Lezione 2: Struttura delle Read Illumina

Study Notes

Argomento principale: Struttura delle read di sequenziamento Illumina.
Analisi della qualità dei dati di sequenziamento Illumina.
Durante il sequenziamento di un campione, sono prodotte diverse migliaia di read.
Queste read vengono inserite in un unico file per l'analisi dei dati.
Il formato del file, la formattazione e la qualità del sequenziamento delle read dovranno essere analizzati.

Le read sono costituite da adattatori e inserti di DNA.
Gli adattatori sono sequenze necessarie per il sequenziamento e per il legame alla piastra di sequenziamento.
Gli inserti di DNA sono le sequenze la cui composizione nucleotidica non è nota e deve essere ricavata.

Il primo passo del sequenziamento è la costruzione di una libreria di DNA o RNA.
Una libreria è un insieme di molecole di DNA o RNA per il sequenziamento.
Sono affiancate da adattatori.
Gli adattatori contengono sequenze necessarie per legare le sequenze alla piastra di sequenziamento e per le fasi di amplificazione.
Le sequenze composte da adattatori e da inserto di DNA costituiscono una read.
Gli adattatori vengono rimossi dalle read durante il sequenziamento ma non costituiscono molecole che devono essere sequenziate.
Le sequenze chiamate P5 (rossa) e P7 (verde) consentono il legame alla piattaforma Illumina.
Le sequenze chiamate Index consentono di associare correttamente le read ad ogni campione.
Le sequenze primer Rd1 SP e Rd2 SP servono da innesco per la PCR.

Single-end: i frammenti vengono sequenziati a partire da una sola estremità. Il risultato è un unico file di read.
Paired-end: i frammenti vengono sequenziati a partire da entrambe le estremità. Il risultato sono due file di read, uno per ogni filamento, definiti read forward e reverse.

Ogni file fastq per un campione è caratterizzato da quattro righe per ogni sequenza.
Riga 1: Header, inizia con @ e contiene informazioni sull'identificatore della sequenza.
Riga 2: Sequenza nucleotidica.
Riga 3: Simbolo '+' (con informazioni aggiuntive opzionali).
Riga 4: Phred Score, codificato in ASCII, indica la qualità di ogni sequenza.
Per ogni nucleotide è calcolata la probabilità di sequenziamento errato con il Phred Score(Q).
- Q = -10 * log10(P)
- P = 10^(-Q/10)

Comandi per la gestione dei file in una directory.
Uso del comando wc -l per contare il numero di righe di un file (anche .gz).
Uso di awk per estrarre informazioni da file di testo.
Espressioni regolari per gestire i file e i dati.
Esempio di codice bash per analizzare un file fastq e contare il numero di read.
Descrizione del parametro -k in gunzip.
Uso del comando gunzip -k per decomprimere i file .gz senza perdere il file originel.
Esempio di codice per analizzare tutti i file fastq presenti in una directory.
Spiegazione della tecnologia paired-end.

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