Lezione 2: Struttura delle Read Illumina
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Questions and Answers

Qual è la ragione principale per cui è necessaria la rimozione di un’adenina in più durante l'operazione di trimming?

  • L'adattatore non si lega correttamente al DNA
  • L'A-tailing ha causato l'aggiunta di un'adenina extra (correct)
  • La sequenza legata all'adattatore è più lunga del previsto
  • Errori di sequenziamento che generano una copia extra
  • Cosa accade all'intero adattatore durante il sequenziamento Illumina?

  • Viene modificato per migliorare la sequenza
  • Viene rimosso completamente dal sequenziatore (correct)
  • Viene allungato per adattarsi al DNA
  • Viene replicato insieme al DNA
  • Perché la sequenza legata all'adattatore per la read 2 potrebbe apparire diversa?

  • Perché l'adattatore subisce mutazioni frequenti
  • Per la presenza di variazioni nell'A-tailing (correct)
  • Perché utilizza una diversa strategia di legame
  • Perché è stata alterata dal sequenziamento
  • Qual è la funzione principale del trimming nel processo di sequenziamento?

    <p>Eliminare parti non necessarie dell'adattatore</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti affermazioni è vera riguardo all'A-tailing?

    <p>Consiste nell'aggiunta di adenine alla fine di una sequenza</p> Signup and view all the answers

    Qual è la funzione principale delle sequenze primer Rd1 SP e Rd2 SP nella PCR?

    <p>Servono come inneschi per la reazione di PCR</p> Signup and view all the answers

    Cosa rappresentano gli indici nel processo di sequenziamento Illumina?

    <p>Sequenze uniche per identificare campioni diversi</p> Signup and view all the answers

    Quale affermazione è vera riguardo alla presenza di Index1 e Index2 in un esperimento di sequenziamento?

    <p>Index1 è sempre presente mentre Index2 potrebbe essere assente</p> Signup and view all the answers

    Quale delle seguenti caratteristiche è specifica per il kit TruSeq nel sequenziamento Illumina?

    <p>La struttura dell'adattatore può variare in base alla coppia di index</p> Signup and view all the answers

    Per quale motivo si usano coppie di indici diversi per campioni diversi durante il sequenziamento?

    <p>Per poter sequenziare più campioni contemporaneamente sulla stessa macchina</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Lezione 2: Struttura delle Read Illumina

    • Argomento principale: Struttura delle read di sequenziamento Illumina.
    • Analisi della qualità dei dati di sequenziamento Illumina.
    • Durante il sequenziamento di un campione, sono prodotte diverse migliaia di read.
    • Queste read vengono inserite in un unico file per l'analisi dei dati.
    • Il formato del file, la formattazione e la qualità del sequenziamento delle read dovranno essere analizzati.

    Struttura delle Read

    • Le read sono costituite da adattatori e inserti di DNA.
    • Gli adattatori sono sequenze necessarie per il sequenziamento e per il legame alla piastra di sequenziamento.
    • Gli inserti di DNA sono le sequenze la cui composizione nucleotidica non è nota e deve essere ricavata.

    Librerie e Adattatori nel Sequenziamento Illumina

    • Il primo passo del sequenziamento è la costruzione di una libreria di DNA o RNA.
    • Una libreria è un insieme di molecole di DNA o RNA per il sequenziamento.
    • Sono affiancate da adattatori.
    • Gli adattatori contengono sequenze necessarie per legare le sequenze alla piastra di sequenziamento e per le fasi di amplificazione.
    • Le sequenze composte da adattatori e da inserto di DNA costituiscono una read.
    • Gli adattatori vengono rimossi dalle read durante il sequenziamento ma non costituiscono molecole che devono essere sequenziate.
    • Le sequenze chiamate P5 (rossa) e P7 (verde) consentono il legame alla piattaforma Illumina.
    • Le sequenze chiamate Index consentono di associare correttamente le read ad ogni campione.
    • Le sequenze primer Rd1 SP e Rd2 SP servono da innesco per la PCR.

    Sequenziamento Single-End vs Paired-End

    • Single-end: i frammenti vengono sequenziati a partire da una sola estremità. Il risultato è un unico file di read.
    • Paired-end: i frammenti vengono sequenziati a partire da entrambe le estremità. Il risultato sono due file di read, uno per ogni filamento, definiti read forward e reverse.

    Formato dei File Fastq

    • Ogni file fastq per un campione è caratterizzato da quattro righe per ogni sequenza.
    • Riga 1: Header, inizia con @ e contiene informazioni sull'identificatore della sequenza.
    • Riga 2: Sequenza nucleotidica.
    • Riga 3: Simbolo '+' (con informazioni aggiuntive opzionali).
    • Riga 4: Phred Score, codificato in ASCII, indica la qualità di ogni sequenza.
    • Per ogni nucleotide è calcolata la probabilità di sequenziamento errato con il Phred Score(Q).
      • Q = -10 * log10(P)
      • P = 10^(-Q/10)

    Esercitazione 1: Comandi Bash per Analizzare un File Fastq

    • Comandi per la gestione dei file in una directory.
    • Uso del comando wc -l per contare il numero di righe di un file (anche .gz).
    • Uso di awk per estrarre informazioni da file di testo.
    • Espressioni regolari per gestire i file e i dati.
    • Esempio di codice bash per analizzare un file fastq e contare il numero di read.
    • Descrizione del parametro -k in gunzip.
    • Uso del comando gunzip -k per decomprimere i file .gz senza perdere il file originel.
    • Esempio di codice per analizzare tutti i file fastq presenti in una directory.
    • Spiegazione della tecnologia paired-end.

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    Description

    Questa lezione esplora la struttura delle read di sequenziamento Illumina e analizza la qualità dei dati. Imparerai il significato degli adattatori e degli inserti di DNA, nonché il processo di costruzione di una libreria per il sequenziamento. Analizziamo anche come i dati vengano organizzati in file per facilitarne l'analisi.

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