Medii de Cultură: Bacterii

Medii de Cultură

• Mediile de cultură sunt soluții sau substraturi solide ce furnizează nutrienții și condițiile fizico-chimice potrivite pentru cultivarea bacteriilor.
• Acestea pot fi utilizate pentru cultivarea și izolarea bacteriilor, testarea sensibilității la antibiotice, stocarea sau transportul culturilor.

Cerințe Față de Mediile de Cultură

• Trebuie să asigure necesitățile nutritive și energetice ale bacteriilor.
• Umiditatea trebuie să fie optimă.
• pH-ul trebuie să fie optimal (7,2-7,4) și constant.
• Potențialul de oxido-reducere trebuie să fie optimal: anaerobi (rH2<5) și aerobi (rH2>10).
• Mediile trebuie să fie izotonice (0,5% NaCl), sterile și transparente.

Clasificarea Mediilor de Cultură După Proveniență

• Empirice, naturale: conțin produse de origine animală sau vegetală cu o compoziție chimică greu de controlat (sânge, ser, lapte, ouă, extracte din carne, etc).
• Sintetice: includ ingrediente chimice pure, astfel compoziția chimică este cunoscută cu exactitate.
• Semisintetice: o combinație între cele două.

Clasificarea După Consistență

• Medii lichide (bulion): se utilizează pentru a obține biomasă bacteriană și produsele rezultate (antibiotice, enzime, toxine).
• Medii solide: conțin 10-15% gelatină sau 2-3% agar-agar (extras din alge roșii), topire la 80-100°C, solidificare la 42°C.
• Plăcile cu geloză în cutii Petri se utilizează pentru izolarea culturilor pure.
• Geloza înclinată se folosește pentru acumularea culturilor pure.
• Medii semisolide: conțin 0,2-0,5% agar-agar și sunt folosite pentru a studia activitatea biochimică sau motilitatea bacteriilor.

Clasificarea După Compoziția Chimică și Destinație

• Medii uzuale (universale, simple):
  • Apă peptonată (apă + 1% peptonă + 0,5% NaCl) este un exemplu.
  • Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% peptonă + 0,5% NaCl) este un exemplu.
  • Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar) este un exemplu.
  • Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină) este un exemplu.
• Sunt utilizate pentru cultivarea bacteriilor nepretențioase.
• Sterilizarea se face prin autoclavare la 120°C timp de 20 de minute.

Medii Complexe

• Medii elective: conțin medii simple cu adaosuri ce permit creșterea microorganismelor cu cerințe nutritive exigente (bulion-ser pentru streptococi, neisserii).
• Medii selective: sunt solide, conțin adaosuri sau condiții fizico-chimice care stimulează creșterea unor specii și inhibă creșterea altora (geloza salină pentru stafilococi).

Medii de Îmbogățire

• Sunt medii selective lichide, utilizate pentru a îmbogăți flora patogenă și inhiba flora de asociație din microbiotă (ex: materii fecale).
• Etapă premergătoare însămânțării pe medii selective.
  • Mediul Mueller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit) este un exemplu.
  • Mediul Kauffman (mediul Mueller+bilă+verde de briliant) – pentru Salmonella.
  • Apa peptonată alcalină (pH=8) – pentru Vibrio cholerae.

Medii Diferențial-Diagnostice (DD)

• Permit diferențierea speciilor bacteriene în baza activității lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere...).

Medii Speciale

• Se utilizează pentru caracterizarea tulpinilor bacteriene.
• Se studiază proprietăților zaharolitice, folosind șirul pestriț Hiss.
• Proprietăților de oxido-reducere: pot fi studiate utilizând mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella.
• Proprietăților lipolitice: pot fi studiate utilizând geloza cu gălbenuș de ou.
• Proprietăților hemolitice: pot fi studiate utilizând geloza-sânge.
• Pentru izolarea anumitor bacterii, cum ar fi fungi (Sabouraud).

Medii de Transport

• Sunt destinate transportului sau stocării unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior.
• Scopul este de a menține bacteriile în viață, fără a favoriza multiplicarea lor.

