Outils de la biologie moléculaire et enzymes de restriction

Outils de la biologie moléculaire

• Le génie génétique comprend les outils et techniques de la biologie moléculaire, permettant l'étude contrôlée des modifications génétiques comme l'isolement, le clonage, le séquençage et le découpage des gènes à des fins de recherche fondamentale ou appliquée.
• Ces outils permettent la modification temporaire ou permanente du patrimoine génétique d'un organisme vivant.
• La visualisation et l'amplification sont importantes dans les techniques de biologie moléculaire.
• La spécificité est obtenue grâce à l'appariement de séquences complémentaires.
• Les enzymes sont des outils essentiels.

Enzymes de Restriction

• Les enzymes de restriction, ou nucléases de restriction, sont produites par les bactéries pour se défendre contre les infections par bactériophages.
• Elles protègent contre l'infection virale en dégradant l'ADN des virus envahisseurs.
• Plus de 3 500 enzymes de restriction ont été identifiées, dont plus de 250 sont disponibles commercialement.
• Une enzyme de restriction reconnaît une séquence nucléotidique spécifique sur l'ADN, appelée séquence de reconnaissance ou site de restriction, souvent palindromique et coupe l'ADN à ce niveau.
• La ligase permet de recoller des fragments d'ADN coupés par les enzymes en utilisant les groupements 3'OH et P.

Cartes de Restriction et Électrophorèse

• L'établissement de cartes de restriction permet de localiser les sites de clivage des enzymes de restriction sur l'ADN.
• La construction de ces cartes nécessite la mesure de la longueur des fragments d'ADN.
• L'électrophorèse est utilisée pour séparer les molécules chargées en les faisant migrer dans un gel sous l'effet d'un champ électrique.
• La distance de migration des fragments d'acides nucléiques est inversement proportionnelle au logarithme de leur taille.
• La détermination d'une carte de restriction consiste à identifier les sites de coupure sur l'ADN avec plusieurs enzymes et à localiser ces sites.
• Le gel d'agarose sépare les fragments d'ADN selon leur taille, les grands fragments migrant plus lentement.
• La migration de fragments de tailles connues permet d'étalonner le gel et de déterminer la taille de fragments inconnus.
• Une molécule qui s'intercale dans l'ADN permet de visualiser les fragments.
• Une expérience de cartographie consiste à étudier un ADN linéaire de 5000 paires de bases en le digérant avec des enzymes et en analysant les fragments résultants par électrophorèse pour déterminer les sites de restriction.

Hybridation de Southern

• L'hybridation de Southern, ou Southern blot, est une technique pour détecter une séquence d'ADN particulière dans une collection de fragments de restriction séparés par électrophorèse.
• Cette méthode est basée sur l'appariement d'un brin d'ADN marqué connu (sonde) avec sa séquence complémentaire sur un fragment de restriction.
• La technique du buvardage de Southern consiste à transférer les fragments d'ADN du gel sur une membrane par capillarité, puis à fixer les sondes et enfin à révéler ces sondes.
• Le Southern blot est utilisé pour détecter des mutations ponctuelles, des délétions ou des inversions affectant la présence ou la longueur d'un fragment de restriction et à des fins de diagnostic génétique ou médico-légal.
• Le Northern blot est une technique similaire qui étudie l'ARN au lieu de l'ADN, en séparant les ARN par électrophorèse et en les détectant avec une sonde.

Application : RFLP, CRISPR

• L'analyse RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) est une méthode classique de test génétique basée sur la longueur des fragments de restriction.
• La drépanocytose peut être diagnostiquée par RFLP car la mutation (GAG -> GTG) dans l'allèle mutant β-globine (βs) détruit un site de restriction pour MstII, menant à un fragment unique détectable par Southern blot.
• La PCR et le séquençage ont largement remplacé l'analyse RFLP, qui reste cependant utilisée occasionnellement en clinique.
• Le système CRISPR-Cas9 est un outil d'édition génomique permettant d'introduire des modifications locales dans le génome.
• Le système CRISPR-Cas9 utilise une molécule d'ARN guide pour cibler une séquence spécifique de l'ADN et l'enzyme Cas9 pour couper l'ADN à cet endroit.
• Ce système a des applications multiples comme l'inactivation de gènes, le remplacement de séquences ou la modification de l'expression génique.

Clonage Moléculaire et PCR

• Le clonage moléculaire consiste à insérer un fragment d'ADN d'intérêt, amplifié par PCR, dans un plasmide.
• Le plasmide et le DNA sont digérés par des enzymes de restriction puis fusionnés grâce à une ligase.
• Ce plasmide est ensuite introduit dans une cellule hôte, souvent une bactérie, qui se multiplie et transmet le plasmide contenant le fragment d'ADN d'intérêt à ses descendants.
• Cette technique permet de fabriquer des protéines, des enzymes ou des médicaments biologiques comme des vaccins ou l'insuline en utilisant les bactéries comme "usines".
• La PCR permet de dupliquer en grand nombre une séquence d'ADN ou d'ARN connue grâce à une faible quantité d'acide nucléique et à des amorces spécifiques.
• Elle est utilisée pour détecter la présence du SARS-Cov2 ou d'OGM.
• Une réaction de PCR contient l'ADN à amplifier (matrice), une ADN polymérase thermorésistante (Taq ou Pwo), des amorces et des dNTPs.
• Les étapes d'un cycle de PCR comprennent la dénaturation de l'ADN matrice à 94°C, l'appariement des amorces à l'ADN cible à 50-60°C, et l'élongation de l'ADN à partir des amorces à 72°C.
• En PCR en temps réel (q-PCR), la fluorescence est mesurée pour quantifier l'accumulation des produits de la réaction après chaque cycle.

Séquençage de l'ADN

• Le séquençage de Sanger, développé dans les années 1970, consiste à répliquer l'ADN in vitro en présence d'analogues de nucléotides (ddNTP) qui bloquent l'élongation de la chaîne.
• Quatre réactions sont nécessaires pour chaque nucléotide, et les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse ou chromatographie.
• Les résultats sont analysés par des traceurs fluorescents et ce processus permet de lire la séquence d'ADN.
• Le séquençage de nouvelle génération (NGS), apparu en 2005, utilise le multiplexage de masse permettant de séquencer un génome entier en un jour.
• Le séquençage de troisième génération détecte les bases sans amplification préalable, en utilisant des nanopores ou la détection de fluorescence lors de l'incorporation des bases par l'ADN polymérase.
• Le choix entre ces techniques dépend des besoins de l'étude en termes de longueur de lecture, de débit et de coût.

Applications du Génie Génétique et Introduction à la Génomique

• Les techniques du DNA recombinant sont utiles pour recherche biologique, médecine, environnement et biotechnologie.
• Applications : production de protéines thérapeutiques, thérapie génique, vaccins à ARN/ADN, transgenèse animale, et agronomie.
• La génomique étudie la structure et l'organisation des génomes et de leur évolution.
• Les séquences génomiques combinées à l'étude du polymorphisme permettent l'établissement de cartes génétiques.
• Une carte génétique fournit l'emplacement des gènes par le taux de recombinaison.
• Une carte physique révèle d'un gène par rapport aux autres sur le chromosome.
• Le génotypage est l'ensemble des analyses génétiques moléculaires visant à déterminer l'identité d'une variation génétique spécifique dans le génome.
• La pénétrance d'un gène est un facteur important dans l'analyse génétique.
• L'étude des variants permet le décryptage des maladies complexes et le diagnostic plus précis.