característica de las células PANC-1?

Adherentes

¿Cuál es la temperatura requerida para incubar células PAN?

37°C

¿Cuál es el propósito del DTT en el protocolo de extracción de citoplasma?

Reducir el estrés oxidativo

¿Cuál es el propósito del inhibidor de proteasas en el protocolo de extracción de citoplasma?

Inhibir la actividad proteasa

¿Qué es necesario para realizar todos los pasos del protocolo de extracción de citoplasma?

Un ambiente frío

¿Cuál es el propósito del buffer de extracción de citoplasma (BEC) en el protocolo?

Extracción de proteínas

¿Qué es necesario mantener en hielo durante el protocolo de extracción de citoplasma?

Todos los reactivos incluyendo el buffer de extracción de citoplasma, DTT e inhibidores de proteasas

¿Cuál es el propósito del paso 4 en el lavado del cultivo celular?

Quitar el sobrenadante y agregar cloro al 10%

¿Cuál es el nombre del buffer utilizado para lavar las células PANC-1?

DPBS 1X

¿Cuál es el nombre del tipo de células utilizadas en este protocolo?

Células PANC-1

¿Cuál es la temperatura utilizada en el centrifugado de las células PANC-1?

4°C

¿Cuál es el propósito de agregar DTT 0.1M a la solución?

Inhibir la actividad de proteasas

¿Cuántos mL de células PANC-1 se transfieren a un tubo de centrífuga de 15 mL?

4.5 mL

¿Cuál es el principal beneficio del método de ácido bicinconínico (BCA) para la detección de proteínas?

Su alta sensibilidad para detectar concentraciones bajas de proteínas

¿Qué es el producto de la primera reacción en el método de ácido bicinconínico (BCA)?

Un complejo proteína-Cu1+

¿Cuál es el objetivo principal del ejercicio de cuantificación de proteínas por el método de ácido bicinconínico?

Determinar la concentración de proteínas en una muestra desconocida

¿Qué se mide en el método de ácido bicinconínico (BCA) para determinar la concentración de proteínas?

La absorbancia a 562 nm

¿Por qué se utiliza el método de ácido bicinconínico (BCA) para determinar la concentración de proteínas en la muestra de células PANC-1?

Porque es un método altamente sensible y específico

¿Qué es la aplicación principal del método de ácido bicinconínico (BCA) en la biología celular?

La cuantificación de proteínas en muestras de células

¿Cuál es el propósito de la dilución 1:10 de la muestra de extracto del citoplasma?

Preparar la muestra para la detección de proteínas

¿Cuál es el principio del ensayo de BCA?

Reacciona con los grupos amino de las proteínas

¿Cuál es la unidad de concentración de la solución de BSA estándar?

µg/mL

¿Cuál es el propósito del paso 3 en la preparación del microplato de 96 pozos?

Añadir el BCA Working Buffer

¿Cuál es la longitudes de onda en la que se lee la absorbancia en el Microplate Reader iMARK?

570 nm

¿Cuál es el volumen total para preparar la dilución 1:10 de la muestra de extracto del citoplasma?

40 µL

¿Cuál es el principio de la prueba de BCA para medir la concentración de proteínas?

La formación de un complejo de proteínas-cuprición

¿Cuál es el propósito de la curva de calibración en la prueba de BCA?

Establecer una relación entre la absorbancia y la concentración de proteínas

¿Qué se utiliza para medir la absorbancia en la prueba de BCA?

Un microlector de placas

¿Cuál es el propósito de la reacción del ácido bicinconínico en la prueba de BCA?

Reducir el sulfato de cobre

¿Qué se puede determinar mediante la medición de la absorbancia en la prueba de BCA?

La concentración de proteínas totales

¿Cuál es el rango de concentración de proteínas que se puede medir mediante la prueba de BCA?

0-250 μg/mL

¿Cuál es el propósito de trazar una línea a una distancia de 0.5 cm en el cristal largo externo?

Para marcar la posición de la peinilla

¿Qué es lo que se coloca dentro del soporte de desarrollo en el paso 5?

El soporte del electrodo

¿Cuál es el propósito del Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) en la electroforesis de proteínas?

Ayudar a la separación de proteínas por peso molecular

¿Qué es el resultado de la desnaturalización de proteínas en la electroforesis de SDS-PAGE?

