Presentatie Hoofdstuk 4 Bauman PDF

Microscopy, Staining, and Classification Unit of measurement Micro-organismen worden gemeten in micrometer (μm) en nanometer (nm) 1 µm = 10–6 m = 10–3 mm 1 nm = 10–9 m = 10–6 mm 1000 nm = 1 µm 0.001 µm = 1 nm https://learn.genetics.utah.edu/content/cells/scale/ Microscopy Filmpje op...

Microscopy, Staining, and Classification Unit of measurement Micro-organismen worden gemeten in micrometer (μm) en nanometer (nm) 1 µm = 10–6 m = 10–3 mm 1 nm = 10–9 m = 10–6 mm 1000 nm = 1 µm 0.001 µm = 1 nm https://learn.genetics.utah.edu/content/cells/scale/ Microscopy Filmpje op Canvas Wavelength of radiation Magnification = Vergroting = schijnbare toename in de grootte van een object …X Het vergroten gebeurt dmv glazen lenzen (lichtmicroscopie) of dmv magnetische velden/lenzen (elektronenmicroscopie) Resolution = oplossend of scheidend vermogen De mogelijkheid om 2 uit elkaar gelegen punten als afzonderlijke punten te onderscheiden Hoe beter de resolutie, hoe beter nabijgelegen punten van elkaar onderscheiden kunnen worden Blote oog heeft een scheidend vermogen van 0,1 mm of 100 µm De beste lichtmicroscopen hebben een scheidend vermogen van 0,2µm Resolution Afhankelijk van 1. de golflengte (λ) van de elektromagnetische straling 2. Numerieke apertuur (NA) van de lens = vermogen van de lens om licht te capteren R = 0,61 x λ / NA  Hoe beter de numerieke apertuur van de lens, hoe beter de resolutie  Kortere golflengten geven een betere resolutie Contrast = Verschil in lichtintensiteit tussen 2 objecten of tussen een object en zijn achtergrond Voldoende contrast is belangrijk voor een goede resolutie Het kleuren van objecten verhoogt het contrast met de achtergrond Het gebruik van licht in fase kan ook het contrast verhogen Light microscopy Elk type microscoop die licht gebruikt om monsters of stalen te observeren. Verschillende types Helderveld microscopen (belichte achtergrond) Enkelvoudige en samengestelde microscopen Donkerveld microscopen (donkere achtergrond) Fase-contrast microscopen Differentiële interferentie contrast microscopen Fluorescentie microscopen Confocale micrscopen  Filmpje lichtmicroscoop op canvas Helderveld microscopen Lens Location of specimen Donkere voorwerpen on pin zijn zichtbaar tegen een heldere Specimen-positioning screw achtergrond Focusing control Enkelvoudige Stage-positioning screw microscopen 1 enkele lens Vergelijkbaar met vergrootglas Vb. microscopen van Van Helderveld microscopen Samengestelde microscopen Meerdere lenzen voor vergroting Licht gaat door specimen en komt zo in het objectief terecht Bezitten 1 of 2 oculaire lenzen (monoculair, binoculair) Totale vergroting = vergroting objectief x vergroting oculair Meestal condensor aanwezig (bundelt lichtstralen door het specimen) Helderveld microscopen Samengestelde microscopen Immersie-olie vergroot de resolutie Licht kan in lucht zo sterk worden gebroken dat het niet wordt opgevangen door het objectief met de sterkste vergroting Immersie-olie wordt gebruikt om deze breking tegen te gaan Figure 4.5 The Effect of Immersion Oil on Resolution Donkerveld microscopen Heldere voorwerpen zijn zichtbaar tegen een donkere achtergrond Enkel licht dat gebroken of gereflecteerd wordt door het specimen komt in het objectief terecht Verhoogt contrast Bruikbaar om kleine en kleurloze cellen te onderzoeken An opaque light stop inserted into a brightfield microscope is used to produce a darkfield image. The light stop blocks light traveling directly from the illuminator to the objective lens, allowing only light reflected or refracted off the specimen to reach the eye. Helderveld microscoop Donkerveld microscoop Fase-contrast microscopen Accentueert