Cultivarea Bacteriilor

• O cantitate mică de material ce conține bacterii (inoculum) se introduce într-un mediu de cultură (însămânțare, inoculare).
• Ulterior, mediul va fi incubat în termostat pentru menținerea temperaturii optime.
• În timpul incubării (18-24-48 ore), bacteriile cresc și se divid, formând o cultură bacteriană (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare într-un mediu).
  • M.tuberculosis are nevoie de 3-5 săptămâni.
  • V.cholerae are nevoie de 6-12 ore.

Tipuri de Culturi

• Cultură pură: formată din bacterii de aceeași specie.
• Cultură mixtă: compusă din bacterii de specii diferite.
• Tulpină: populație microbiană constituită din descendenții unei singure izolări într-o cultură pură, care va fi studiată ulterior.
• Clonă: populație care rezultă din multiplicarea unei singure celule.

Colonii

• O colonie este o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau dintr-un grup de celule (UFC - Unitate Formatoare de Colonii) pe suprafața unui mediu solid.
• Fiecare specie bacteriană formează colonii specifice, un caracter util în identificare.

Caracteristicile Coloniilor

• Dimensiuni: pot fi mici (0,1-1mm), medii (1-2mm) sau mari (2-3mm).
• Contur (margini): poate fi regulat/neted, ondulat, zimțat, lobat sau dantelat.
• Suprafață: poate fi plată, bombată, convexă sau ombilicată.
• Formă: circulară, filamentoasă sau neregulată.
• Culoare (pigmentație): poate fi albă, galbenă sau aurie.
• Densitate: poate fi opacă sau transparentă.
• Consistență: poate fi cremoasă, untoasă, uscată sau mucoidă.

Tipurile de Colonii

• Colonii S (smouth): rotunde, netede, umede și lucioase.
• Colonii R (rough): margini neregulate, suprafață uscată și rugoasă.
• Colonii M (mucoase): mari, bombate, lucioase și caracteristice bacteriilor capsulate.

Dinamica Multiplicării Bacteriilor în Culturi

• În funcție de modul de dezvoltare, culturile bacteriene se disting în:
  • Culturi discontinue/periodice.
  • Culturi continue.
  • Culturi sincrone.
• Culturile discontinue se obțin la cultivarea bacteriilor într-un volum limitat de mediu și sunt frecvent utilizate în laboratorul de microbiologie.

Cultura Continuă

• Se realizează când mediul de cultură este reînnoit continuu și îmbogățit cu oxigen odată cu eliminarea unei cantități de cultură.
• Cultura se află permanent în faza exponențială.
• Se utilizează în microbiologia industrială pentru producerea de vaccinuri, enzime sau alte substanțe (medicamente, proteine, metaboliți).
• Două sisteme cheie sunt:
  • Chemostat: prin un factor limitat (nutrient în cantitate minimală) menține cultura la o rată subminimală de creștere.
  • Turbidostat: reglează fluxul de mediu proaspăt în raport cu o anumită densitate optică a culturii, menținând cultura la o rată maximă de creștere.
• În intestin există culturi continue.
• Culturi sincrone: culturi în care bacteriile se divid în același timp.

Respirația Bacteriană

• Este un proces metabolic prin care bacteriile generează energie transferând electroni de la o moleculă donatoare la o moleculă acceptoare.
• Bacteriile utilizează lanțuri de transport de electroni situate în membranele lor celulare.
• Aceste lanțuri cuprind reacții redox, în care electronii sunt transferați de la o moleculă la alta, eliberând energie, înmagazinată sub formă de ATP.
• Bacteriile prezintă o gamă largă de donatori de electroni (substanțe pe care le oxidează) și acceptori de electroni (oxigen, nitrat, sulfat), permițându-le să prospere în diverse medii.