La alteración de la estructura terciaria de las proteínas

¿Cuál es el propósito de añadir 140 mL de 1X Tris-Cl-glycine-SDS Buffer pH 8.3 al depósito interior de la cámara?

Para crear un buffer amortiguador en la cámara

¿Cuál es el volumen de la muestra de proteínas totales que se utilizará en este laboratorio?

7 µg

¿Cuál es el pH del buffer de corrida en la electroforesis de SDS-PAGE?

8.3

¿Qué es lo que se retira cuidadosamente en el paso 9?

La peinilla

¿Qué es el propósito del separación gel en la electroforesis de SDS-PAGE?

Separar las proteínas por peso molecular

¿Cuál es el propósito de preparar las muestras mientras se polimeriza el stacking gel?

Para preparar la muestra para la carga en la cámara de electroforesis

¿Qué es el resultado de la exposición de las proteínas a calor y agentes químicos en la electroforesis de SDS-PAGE?

La desnaturalización de las proteínas

¿Cuál es la función del bromofenol azul en el Laemmli Buffer?

Visualizar la migración de las proteínas

¿Cuál es el nombre del método de electroforesis utilizado para separar proteínas por peso molecular?

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

¿Cuál es el propósito principal de la electroforesis de proteínas por SDS-PAGE?

Separar proteínas por su peso molecular

¿Cuál es el mecanismo de formación del gel en la electroforesis de proteínas?

Polimerización de la acrilamida

¿Cuál es el propósito de la desnaturalización de proteínas con SDS en la electroforesis?

Desnaturalizar proteínas para medir su peso molecular

¿Cuál es el resultado esperado después de la electroforesis de proteínas por SDS-PAGE?

Un patrón de bandas en el gel de poliacrilamida

¿Cuál es la aplicación principal de la electroforesis de proteínas por SDS-PAGE?

Identificar proteínas específicas en una muestra

¿Cuál es el peso molecular del marcador proteico GAPDH?

37 kDa

¿Qué es lo que se coloca entre el gel y la membrana de nitrocelulosa en el paso 3?

Un papel de blotting humedecido

¿Cuál es el voltaje máximo utilizado en la transferencia de proteínas?

25 voltios

¿Qué es lo que se retira cuidadosamente en el paso 9?

El cassette

¿Cuánto tiempo dura la transferencia de proteínas?

7 minutos

¿Qué es lo que se coloca en el centro del cassette en el paso 2?

El papel de blotting

¿Cuál es el propósito del bloqueo en la inmunodetección de proteínas?

Evitar la unión del anticuerpo a la superficie de la membrana

¿Cuál es el color de las bandas cuando se utiliza Ponceau S para tinción de proteínas?

Rojo o rosa

¿Cuál es el propósito de la tinción con Ponceau S en la transferencia de proteínas?

Comprobar la transferencia de las proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana

¿Cuál es la característica de la tinción con Amido Black?

La tinción es permanente y la membrana no puede ser reutilizada

¿Cuál es el propósito de la inmunodetección de proteínas?

Detecer proteínas específicas en la membrana

¿Cuál es la ventaja de utilizar Ponceau S para la tinción de proteínas?

La tinción es rápida y compatible con la inmunodetección

¿Cuál es el propósito de la transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a una membrana?

Inmovilizar las proteínas en la membrana

¿Qué es lo que se requiere para una transferencia exitosa de proteínas?

Un procedimiento de optimización

¿Cuál es el propósito de utilizar membranas de nitrocelulosa?

Bloquear la membrana para evitar reacciones no específicas

¿Cuál es el nombre del método de transferencia de proteínas que requiere menor cantidad de buffer y toma menos tiempo?

Transferencia semi-seca (semi-dry blot)

¿Qué es lo que se puede transferir del gel de poliacrilamida a la membrana?

Todas las proteínas presentes en el gel

¿Cuál es el orden correcto de los componentes en el montaje para la transferencia de proteínas?

