Lezione 2: Struttura delle Read Illumina

Lezione 2: Struttura delle Read Illumina

• Argomento principale: Struttura delle read di sequenziamento Illumina.
• Analisi della qualità dei dati di sequenziamento Illumina.
• Durante il sequenziamento di un campione, sono prodotte diverse migliaia di read.
• Queste read vengono inserite in un unico file per l'analisi dei dati.
• Il formato del file, la formattazione e la qualità del sequenziamento delle read dovranno essere analizzati.

Struttura delle Read

• Le read sono costituite da adattatori e inserti di DNA.
• Gli adattatori sono sequenze necessarie per il sequenziamento e per il legame alla piastra di sequenziamento.
• Gli inserti di DNA sono le sequenze la cui composizione nucleotidica non è nota e deve essere ricavata.

Librerie e Adattatori nel Sequenziamento Illumina

• Il primo passo del sequenziamento è la costruzione di una libreria di DNA o RNA.
• Una libreria è un insieme di molecole di DNA o RNA per il sequenziamento.
• Sono affiancate da adattatori.
• Gli adattatori contengono sequenze necessarie per legare le sequenze alla piastra di sequenziamento e per le fasi di amplificazione.
• Le sequenze composte da adattatori e da inserto di DNA costituiscono una read.
• Gli adattatori vengono rimossi dalle read durante il sequenziamento ma non costituiscono molecole che devono essere sequenziate.
• Le sequenze chiamate P5 (rossa) e P7 (verde) consentono il legame alla piattaforma Illumina.
• Le sequenze chiamate Index consentono di associare correttamente le read ad ogni campione.
• Le sequenze primer Rd1 SP e Rd2 SP servono da innesco per la PCR.

Sequenziamento Single-End vs Paired-End

• Single-end: i frammenti vengono sequenziati a partire da una sola estremità. Il risultato è un unico file di read.
• Paired-end: i frammenti vengono sequenziati a partire da entrambe le estremità. Il risultato sono due file di read, uno per ogni filamento, definiti read forward e reverse.

Formato dei File Fastq

• Ogni file fastq per un campione è caratterizzato da quattro righe per ogni sequenza.
• Riga 1: Header, inizia con @ e contiene informazioni sull'identificatore della sequenza.
• Riga 2: Sequenza nucleotidica.
• Riga 3: Simbolo '+' (con informazioni aggiuntive opzionali).
• Riga 4: Phred Score, codificato in ASCII, indica la qualità di ogni sequenza.
• Per ogni nucleotide è calcolata la probabilità di sequenziamento errato con il Phred Score(Q).
  • Q = -10 * log10(P)
  • P = 10^(-Q/10)

Esercitazione 1: Comandi Bash per Analizzare un File Fastq

• Comandi per la gestione dei file in una directory.
• Uso del comando wc -l per contare il numero di righe di un file (anche .gz).
• Uso di awk per estrarre informazioni da file di testo.
• Espressioni regolari per gestire i file e i dati.
• Esempio di codice bash per analizzare un file fastq e contare il numero di read.
• Descrizione del parametro -k in gunzip.
• Uso del comando gunzip -k per decomprimere i file .gz senza perdere il file originel.
• Esempio di codice per analizzare tutti i file fastq presenti in una directory.
• Spiegazione della tecnologia paired-end.

Questa lezione esplora la struttura delle read di sequenziamento Illumina e analizza la qualità dei dati. Imparerai il significato degli adattatori e degli inserti di DNA, nonché il processo di costruzione di una libreria per il sequenziamento. Analizziamo anche come i dati vengano organizzati in file per facilitarne l'analisi.