Variații în Lanțurile Respiratorii Bacteriene

• Bacteriile au o mare varietate de componente în lanțurile lor respiratorii.
  • Dehidrogenaze: enzime care oxidează donatorii de electroni.
  • Chinone: transportori de electroni liposolubili.
  • Citocromi: proteine ce conțin hem și transportă electroni.
  • Oxidaze și reductaze terminale: enzime ce transferă electroni la acceptorii finali.
• Bacteriile pot modifica compoziția lanțurilor lor respiratorii în funcție de disponibilitatea oxigenului și a altor acceptori de electroni.
• Aceste proprietăți permit utilizarea unei game largi de donatori și acceptori de electroni, rezultând în supraviețuirea lor în medii variate.

Adaptări Respiratorii

• În condiții aerobe, bacteriile utilizează lanțuri respiratorii care transferă electroni la oxigen.
• În condiții anaerobe, utilizează lanțuri respiratorii care transferă electroni la nitrat, sulfat sau alți acceptori.
• Lanțurile respiratorii joacă un rol în ciclurile biogeochimice (N, S, C).
• În funcție de utilizarea oxigenului, bacteriile pot fi:
  • Aerobe: oxigenul molecular este ultimul acceptor de hidrogen.
  • Obligat aerobe: utilizează exclusiv O2 ca acceptor de hidrogen.
  • Facultativ anaerobe: pot crește aerob sau anaerob, folosind alternativ acceptorii de hidrogen.
  • Anaerobe: ultimul acceptor de hidrogen este un compus anorganic sau organic (fermentație).

Identificarea Bacteriilor Anaerobe

• Bacteriile anaerobe pot fi identificate prin creșterea lor în eprubete cu bulion tioglicolat.
  • Aerobii obligatorii: se adună în partea de sus unde concentrația de oxigen este maximă.
  • Anaerobii obligatorii: se adună în partea inferioară, deoarece oxigenul este toxic.
  • Anaerobii facultativi: se adună mai ales în partea de sus, obținând mai mult ATP prin respirație aerobă.
  • Microaerofilii: necesită oxigen, dar sunt toxici la concentrații ridicate, adunându-se sub suprafață.
  • Organismele aerotolerante: nu necesită oxigen și pot fi găsite uniform în toată eprubeta.

Fermentația

• Compuşii organici funcţionează unii ca donor, alţii ca acceptor de hidrogen.
• Rezultă un amestec de produşi finali, unii mai oxidaţi alţii mai reduşi.
• Mai puţin eficientă decît respiraţia aerobă pentru obţinerea energiei.
• Este utilizată de bacteriile obligat şi facultativ anaerobe.

Fermentaţia alcoolică

• Este un proces anaerob prin care glucidele pot fi fermentate și sunt metabolizate prin reacții de oxidoreducere sub acțiunea echipamentului enzimatic al microorganismelor.
• Produșii principali includ alcool etilic și CO2.
• Produși secundari pot fi alcooli superiori, acizi, aldehide etc.
• Agenții tipici ai fermentației alcoolice sunt drojdiile din genul Saccharomyces, care pot produce alcool etilic peste 8º.
• Unele bacterii, cum ar fi Bacillus macerans și Zymomonas, pot produce alcool etilic, dar nu sunt considerate agenți tipici.
• Aceste bacterii produc cantități mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile.

Proprietățile Biotehnologice ale Drojdiilor Fermentative

• Drojdiile din genul Saccharomyces utilizate în practică sunt studiate și selecționate în funcție de:
  • Puterea alcooligenă: concentrația maximă de etanol ce se poate acumula când există un exces de zahăr.
  • Alcoolorezistența: capacitatea drojdiei de a continua fermentația la creșterea concentrației de alcool.

Alte Proprietăți ale Drojdiilor

• Sulfitorezistența: capacitatea de a produce fermentația alcoolică în prezența unor concentrații de 200-500 mg SO2/dm3.
• Capacitatea de floculare și pulverulența: proprietăți datorate structurii peretelui celular și a modificărilor de pH.
• Osmotoleranța: capacitatea de a produce fermentația într-un mediu cu o concentrație crescută de zahăr.
• Caracterul killer: capacitatea de a sintetiza intracelular o toxină cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile.

