PCR

Unidad 7: Técnicas de PCR

• La unidad se centra en las diversas técnicas de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

• La PCR es una técnica in vitro para amplificar ADN, generando millones de copias idénticas a partir de una mínima cantidad de ADN original.
• Aunque inicialmente diseñada para amplificar un único fragmento corto de ADN, la técnica ha evolucionado para amplificar fragmentos grandes hasta 35 kb y cuenta con diversas variantes.
• Permite amplificar varios fragmentos distintos en una misma reacción (PCR múltiple).
• Permite amplificar fragmentos de ARN mediante RT-PCR.
• Se puede emplear para cuantificar la concentración de un ácido nucleico específico en una muestra con PCR cuantitativa o PCR en tiempo real.
• Las técnicas de PCR son rápidas y automatizadas para amplificación, superando a la clonación en vectores por tecnología de ADN recombinante.
• La PCR requiere menos cantidad de muestra en la detección en comparación con la hibridación, permitiendo la cuantificación precisa en tiempo real.
• Gracias a su alta sensibilidad y capacidad de amplificación rápida, la PCR es fundamental en laboratorios de biología molecular.
• Sus aplicaciones son innumerables en biología, medicina y paleontología.
• Se utiliza para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades.
• Se utiliza para estudiar la evolución y respuesta a tratamientos.
• Se aplica en estudios de expresión génica y mutagénesis.
• Fundamental en estudios filogenéticos y genotipado.
• También es clave en medicina forense.

Bases Teóricas de la PCR

• La PCR es un proceso enzimático impulsado por el ADN polimerasa, replicando el ADN.
• Kary Mullis concibió la técnica en 1983, repitiendo secuencialmente ciclos de replicación in vitro para obtener múltiples copias de ADN a partir de una sola molécula original.
• La amplificación se basa en la repetición de ciclos, donde las copias de ADN generadas sirven como moldes para las siguientes.
• La PCR requiere solucionar dos problemas:
  • Conseguir que solo se copie el fragmento deseado en cada ciclo. Esto se logra diseñando cebadores específicos.
  • Evitar la inactivación de la ADN polimerasa a altas temperaturas. Se soluciona utilizando ADN polimerasas termoestables.
• Los cebadores o primers son oligonucleótidos monocatenarios complementarios a las regiones que flanquean el fragmento a amplificar.
• Se diseñan por pares, complementarios a secuencias adyacentes en extremos y cadenas opuestas del fragmento de interés.
• El cebador que se une a la hebra molde con dirección 3'→5' se llama cebador F o forward.
• El cebador que se une a la hebra molde con dirección 5'→3' se llama cebador R o reverse.
• El sustrato ideal para la ADN polimerasa es una molécula de ADN monocatenario (molde) con una pequeña región de doble hélice.
• Los cebadores proporcionan esa pequeña región de doble hélice al unirse a sus secuencias complementarias en las hebras molde desnaturalizadas.
• Un juego de cebadores define y delimita la región diana que se va a amplificar. Fijando la especificidad de la reacción exclusiva.
• Para que la PCR tenga éxito, los cebadores deben tener una secuencia única en el ADN que se está estudiando.
• El diseño de cebadores requiere conocer la secuencia de bases de las regiones que flanquean el fragmento a amplificar.
• La longitud de los cebadores debe estar entre 18 y 30 bases.
• Un tamaño mínimo de 16 bases es necesario para la especificidad.
• Cebadores con menos de 15 bases carecen de especificidad y pueden dar lugar a productos amplificados no específicos.
• Cebadores con más de 30 bases pueden unirse peor al ADN molde y disminuir el rendimiento de la reacción.
• El contenido de G+C en los cebadores debe estar entre el 40% y el 60%.
• Los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra- e intermoleculares.
• La temperatura de fusión (Tm) de los cebadores idealmente debe estar entre 52-65ºC.
• La diferencia entre las Tm de los dos cebadores debe ser inferior a 5ºC.
• Para la síntesis de nuevas cadenas de ADN, es necesario que el ADN molde esté en forma monocatenaria.
• Cada ciclo de PCR debe comenzar con una fase de desnaturalización por calor.
• Esto inactivaba a las ADN polimerasas convencionales.
• En los primeros experimentos de PCR, había que añadir enzima nueva en cada ciclo, haciendo la técnica costosa y difícil de automatizar.
• El descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables impulsó el desarrollo de la PCR.
• Las ADN polimerasas termoestables se aíslan de arqueobacterias extremófilas y mantienen su actividad a temperaturas elevadas.
• Estas enzimas catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5'→3' en presencia de Mg2+.
• Realizan su actividad polimerasa óptimamente entre 70 ºC y 75 ºC.
• Mantienen su actividad polimerasa tras tiempos prolongados a 95 ºC.
• Las ADN polimerasas termoestables pueden clasificarse según sus capacidades enzimáticas secundarias.
  • Algunas tienen actividad exonucleasa 5'→3' pero carecen de actividad exonucleasa 3'→5', impidiendo corregir errores.
  • Otras tienen actividad exonucleasa 5'→3' y 3'→5', permitiendo la corrección de errores.
  • Algunas tienen actividad transcriptasa inversa y pueden sintetizar y amplificar ADNc a partir de ARN.
• La PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación.
• Cada ciclo consta de tres fases:
  • Desnaturalización del ADN molde.
  • Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
  • Extensión de los cebadores.
• La desnaturalización requiere una temperatura alta y duración suficiente, usualmente 94-95ºC durante 15-30 segundos.
• La hibridación de los cebadores (annealing) se realiza entre 50 y 65 ºC.
• El valor depende de la Tm de los cebadores, situándose en Tm ± 5ºC.
• Temperaturas más elevadas implican mayor especificidad, pero menor rendimiento.
• Temperaturas más bajas pueden incrementar el rendimiento, pero también la aparición de productos no deseados.
• El tiempo estándar de la fase de hibridación oscila entre los 30 y 60 segundos.
• La extensión o elongación de los cebadores se realiza a la temperatura óptima de la enzima, utilizando la ADN polimerasa.
• El tiempo de extensión depende de la velocidad de polimerización de la enzima y de la longitud del fragmento a amplificar.
• Para enzimas con actividad correctora se requieren tiempos más prolongados.
• Tras n repeticiones del ciclo, se obtienen diversos productos de amplificación, algunos deseados y otros no deseados.
• En cada ciclo, el número de productos no deseados aumenta aritméticamente (2n), mientras que el de amplicones aumenta exponencialmente (2n-2n).
• Aunque el rendimiento nunca es del 100%, la PCR genera millones de copias de la molécula molde.