de diffractie van het licht dat door een specimen gaat (contrast wordt gecreëerd door lichtgolven die uit fase lopen) Laat onderzoek van levende organismen toe Fluorescentie microscopen Gebruikt UV-licht (korte golflengte) Fluorescerende substanties absorberen UV-licht en zenden zichtbaar licht (met langere golflengte) uit Cellen kunnen gekleurd worden door fluorescerende kleurstoffen (fluorochromen) als ze niet van nature fluoresceren Immunofluorescentie Confocale microscopen Gemodificeerde fluorescentiemicroscoop Ook gebruik van fluorescerende kleurstoffen of fluorescente antilichamen Gebruik van UV lasers om de fluorescente chemicaliën te exciteren en dit in 1 enkel vlak De laser kan verschillende vlakken van een object afscannen en een beeld kan bekomen worden van elk vlak Een computer reconstrueert een 3D beeld Electron microscopy Maken gebruik van bundels van elektronen Elektronenmicroscopen hebben een veel grotere resolutie dan lichtmicroscopen (beter dan 0,1 nm in vgl met 200 nm) Hoe kleiner de golflengte, hoe beter de resolutie (R wordt kleiner) Golflengte zichtbaar licht is ongeveer 550 nm, dat van versnelde elektronen is 0,01 nm. Vergroten objecten in de range van 10.000 tot 200.000X Laten een gedetailleerde studie toe van intracellulaire structuren, bacteriën, virussen en grote atomen. 2 types Transmissie elektronenmicroscoop (TEM) Scanning elektronenmicroscoop (SEM) Transmissie elektonenmicroscopie Transmissie elektonenmicroscopie Beelden van doorsneden bekijken Ultradunne staaltjes worden op metalen roostertje gebracht Elektronen gaan door specimen, dan door elektromagnetische lens, en vervolgens worden ze op een fluorescerende plaat geprojecteerd zodat ze zichtbaar worden. Op plaatsen waar het preparaat het meest dens is (veel massa) treedt de meeste verstrooiing van elektronen op, zodat het aantal elektronen dat uiteindelijk vastgelegd wordt kleiner is. Het gevormde beeld is dan donkerder in vergelijking met de minder dense plaatsen van het preparaat Transmissie elektonenmicroscopie Elektronenbundel kan alleen voortbewegen in vacuum  levende objecten kan men niet bekijken Coupes moeten veel dunner zijn dan bij lichtmicroscopie Preparaten kunnen gekleurd worden met zware metaalzouten om contrast te verhogen. Enkel zwart-wit beelden, 2 dimensionaal Transmissie elektonenmicroscopie Zie filmpje canvas Scanning elektonenmicroscopie Beelden van oppervlakten bekijken Specimen wordt vooraf gecoat met een zwaar metaal zoals platinum of goud. Elektronen gaan niet door specimen. Het object wordt volgens een scanning beweging gebombardeerd met elektronen geproduceerd door het elektronengeweer. Deze invallende elektronen maken aan de oppervlakte secundaire elektronen vrij. Deze secundaire elektronen, uitgezonden door het object, produceren het beeld.  Electron gun Primary electron beam Electromagnetic lenses Viewing screen Electron collector Secondary electrons Specimen Amplifier Scanning. (Left) In a scanning electron microscope, primary electrons sweep across the specimen and knock electrons from its surface. These secondary electrons are picked up by a collector, amplified, and transmitted onto a viewing screen or photographic plate. (Right) In this colorized scanning electron micrograph (SEM), the surface structures of Paramecium can be seen. Note the three-dimensional appearance of this Scanning elektonenmicroscopie Een volledig object kan worden bestudeerd. 