Electrodo con carga negativa; blotting paper; gel de poliacrilamida; membrana de nitrocelulosa; blotting paper; electrodo con carga positiva

Study Notes

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)*
Preparación de la PCR:
- Añadir 1 µL de agua ultrapura al control negativo.
- Añadir 1 µL de gDNA (template) al microtubo experimental.
Mezclar los componentes del master mix en orden: agua, Go Taq Green Master Mix, FW primer, RV primer.
Realizar una centrifugación rápida y transferir 24 µL del master mix a cada microtubo de PCR.
Programar el termociclador y comenzar la corrida.
Electroforesis*
Preparación del gel de agarosa:
- Pesar 0.5 g de agarosa y mezclar con 50 mL de 1X TBE.
- Añadir 0.75 µL de bromuro de etidio.
Cargar las muestras en el gel de agarosa:
- Realizar una centrifugación rápida y cargar las muestras directamente en el gel.
- Utilizar marcador de 1 kb (kilobase).
PCR y Electroforesis*
Verificar que todos los tubos estén cerrados completamente para evitar la evaporación de las muestras.
Realizar una centrifugación a todos los tubos antes de colocarlos en el termociclador.
Verificar que el instrumento esté configurado correctamente.
Purificación de Proteínas*
Preparación de la muestra de proteínas totales del citoplasma de las células PANC-1:
- Utilizar buffer de extracción de citoplasma (BEC) y inhibidores de proteasas.
- Añadir DTT para evitar la oxidación de las proteínas.
Preparación de la solución BEC 1X/DTT 0.1M/inhibidores de proteasas:
- Mezclar los componentes en orden: BEC 1X, DTT 0.1M, inhibidores de proteasas.
Lavado del cultivo celular:
- Centrifugar las células PANC-1 a 1,200 rpm, 4°C durante 7 minutos.
- Remover el medio de cultivo y lavar con DPBS.
Cuantificación de Proteínas*
Preparación de la curva de calibración:
- Utilizar BSA como estándar.
- Preparar diluciones de BSA y medir la absorbancia a 570 nm.
Preparación de la muestra experimental:
- Diluir la muestra 1:10.
- Añadir BCA Working Reagent y mezclar bien.
Electroforesis de Proteínas (SDS-PAGE)*
Principios básicos de la electroforesis de proteínas:
- Utilizar gel de poliacrilamida como soporte y SDS para desnaturalizar la proteína.
Preparación de la muestra:
- Calcular los microlitros necesarios para preparar la muestra de proteínas totales.
- Desnaturalizar la proteína con SDS y β-mercaptoetanol.
Electroforesis y transferencia:
- Utilizar sistema de electroforesis discontínuo.
- Transferir la proteína a una membrana de nitrocelulosa.
Inmunodetección*
Principios básicos de la inmunodetección:
- Utilizar anticuerpos primario y secundario.
- Realizar un paso de bloqueo para prevenir interacciones no específicas.
Tinción con Ponceau S o Amido Black:
- Verificar la transferencia de las proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana.
- La tinción es rápida y no es permanente.### Transferencia de Proteínas
Las proteínas migran del polo negativo (cátodo) hacia el polo positivo (ánodo) y se inmovilizan en la membrana.
Existen dos métodos para transferir proteínas a la membrana: transferencia semi-seca (semi-dry blot) y mojada (wet tank blot).
La transferencia semi-seca requiere menor cantidad de buffer y toma menos tiempo, mientras que la transferencia mojada requiere más buffer y toma más tiempo.

Preparación del Montaje

El montaje para la transferencia se compone de los siguientes componentes: electrodo con carga negativa (cátodo), blotting paper, gel de poliacrilamida, membrana de nitrocelulosa, blotting paper y electrodo con carga positiva (ánodo).

Tipos de Membranas

Las proteínas pueden ser transferidas del gel a membranas de nitrocelulosa, nilón o difluoruro de poli vinilideno (PVDF).
Las membranas de nitrocelulosa y PVDF son las más comúnmente utilizadas.
Las membranas de nitrocelulosa son económicas, bloquean con mayor facilidad y no requieren un pretratamiento con metanol.

Eficiencia de la Transferencia

La eficiencia de la transferencia del gel de poliacrilamida a la membrana depende de varios factores.
Se requiere un proceso de optimización para una transferencia exitosa.

This quiz is about the procedures and techniques used in molecular biology laboratories, specifically in PCR and gel electrophoresis experiments. It covers the preparation of samples, the use of loading dyes, and the interpretation of results. Test your knowledge of molecular biology laboratory techniques!

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