PCR Estándar o Convencional

• Forma más simple de PCR, donde se amplifica un único fragmento de ADN con un único par de cebadores.
• El funcionamiento se basa en cuatro aspectos:
  • Composición de la mezcla de reacción.
  • Preparación de la mezcla.
  • Programación del termociclador.
  • Análisis de los productos amplificados.
• La mezcla de reacción debe tener los reactivos necesarios disueltos en un tampón adecuado.
• El tampón aporta el pH y la concentración salina óptimos.
• Los reactivos disueltos consisten en:
• Cloruro magnésico.
• Desoxinucleótidos trifosfato.
• Cebadores, ADN polimerasa.
• ADN molde.
• En ocasiones, se pueden añadir otros aditivos o potenciadores.
• Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg2+) como cofactor.
• Los iones se aportan en forma de cloruro magnésico (MgCl2). La ausencia o baja concentración de Mg2+ inactiva la ADN polimerasa.
• Elevadas concentraciones reducen la fidelidad.
• La mezcla debe incluir los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs). Los 4 dNTPs deben estar presentes en la misma concentración.
• Los cebadores son esenciales para lograr una amplificación específica y exitosa.
• La concentración final de cada cebador debe ser la misma y debe establecerse experimentalmente..
• La elección de la ADN polimerasa depende de la fidelidad requerida, la longitud del fragmento y la secuencia a amplificar.
• El ADN molde es esencial ya que contiene el fragmento de interés.
• Debe ser ADN purificado de alta calidad y en la cantidad adecuada.
  • Alto grado integridad, no degradado ni fragmentado.
  • Cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0.
  • Estar libre de contaminantes.
• La cantidad de ADN varía según el gen estudiado.
• Pequeñas cantidades afectan bajo rendimiento, las elevadas potencian productos no deseados.
• Los aditivos y potenciadores se utilizan para mejorar el rendimiento de la PCR.
• Ayudan a evitar la amplificación de productos no deseados.
• Son usados debido a contaminantes.
• La preparación de las muestras demanda ajustar el volumen de la reacción.
• Requiere elaborar la mezcla maestra (master mix) y preparar los controles adecuados positivos y negativos.
• Es muy valioso diseñar una PCR, se debe decidir el volumen final de la mezcla de reacción en el que se llevará a cabo la reacción.
• Normalmente este volumen es de 25 o 50 μl.
• Es necesario fijar este parámetro (como todos los componentes de la mezcla de reacción, incluido el tampón, se suministran concentrados).
• Se suministran, hay que calcular los volúmenes de cada reactivo que se añadirá a la mezcla.
• Esto dependerá de la concentración final que queramos obtener.
• La diferencia es entre la suma de los volúmenes de cada componente y el volumen final de la mezcla de reacción se completa con agua estéril de grado PCR.
• Para las reacciones se realizan en volúmenes muy pequeños. Los componentes suministrados son concentrados.
• Las cantidades se ven reducidas de cada uno de ellos son muy pequeñas (entre 0,5 y 5 μl).
• Ello incrementa la posibilidad de introducir errores de pipeteo elevada. Para evitar este problema se requiere que la mezcla de reacción sea homogénea.
• Para homogeneizar las pruebas que se realicen de manera simultánea, se prefiere preparar una única mezcla de reacciones que contenga la mezcla master o mix master.
• Deben ser incluidos todos los componentes a excepción del ADN MOLDE.
• La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una reacción por el número de nuestra.
• Se debe procesar + 1 Invitado. De esta manera se evita la falta de mezcla para para el tubo más nuevo. Se incluye el número control de las muestras positivas y negativas.
• Se realizan las muestras PROBLEMA un control positivo y un control NEGATIVO. Control POSITIVO: Es un tubo con master Mix al que se une al ADN Control MOLD.
• ADN se quiere amplificar por Volumen igual al agua.
• Así no se realiza una acción. Después se realiza la acción POR EL PCR de una muestra que va al TERMOCICLADOR.
• El termociclador permite programar ciclos repetitivos con temperaturas y tiempos de incubación.
• La programación típica incluye: desnaturalización, hibridación y extensión, seguido de una incubación final.
• En la etapa que inicia un Ciclo de Reacción por el PCR, se Consiste en calentar la mezcla a 94 y 95 grados, asegurando una completa realización de todas las moléculas de ADN.
• Las temperaturas de incubación de los cebadores disminuyen las reacciones.
• En los ciclo se repite el número de veces, va a disminuir su necesidad en inicializar, de las copias del fragmento y muestra.
• El periodo de los ciclos oscila durante tiempo considerable entre 25 y 40, por encima de 40 ciclos aumentan la probabilidad de que se vea inespecíficamente.
• Para programas de una manera más fácil el termociclador de ADN requiere una polimerasa durante 5 a10 minutos, asegurando que el producto va por doble hélice.