3D beelden kunnen worden gegenereerd. Enkel oppervlaktestructuren kunnen vergroot worden. Zwart-wit beelden die kunnen worden ingekleurd. Staining Vergroten van contrast tussen structuren en tussen een specimen en de achtergrond Het MO wordt behandeld met een kleurstof die bepaalde structuren accentueert. Preparing specimen for staining 1. Maken van een uitstrijkje Een dun laagje van een suspensie bacteriën op een voorwerpglaasje (=objectglaasje of draagglaasje) 2. Fixeren van het uitstrijkje Om MO te doen vasthechten op het glaasje en ze tegelijkertijd te doden Hitte fixatie of chemische fixatie Principles of staining Kleurstoffen bestaan uit een positief en een negatief ion, één van beide is gekleurd (chromofoor). In een basische kleurstof is de chromofoor een positief geladen ion Meest voorkomende omdat de meeste cellen negatief geladen zijn In een zure kleurstof in de chromofoor een negatief geladen ion Wanneer we de achtergrond kleuren ipv de cel spreken we van een negatieve kleuring Enkelvoudige kleuring Er wordt slechts 1 basiskleurstof gebruikt Legt de focus op het volledige MO, de grootte, de vorm en structuren Vb. methyleenblauw Differentiële kleuringen Gebruiken meer dan 1 kleurstof Worden gebruikt om een onderscheid te kunnen maken tussen cellen en structuren Veel gebruikte differentiële kleuringen: Gram kleuring Vuurvaste kleuring Endosporen kleuring Histologische kleuringen Gram kleuring Classificeert de bacteriën in gram-positief of gram-negatief Gram-positieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag in hun celwand Gram-negatieve bacteriën hebben een dunne peptidoglycaanlaag, een buitenmembraan met lipopolysachariden (LPS) in hun celwand Gram kleuring Mechanisme Gram kleuring  Kristalviolet kleurt de zure celbestanddelen  Iodide vormt kristallen samen met kristalviolet (KV-I) en fixeert zo de kleurstof  Gram-positief  Alcohol dehydrateert het peptidoglycaan  Alcohol doet de teichoïneketens neerslaan  KV-I kristallen kunnen niet uit de cel De paarse kleur blijft behouden  Gram-negatief  Alcohol lost de vetten van de buitenmembraan op en laat openingen achter in het peptidoglycaan  KV-I wordt doorgelaten  Een kontrastkleurtsof, safranine of fuchsine kleurt de zure celbestandelen De rode kleur blijft behouden Gram kleuring Kleur van Kleur van Gram- Gram- positieve negatieve cellen cellen Eerste purper/paars purper/paars kleurstof: Kristalviolet beitsmiddel: purper/paars purper/paars Iodide Ontkleuringsmi purper/paars kleurloos ddel: Alcohol-aceton Tweede purper/paars rood Zuur-vaste kleuring Om cellen te onderscheiden van de geslachten Mycobacterium, vb. Mycobacterium tuberculosis Nocardia Deze bacteriën bezitten grote hoeveelheden aan wasachtige substanties in hun celwand (kleuren niet gemakkelijk met wateroplosbare kleurstoffen) Zuur-vaste kleuring Kleur van Kleur van Zuur-Vaste Niet zuur- MO Vaste MO Eerste rood rood kleurstof: Carbolfuchsine (verwarmen) Ontkleuring rood kleurloos agens: Zure alcohol Tweede rood blauw kleurstof: Zuur-vaste kleuring Zuur-vaste kleuring Acid-fast staining of a patient’s sputum is a rapid, reliable, and inexpensive method to diagnose tuberculosis. What color would bacterial cells appear if the patient has tuberculosis? Endosporen kleuring Sommige bacteriën maken endosporen aan Vnl. binnen geslachten Bacillus en Clostridium Endosporen zijn resistente, slapende structuren die in de cel gevormd worden en die niet kunnen gekleurd worden met gewone kleurtechnieken Eerste kleurstof: malachietgroen, meestal met verwarming Ontkleuring van de cellen: water Tegenkleuring: safranine Sporen kleuren groen tegen roze of rode cellen Endosporen kleuring Negatieve kleuring Wanneer we de achtergrond kleuren in plaats van de cel spreken we van een negatieve kleuring Zure kleurstoffen worden afgestoten door het negatieve celoppervlak en kleuren de cellen dus niet Vb. Eosine, nigrosine Negatieve kleuring Wanneer we de achtergrond kleuren in plaats van de cel spreken we