Techniques de PCR et leurs applications

Rappels théoriques de base

• Les enzymes sont des "couteaux suisses" pour la manipulation d'ADN, permettant des coupes et collages précis à l'humain.
• L'ADN ne peut pas sortir du noyau d'une cellule eucaryote.
• L'ADN est composé de bases azotées (Adénine, Guanine, Cytosine et Thymine) liées par des ponts hydrogène.
• La structure de l'ADN est une double hélice antiparallèle.
• L'Adénine s'apparie toujours avec la Thymine, et la Guanine s'apparie toujours avec la Cytosine.
• L'ARN est un simple brin et la Thymine est remplacée par l'Uracile.

Les nucléases

• Les nucléases sont des enzymes qui dégradent les liens phosphodiester dans l'ADN.
• Les endonucléases coupent l'ADN au milieu de la chaîne.
• Les exonucléases coupent l'ADN aux extrémités des fragments.
• Les coupures peuvent être franches (bouts francs) ou décalées (bouts collants).

Exemples de nucléases

• La DNase I est une endonucléase qui hydrolyse l'ADN double ou simple brin en nucléotides et oligonucléotides.
• Les endonucléases de restriction coupent l'ADN à des sites spécifiques. Elles sont utilisées en génie génétique.
• EcoRI et PST I sont des exemples d'enzymes de restriction.

Nucléase S1

• L'enzyme nucléase S1 hydrolyse l'ADN ou ARN simple brin.
• Elle est utilisée pour ouvrir les épingles à cheveux d'ADN ou ARN.
• Elle fonctionne en milieu acide et en présence d'ions zinc.

Les enzymes de restriction

• Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui coupent l'ADN à des sites spécifiques appelés sites de restriction.
• Les séquences de restriction sont généralement de 4, 6 ou 8 paires de bases.
• Les séquences de restriction sont souvent palindromiques.
• L'enzyme EcoRI est un exemple d'enzyme de restriction.

Tampons d'incubation

• Les tampons d'incubation optimisent les réactions d'enzymes de restriction.
• Ils contiennent des ions Mg2+, et d'autres composants dont le pH, la concentration de NaCl, de CH3COOK .
• Différents tampons existent, chacun avec ses conditions spécifiques.

Site de restriction

• Le site de restriction est une séquence de 6 paires de bases (exemple: 5’ GAATTC 3’ et 3’ CTTAAG 5’ pour EcoRI).
• Ces sites sont généralement palindromiques.

Mécanismes d'action des nucléases

• Les nucléases coupent l'ADN avec des extrémités franches ou collantes.
• La DNase I est une endonucléase qui est utilisée lors des digestions d'ADN.

Isoschizomères et néoschizomères

• Isoschizomères : sont des enzymes de restriction différentes mais qui coupent au même site.
• Néoschizomères : sont des enzymes de restriction différentes mais qui coupent au même site mais à des positions différentes.

Les ligases

• Les ADN ligases connectent les extrémités franches ou collantes de deux fragments d'ADN.
• Elles sont cruciales pour l'assemblage d'ADN.
• L'ADN ligase de E.coli utilise le cofacteur NAD+, mais la même enzyme peut parfois utiliser l'ATP.

Les ADN polymérases

• Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent une nouvelle chaîne d'ADN en utilisant une chaîne existante comme modèle.
• Elles nécessitent un polymère d'amorces (brin d'ADN ou d'ARN) complémentaire à la séquence qui est copiée.
• Elles sont responsables de la réplication et de la réparation de l'ADN.
• Différents types d'ADN polymérases existent, comme celle d'E. coli et la Taq polymérase.
• Des facteurs sont importants pour une bonne réaction de PCR: concentration du Mg2+.

Reverse transcriptase

• Les transcriptases inverses (ou transcriptase inverse), synthétisent un brin d'ADN complémentaire, en utilisant un ARN comme modèle.
• elles sont utilisées pour étudier l'ARN et à créer de l'ADNc utile pour créer des banques d'ADNC
• Elles sont utilisées dans l'étude fondamentale et l'étude des virus ou pour des applications en génie génétique.