Fermentația Lactică

• Este un proces anaerob prin care glucidele sunt metabolizate sub acțiunea echipamentului enzimatic al microorganismelor, rezultând piruvat și apoi acid lactic.
• Produsul principal este acidul lactic.
• Produsele secundare includ diacetil, acetoină, acid acetic, alcool etilic și CO2.
• Bacteriile lactice sunt considerate agenți tipici ai fermentației și sunt folosite industrial în biotehnologii alimentare.
• Exemple includ industrializarea laptelui și a cărnii, dar și în panificație și conservarea produselor vegetale.
• Mucegaiuri din genurile Aspergillus, Penicillium și Mucor pot fi cultivate submers cu aerare dirijată.

Adaptări și Aplicații Ale Fermentației Lactice

• Bacteriile lactice au o răspândire largă și sunt destul de pretențioase din punct de vedere nutritiv.
• Se găsesc în microbiota intestinală, pe plante, în lapte, și în cavitatea bucală.
• Pot fermenta pentoze, hexoze, dizaharide, acid malic și citric.
• Preferă aminoacizii, peptidele și amidele ca surse de azot și necesită vitamine precum B2, B6, biotina și acid pantotenic.
• Procesul are aplicații în producerea iaurtului, brânzeturilor și conservarea alimentelor.
• Specii implicate includ Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lb. casei, Lb. bifidum și Leuconostoc (L. mesenteroides).

Obținerea Iaurtului

• Iaurtul se obține prin fermentarea lactozei de către bacteriile lactice.
• Bacteriile lactice consumă lactoza și produc acid lactic, care acidifică laptele.
• Acidificarea duce la coagularea proteinelor din lapte (cazeină), rezultând textura specifică a iaurtului.
• Specii bacteriene utilizate frecvent:
  • Lactobacillus bulgaricus (necesar pentru acidificarea laptelui și gustul specific).
  • Streptococcus thermophilus (contribuie la acidificare și dezvoltarea texturii cremoase).
• Chefirul conține o diversitate largă de bacterii și drojdii, incluzând Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus și Torulaspora delbrueckii.

Obținerea Murăturilor

• Se bazează pe fermentarea zaharurilor din legume (castraveți, varză) de către bacteriile lactice.
• Bacteriile lactice produc acid lactic, care acidifică mediul și conservă legumele, prevenind dezvoltarea bacteriilor dăunătoare.
• Acest proces conferă un gust acru specific.
• Fermentarea necesită condiții anaerobe, de aceea legumele sunt introduse în saramură.
• Fiecare tip de murătură are o compoziție microbiană proprie.
• Temperatura, salinitatea, pH-ul și disponibilitatea oxigenului influențează microorganismele care se dezvoltă.
• Bacteriile implicate includ specii din genurile Lactobacillus (L. plantarum), Leuconostoc (L. mesenteroides) și Pedioccocus.

Fermentația Propionică

• Este un proces biochimic anaerob prin care acidul lactic este transformat în acid propionic, acid acetic și CO2.
• Este realizată de enzimele specifice bacteriilor propionice.
• Bacteriile care produc fermentația propionică aparțin genului Propionbacterium și genurilor Clostridium și Veillonella.

Aplicații și Bacterii Implicate în Fermentația Propionică

• Fermentația propionică are importanță specială în producerea brânzeturilor maturate tari, cu goluri interioare (tip Schweitzer).
• Exemple de bacterii implicate:
  • Propionibacterium freudenreichii van Niels și Propionibacterium shermanii (utilizate pentru brânzeturile tip Schweitzer).
  • Propionibacterium rubrum van Niels (formează petele roșii pe brânzeturi).
  • Clostridium propionicum Neillonela.
• Fiziologic, bacteriile propionice pot folosi ca substrat diverse hexoze (glucoză, lactoză, maltoză), acizi organici (lactic, malic) și glicerină.
• Sursele de azot includ peptone, peptide și aminoacizi.

Procesul și Microorganismele Implicate în Fermentația Malo-Lactică

• Fermentația malo-lactică este un proces biochimic prin care acidul malic din fructele necoapte este transformat în acid lactic și CO2.
• Poate produce compuși secundari precum acidoxal-acetic, acid piruvic, acetoină, diacetil și esteri.
• Aciditatea fructelor este redusă cu peste 30%.
• Este realizată de familia bacteriilor lactice, incluzând Oenococcus oeni, Lactobacillus și Pediococcus.
• În oenologie este inițiată de O. oeni și este folosită la vinul Chardonnay.