van een negatieve kleuring Zure kleurstoffen worden afgestoten door het negatieve celoppervlak en kleuren de cellen dus niet Vb. Eosine, nigrosine Laat toe kapsels goed zichtbaar te maken Flagella kleuring Vb. Carbolfuchsine in combinatie met beitsmiddel (mordant) Type of Stain Examples Results Typical Image Representative Uses Simple Stains (use a Crystal violet Uniform purple stain Reveals size, morphology, and single dye) Methylene blue Uniform blue stain arrangement of cells Differential Stains Gram stain Gram-positive cells are Differentiates Gram-positive and (use two or more dyes purple; Gram-negative Gram-negative bacteria, which is to differentiate between cells are pink typically the first step in their cells or structures) identification Blank Ziehl-Neelsen acid- Pink to red acid-fast Distinguishes the genera fast stain cells and blue non- Mycobacterium and Nocardia acid-fast cells from other bacteria Blank Schaeffer-Fulton Green endospores and Highlights the presence of endospore stain pink to red vegetative endospores produced by species in cells the genera Bacillus and Clostridium Type of Stain Examples Results Typical Representative Uses Image Special Stains Negative stain Background is dark; Reveals bacterial capsules for capsules cells unstained or stained with simple stain Blank Flagellar stain Bacterial flagella Allows determination of become visible number and location of bacterial flagella Kleuring voor elektronenmicroscopie Het contrasteren gebeurt hier niet met gewone kleurstoffen maar met zouten van zware metalen zoals osmiumtetroxide (OsO4) en loodnitraat (absorberen elektronen zodat er minder op de fotografische plaat terechtkomen. Classification and identification of (micro)organisms Linnaeus and Taxonomic Categories Zie cursus celbiologie Domains Zie cursus celbiologie Taxonomic and Identifying Characteristics Identificeren van micro- organismen Fysische eigenschappen Biochemische testen Serologische testen Faagtypering MALDI-TOF massaspectrometrie Analyse van nucleïnezuren Identificeren van micro- organismen Fysische eigenschappen Protozoa, fungi, algae en parasitaire wormen worden gewoonlijk geïdentificeerd aan de hand van hun morfologie (vorm) Bacteriën kunnen geïdentificeerd worden obv Morfologie van de cel (kok, bacil, …) Morfologie van de kolonie Kleuringen (GRAM-kleuring, endosporen kleuring, …) beweeglijkheid Identificeren van micro- organismen Biochemische testen Nagaan welke chemische producten de bacterie kan gebruiken of produceren Nagaan welke suikers de micro-organismen kunnen fermenteren, welke substraten (zoals aminozuren, zetmeel, citraat en gelatine) ze kunnen gebruiken, welke afvalproducten ze produceren (zoals H2S) Identificeren van micro- organismen Serologische testen Studie van antigen-antilichaam interacties in het laboratorium Vele micro-organismen triggeren een immuunrespons die leidt tot de productie van antilichamen Antilichamen kunnen gebruikt worden om micro-organismen te identificeren Identificeren van micro- organismen Faagtypering Bacteriofagen zijn virussen die bacteriële cellen infecteren Bacteriofagen zijn specifiek voor de gastheer die ze infecteren Identificeren van micro- organismen MALDI/TOF Massaspectrometrie Identificeren van eiwitten karakteristiek voor bepaalde species Analyse van nuleïnezuren De nucleïnezuursequentie kan gebruikt worden om bacteriën te classificeren en identificeren G+C gehalte kan bepaalde worden Dichotome determinatiesleutel Reeks gepaarde uitspraken waarbij slechts één van de twee keuzes van toepassing is op een bepaald organisme Sleutel leidt de gebruiker naar een ander paar instructies of geeft de naam van het organisme Extra filmpjes op Canvas!