Autres enzymes

• Les protéinases K dégradent les protéines.
• Les phosphatases alcalines hydrolysent le groupement phosphate des acides nucléiques.

Préparation des échantillons

• Des échantillons sont privilégiés pour les analyses d'ADN, comme les follicules pileux, le sang, le sperme etc...
• Les différents échantillons sont idéalement traités avec un tampon qui empêche les nucléases de digérer le matériel genetique.

Extraction d'ADN

• La méthode s'articule autour de la lyse cellulaire, l'inactivation des nucléases et la séparation de l'ADN des débris cellulaires.
• La lyse cellulaire use des techniques mécaniques comme le broyage, ou chimiques, comme l'emploi de détergents, pour libérer le contenu cellulaire, dont l'ADN, du milieu cellulaire.

Purification de l'ADN

• L'ADN est précipité par l'ajout de solutions organiques
• Un processus de centrifugation est suivi pour séparer l'ADN des autres composants.

Quantification de l'ADN

• La concentration d'ADN est évaluée en mesurant l'absorbance dans l'UV (à 260 nm) à l'aide de la loi de Beer-Lambert.

Visualisation sur gel d'agarose

• Les fragments d'ADN migrent sur un gel d'agarose sous l'effet d'un champs électrique.
• Les petits fragments se déplacent plus rapidement que les gros fragments.
• Les fragments sont visualisés avec des colorants fluorescents (ex: bromure d'éthidium) qui lie l'ADN et devient fluorescent en U.V..

PCR (Polymerase Chain Reaction)

• La PCR est une technique de biologie moléculaire utilisée pour amplifier une séquence d'ADN spécifique en plusieurs millions de copies.
• La réaction se déroule sur des segments d'ADN, appelés amorces ou primers, complémentaires aux extrémités de la séquence à amplifier.
• les étapes principales de la PCR sont la dénaturation, l'hybridation et la synthèse.

Conditions expérimentales de la PCR

• Les amorces sont cruciales pour la spécificité et pour la sensibilité de la réaction de PCR.
• Plusieurs paramètres peuvent influencer la température d'hybridation des amorces, dont le pourcentage de GC et la longueur du fragment.
• La concentration d'ADN, la présence des ions Mg2+ et des dNTPs influencent la réaction de PCR.

Révélation de la PCR

• La révélation du produit PCR se fait par électrophorèse sur gel d'agarose suivi de la coloration des fragments avec un colorant fluorescent (le bromure d'éthidium).

Séquençage

• Le séquençage de l'ADN détermine la séquence de nucléotides d'un fragment d'ADN.
• La méthode Sanger est une méthode classique et précise.
• La méthode de séquençage est automatisée.
• Les séquençages de troisième génération font aussi partie de la technologie du séquençage de l'ADN

Hybridation moléculaire

• L'hybridation moléculaire est l'association entre deux simples brins d'ADN ou d'ARN complémentaires.
• Elle est utilisée pour identifier des fragments d'ADN ou d'ARN spécifiques.
• Plusieurs facteurs influent sur la stringence (conditions d'hybridation).
• La technique du Southern blot est une application de l'hybridation moléculaire permettant de détecter des fragments d'ADN spécifiques sur une membrane.

Northern blot

• Le Northern blot est une technique pour détecter des fragments d'ARN spécifiques dans un échantillon.
• La procédure est similaire au Southern blot mais ici l'acide nucléique étudié est l'ARN.

Western blot

• Le Western blot est une technique pour détecter à quel endroit une protéine spécifique se trouve dans un échantillon.
• La procédure consiste à séparer les protéines par électrophorèse, à les transférer sur une membrane et à les détecter avec des anticorps spécifiques.
• Différentes méthodes de visualisation existent (colorimétrie, chimiluminescence, fluorescent et radioactivité).

Hybridation in situ (FISH)

• La technique FISH (Fluorescent in Situ Hybridization) identifie les chromosomes (ou molécules) dans une cellule.
• Elle permet une visualisation directe dans une cellule vivante ou fixée.