Rolul și Tipuri de Microorganisme

• Leuconostoc și Pedicoccus (Bacterium gracile, Micrococcus malolacticus, M. multivorax, M. variococcus, Streptococcus malolacticus, S. mucilaginosus vini, Pedicoccus vini) sunt importante în vinificare.
• Are o importanță deosebită în vinificarea strugurilor necopți sau a celor cu aciditate ridicată.

Fermentația Butirică

• Este un proces biologic anaerob prin care bacteriile butirice metabolizează diverse surse de carbon în acid butiric și gaze (CO2 și H2).
• Pot produce diverși solvenți (butanol, propanol, etanol sau acetonă).
• Bacteriile butirice se găsesc în pământ, cereale, conserve și materii fecale.
• Sunt morfologic bastonașe care sporulează ușor.
• Se caracterizează prin capacitatea de a forma endospori deformanți, mai mari decât celula vegetativă.

Acidul Butiric și Microorganismele Implicate

• Bacteriile butirice sunt un constituent al microbiotei colonului, iar acidul butiric este un acid gras cu lanț scurt (SCFA).
• Acidul butiric efecte antiinflamatorii, și anticancerigene.
• Genul Clostridium.

Fermentații Oxidative (Aerobe)

• Substanțele substratului sunt transformate enzimatic în acizi organici, în prezența oxigenului molecular din aer.
• Spre deosebire de respirația aerobă, oxidarea este limitată și se oprește la formarea unor produși intermediari (acizi). • Fermentație acetica • Fermentatie citrica • Fermentatie fumarica • Fermentatie Succinica • Fermentatie Malica • Fermentatie Oxalica

Fermentația Acetică

• Alcoolul etilic (substratul) este oxidat aerob în acid acetic.
• CH3-CH2-OH+O2→CH3-COOH+H2O este o reacție exotermică.
• Ex: Acetobacter și Gluconobacter, bacterii strict aerobe, ce formează o voal pe lichid.
• A. xylinum și A. xilinoides dau un strat gelatinos beta-glucanic în vin oțetit.

Condiții și Microorganisme Implicate în Fermentația Acetică

• Mezofile cu temperatură optimă de 30 °C (producție între 0-35 °C), pH optim de 5,5 și toleranță la acid.
• Alcoolul etilic și glucoza sunt surse de carbon.
• Acetobacter oxidează și acetații după epuizarea alcoolului.
• Utilizare săruri de amoniu, aminoacizi și peptide ca surse de azot.
• Necesită tiamină, niacină și acid pantotenic ca factori de creștere.

Aspecte Practice ale Fermentației Acetică

• Materii prime utilizate: soluții alcoolice, vin, cidru, malț, bere, orez.
• Fermentarea boabelor de cacao generează caracteristici specifice.
• A. xilinum este utilizat pentru a produce beta-glucani utilizați în membrane filtrante.
• Sunt condiții de producție: conținut de alcool <12%, aciditate volatilă >1,4-1,7 g/L și temperaturi ambiante.
• Prevenirea constă în utilizarea acidului sulfuros ca antiseptic.
• Specii bacteriene: Acetobacter ascendens, A. orlenense, A.pasteurianus, A.vini acetati, A. xylinoides, A. xylinum.
• Drosophila melanogaster răspândește bacteriile acetice.

Alte Fermentații Oxidative

• Fermentația citrică: un proces oxidativ complex unde zaharoza e transformată în acid citric, produsă de Aspergillus niger var. citricus și Candida oleophilla.
• Fermentația fumarică, succinică și malică: glucidele se transformă în acid succinic, acid fumaric și acid malic sub acțiunea Mucor, Aspergillus și Rhisopus.
• Fermentația oxalică: acidul oxalic se obține din glucide, glicerină, peptone, acizi (citric, succinic, malic, tartric și acetic) și alcooli, fiind realizată Sterigmatocytis nigra.