Microscopie Basis en Toepassingen

Microscopie, Kleuring en Classificatie

• Microscopie maakt gebruik van lenzen om minuscule objecten te vergroten.
• De eenheid van meting voor micro-organismen is meestal micrometer (µm) en nanometer (nm). 1µm gelijk is aan 10^-6 meter.
• Verschillende typen microscopen bestaan (b.v. helderveld, donkerveld, fasecontrast).
• Resolutie is het vermogen om twee afzonderlijke punten te onderscheiden. De resolue hangt af van de golflengte van de elektromagnetische straling en de numerieke apertuur van de lens.
• Contrast is het verschil in lichtintensiteit tussen object en achtergrond. Kleuren verhogen contrast.

Eenheden van meting

• Micro-organismen worden gemeten in micrometer (µm) en nanometer (nm).
• 1 µm = 10^-6 m = 10^-3 mm
• 1 nm = 10^-9 m = 10^-6 mm
• 1000 nm = 1 µm
• 0.001 µm = 1 nm

Relatieve grootte

• Afbeeldingen tonen relatieve groottes op een logarithmische schaal van verschillende micro-organismen en cellen.
• Kleine objecten (bv. virussen) zijn veel kleiner dan grote objecten zoals plantencellen.

Microscopie

• Filmpjes over microscopie staan beschikbaar op Canvas.

Golflengte van straling

• Verschillende golflengten van elektromagnetische straling hebben verschillende oplossend vermogen.
• Kortere golflengten (zoals UV) hebben een groter oplossend vermogen.

Vergroting

• Vergroting is de schijnbare toename in grootte van een object, meestal aangeduid met een vermenigvuldigende factor (bijv. 10x, 40x).
• Lichtmicroscopen gebruiken glazen lenzen.
• Elektronenmicroscopen gebruiken magnetische velden en lenzen.

Oplossend vermogen

• Oplossend vermogen is het vermogen om twee dicht bij elkaar liggende punten als afzonderlijke punten te onderscheiden.
• Het verbeterd door een kleiner golflengte van de elektromagnetische straling.
• Een verbeterd numerieke apertuur van de lens.
• De blote oog heeft een oplossend vermogen van ongeveer 0.1 mm of 100 µm.
• De beste lichtmicroscopen hebben een oplossend vermogen van ongeveer 0.2 µm.

Diverse Microscopen

• Diverse apparaten zijn beschikbaar, b.v. scanning tunneling microscopen, transmissie elektronenmicroscopen en scanning electron microscopen.
• Verschillende microscopen hebben verschillende oplossend vermogen.
• Afbeeldingen tonen diverse soorten microscopie en hun relatieve oplossend vermogen.

Contrast

• Een contrast is het verschil in lichtintensiteit tussen twee objecten of tussen een object en zijn achtergrond.
• Suikerkleuringen verhogen de contrast.

Lichtmicroscopie

• Er bestaan verschillende soorten lichtmicroscopen met verschillende achtergronden. B.v. helderveld microscopen, donkerveld microscopen en fasecontrast microscopen.
• Verschillende soorten microscopen staan op Canvas.

Helderveld Microscopie

• Donkere voorwerpen zijn zichtbaar tegen een heldere achtergrond.
• Enkelvoudige en samengestelde microscopen zijn typen van helderveld microscopen.
• Een microscoop bestaat uit diverse lenzen.

Samengestelde Helderveld Microscopen

• Meerdere lenzen worden gebruikt.
• Elk lichtstralen door het specimen.

Lichtmicroscoop

• Filmpjes over lichtmicroscopen staan op Canvas.

Immersie-olie

• Immersie-olie vergroot de resolutie van een microscoop.
• Door gebruik van immersie-olie vermindert de breking van licht.

Donkerveld Microscopie

• Heldere voorwerpen zijn zichtbaar tegen een donkere achtergrond.
• Een donkere achtergrond creëert een goed contrast van de zichtbare cellen.

Fasecontrast Microscopie

• Versterkt contrasten tussen verschillende delen van een specimen.
• Contrast wordt gecreëerd door lichtgolven.

Fluorescentie Microscopie

• UV-licht wordt gebruikt om fluorescerende substanties te laten oplichten.
• Cellen kunnen gekleurd worden door middel van fluorescerende substanties.

Immunofluorescentie

• Antilichamen die met fluorescentie zijn gekleurd kunnen gebruikt worden om structuren in levende wezens te vinden.

Confocale Microscopie

• Gemodificeerde fluorescentiemicroscoop
• gebruikt UV lasers om fluorescerende chemicaliën te exciteren.
• Een computer is gebruikt om een 3D beeld te maken.

Elektronenmicroscopie

• Gebruik van bundels van elektronen
• Grotere resolutie dan lichtmicroscopie
• Verschillende soorten elektronmicroscopie bestaan: Transmission electron microscope (TEM) en Scanning electron microscope (SEM)

Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM)

• Beeld van doorsneden
• Ultradunne monsters
• Elektronenbundel gaat door specimen.
• Vergroting 10.000-200.000X.

Scanning Elektronenmicroscopie (SEM)

• Je bekijkt oppervlakken van objecten.
• Een zwaar metaal laagje op de monsters (b.v. goud).
• Elektronenbundel gaat niet door het specimen.

Kleuring

• Verhoogt het contrast tussen structuren en tussen een specimen en de achtergrond.
• Bepaalde structuren worden benadrukt door een kleurstof.

Voorbereiding van specimen

• Monsters worden voorbereid door, b.v. fixatie.

Principes Kleuring

• Kleurstoffen bestaande uit positief en negatief ion.
• Kleuringen worden gebruikt om specifieke structuren in een preparaat te highlighten.

Enkelvoudige kleuring

• Gebruikt 1 kleurstof.
• Gericht op vorm, grootte en structuur.

Differentiele Kleuring

• Gebruikt meer dan 1 kleurstof.
• Om onderscheid tussen cellen en structuren te maken.
• B.v. Gram-kleuring, vuurvaste kleuring en endosporen kleuring.

Gram-kleuring

• Classificeert bacteriën in gram-positief of gram-negatief.
• Gram-positieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag in hun celwand, gramnegatieve bacteriën hebben een dunne peptidoglycaanlaag.

Mechanisme Gram Kleuring

• Proces van kleuring van bepaalde structuren in objecten.

Zuur-vaste kleuring

• Om cellen te onderscheiden.
• Bacteriën met een wasachtig celwand.

Endosporen Kleuring

• Sommige bacteriën maken endosporen.
• Deze sporen zijn bestand.

Negatieve kleuring

• Achtergrond gekleurd, niet de cel.
• Zure kleurstoffen worden afgestoten. Bv. Eosine, nigrosine.

Flagella Kleuring

• Om flagella te onderscheiden.
• Vb Carbolfuchsine in combinaties met mordant (middel) gebruikt.

Classificatie en Identificatie van micro-organismen

• Linnaeus en taxonomische categorieën. Zie cursus celbiologie.
• Domains. Zie cursus celbiologie.
• Taxonomische en identificerende kenmerken.

Identificatie van micro-organismen (methoden)

• Fysische eigenschappen.
• Biochemische testen.
• Serologische testen.
• Faagtypering.
• MALDI-TOF massaspectrometrie.
• Analyse van nucleïnezuren.

Andere methoden

• Dichotome determinatiesleutel. Extra filmpjes op Canvas!