Lezione 2: Struttura delle Read Illumina
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Questions and Answers

Qual è la ragione principale per cui è necessaria la rimozione di un’adenina in più durante l'operazione di trimming?

  • L'adattatore non si lega correttamente al DNA
  • L'A-tailing ha causato l'aggiunta di un'adenina extra (correct)
  • La sequenza legata all'adattatore è più lunga del previsto
  • Errori di sequenziamento che generano una copia extra

Cosa accade all'intero adattatore durante il sequenziamento Illumina?

  • Viene modificato per migliorare la sequenza
  • Viene rimosso completamente dal sequenziatore (correct)
  • Viene allungato per adattarsi al DNA
  • Viene replicato insieme al DNA

Perché la sequenza legata all'adattatore per la read 2 potrebbe apparire diversa?

  • Perché l'adattatore subisce mutazioni frequenti
  • Per la presenza di variazioni nell'A-tailing (correct)
  • Perché utilizza una diversa strategia di legame
  • Perché è stata alterata dal sequenziamento

Qual è la funzione principale del trimming nel processo di sequenziamento?

<p>Eliminare parti non necessarie dell'adattatore (A)</p> Signup and view all the answers

Quale delle seguenti affermazioni è vera riguardo all'A-tailing?

<p>Consiste nell'aggiunta di adenine alla fine di una sequenza (D)</p> Signup and view all the answers

Qual è la funzione principale delle sequenze primer Rd1 SP e Rd2 SP nella PCR?

<p>Servono come inneschi per la reazione di PCR (C)</p> Signup and view all the answers

Cosa rappresentano gli indici nel processo di sequenziamento Illumina?

<p>Sequenze uniche per identificare campioni diversi (D)</p> Signup and view all the answers

Quale affermazione è vera riguardo alla presenza di Index1 e Index2 in un esperimento di sequenziamento?

<p>Index1 è sempre presente mentre Index2 potrebbe essere assente (A)</p> Signup and view all the answers

Quale delle seguenti caratteristiche è specifica per il kit TruSeq nel sequenziamento Illumina?

<p>La struttura dell'adattatore può variare in base alla coppia di index (D)</p> Signup and view all the answers

Per quale motivo si usano coppie di indici diversi per campioni diversi durante il sequenziamento?

<p>Per poter sequenziare più campioni contemporaneamente sulla stessa macchina (A)</p> Signup and view all the answers

Flashcards

Index1

Un indice sempre presente nella sequenza di librerie di sequenziamento Illumina.

Index2

Un indice opzionale nella sequenza di librerie di sequenziamento Illumina, usato per identificare diversi campioni.

Rd1 SP e Rd2 SP

Sequenze primer utilizzate per la PCR, necessarie per amplificare il DNA da sequenziare.

Adattatori di sequenziamento

Sequenze specifiche che permettono di legare il DNA da sequenziare ai flussi di lavoro di sequenziamento.

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Pool di sequenze

Un insieme di sequenze provenienti da diversi campioni, sequenziate contemporaneamente.

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Adenina in più da rimuovere

La sequenza da rimuovere (trimming) presenta un'adenina in più rispetto all'adattatore.

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A-tailing

Processo che causa l'aggiunta di un'adenina in più alla sequenza.

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Sequenza dell'adattatore

Porzione di DNA aggiunta alle estremità di un frammento di DNA per essere riconosciuto e sequenziato.

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Rimozione adattatore Illumina

L'intero adattatore viene rimosso durante il sequenziamento Illumina.

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Differenza sequenza read 2 adattatore

La sequenza legata all'adattatore della read 2 sembra diversa a causa di fattori non specificati nel testo.

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Study Notes

Lezione 2: Struttura delle Read Illumina

  • Argomento principale: Struttura delle read di sequenziamento Illumina.
  • Analisi della qualità dei dati di sequenziamento Illumina.
  • Durante il sequenziamento di un campione, sono prodotte diverse migliaia di read.
  • Queste read vengono inserite in un unico file per l'analisi dei dati.
  • Il formato del file, la formattazione e la qualità del sequenziamento delle read dovranno essere analizzati.

Struttura delle Read

  • Le read sono costituite da adattatori e inserti di DNA.
  • Gli adattatori sono sequenze necessarie per il sequenziamento e per il legame alla piastra di sequenziamento.
  • Gli inserti di DNA sono le sequenze la cui composizione nucleotidica non è nota e deve essere ricavata.

Librerie e Adattatori nel Sequenziamento Illumina

  • Il primo passo del sequenziamento è la costruzione di una libreria di DNA o RNA.
  • Una libreria è un insieme di molecole di DNA o RNA per il sequenziamento.
  • Sono affiancate da adattatori.
  • Gli adattatori contengono sequenze necessarie per legare le sequenze alla piastra di sequenziamento e per le fasi di amplificazione.
  • Le sequenze composte da adattatori e da inserto di DNA costituiscono una read.
  • Gli adattatori vengono rimossi dalle read durante il sequenziamento ma non costituiscono molecole che devono essere sequenziate.
  • Le sequenze chiamate P5 (rossa) e P7 (verde) consentono il legame alla piattaforma Illumina.
  • Le sequenze chiamate Index consentono di associare correttamente le read ad ogni campione.
  • Le sequenze primer Rd1 SP e Rd2 SP servono da innesco per la PCR.

Sequenziamento Single-End vs Paired-End

  • Single-end: i frammenti vengono sequenziati a partire da una sola estremità. Il risultato è un unico file di read.
  • Paired-end: i frammenti vengono sequenziati a partire da entrambe le estremità. Il risultato sono due file di read, uno per ogni filamento, definiti read forward e reverse.

Formato dei File Fastq

  • Ogni file fastq per un campione è caratterizzato da quattro righe per ogni sequenza.
  • Riga 1: Header, inizia con @ e contiene informazioni sull'identificatore della sequenza.
  • Riga 2: Sequenza nucleotidica.
  • Riga 3: Simbolo '+' (con informazioni aggiuntive opzionali).
  • Riga 4: Phred Score, codificato in ASCII, indica la qualità di ogni sequenza.
  • Per ogni nucleotide è calcolata la probabilità di sequenziamento errato con il Phred Score(Q).
    • Q = -10 * log10(P)
    • P = 10^(-Q/10)

Esercitazione 1: Comandi Bash per Analizzare un File Fastq

  • Comandi per la gestione dei file in una directory.
  • Uso del comando wc -l per contare il numero di righe di un file (anche .gz).
  • Uso di awk per estrarre informazioni da file di testo.
  • Espressioni regolari per gestire i file e i dati.
  • Esempio di codice bash per analizzare un file fastq e contare il numero di read.
  • Descrizione del parametro -k in gunzip.
  • Uso del comando gunzip -k per decomprimere i file .gz senza perdere il file originel.
  • Esempio di codice per analizzare tutti i file fastq presenti in una directory.
  • Spiegazione della tecnologia paired-end.

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Description

Questa lezione esplora la struttura delle read di sequenziamento Illumina e analizza la qualità dei dati. Imparerai il significato degli adattatori e degli inserti di DNA, nonché il processo di costruzione di una libreria per il sequenziamento. Analizziamo anche come i dati vengano organizzati in file per facilitarne l'analisi.

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