PCR Estándar o Convencional: Análisis de los Productos Amplificados

• Una vez terminada la PCR, las muestras del termociclador se analizadas para determinar la detección de productos amplificados.
• Analizados mediante electroforesis en gel de agarosa, junto con un marcador.
• La presencia de una única banda indica que el PCR ha funcionado, si hay bandas distintas indica otra presencia.

Modalidades de la PCR Estándar

• La PCR estándar es la usada para fines diagnósticos, menores de 3.5 kb. Para lo que se utiliza esta metodología descrita. Por lo que si disminuye la generación de productos no esperados se requiere amplificar fragmentos gran tamaño o con gran fidelidad para tener variables disponibles.
• Estas son utilizadas, un inicio con caliente o grande fragmento que sean de alta fidelidad.

Modalidades PCR Estándar: PCR con Inicio en Caliente

• Se pueden generar los productos en el periodo de su transporte de manera ascendente a la temperatura.
• La rampa se usa ya que puede estar relacionada con las de los cebadores y da inicio a las Hot Strat PCR
• La finalidad de la mezcla requiere las actividades de sus enzimas para evitar la temperatura.
• Se necesita la de reacción sin ADN Polimerasa o bien a temperatura de 65 grados es Engorosa pues aumenta el riesgo de alta contaminación.

Modalidades de PCR Estándar: PCR de Grandes Fragmentos

• El resultado de un PCR normalmente desciende cuando va por 5kb
• Hay fragmentos de el que permiten aumentar el rendimiento entre 5-35 kb
• Tiene una mezcla tiene el efecto en la composición de la reacción así como en la programación.
• Puede tener ADN polimerasa con alta concentración una menor que ayude a proteger.
• Tiene aditivos como el glycerol que ayuda ala estabilización del ADN así se minimiza la actividad.
• Dentro de las programación se aumenta el tiempo de extensión, acortando los tiempos de desnaturalización.

Modalidades de las PCR Estandar: PCR Alta Fidelidad

• Hay PCR que tiene condiciones de alta fidelidad y que sirve a las clonaciones y expresiones.
• Se realizan modificaciones a las reacciones. Las utilizan ADN polimerasa termoestable y el incremento es debido al PH ajustado y Concentración Magnética.

Otras Técnicas PCR

• Aparte de la PCR Estandar hay otras tecnicas con una gran Especificidad.
• Ejemplo es una PCR Anidada y Multiplex.

Otras Tecnicas PCR: PCR Anidada

• Es realizada con dos reacciones PCR acopladas de manera que se tiene un molde de productos Amplificados
• Tiene parejas de cebadores externos e internos que aumenta su sensibilidad se reduce en poca cantidad y no tienen errores.
• La especificidad no es la que se busca. Se evita la acumulación no deseada

Otras Técnicas PCR: PCR Con Transcripción Inversa

• Es utilizada para amplificar el ARN. Con unas AND polimerasas se utiliza un molde para PCR es necesario realizar un paso mediante retrotranscriptasa con dos soluciones.
• Son pasos que permiten la realización de un tubo independiente.

PCR a Tiempo Real

• La PCR en tiempo real monitoriza la amplificación mediante productos fluorescentes, detectando los amplicones ciclo a ciclo.
• Se mide la intensidad de la fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier momento de la PCR.
• Las ventajas de la PCR en tiempo real son:
  • La mayor rapidez es que la detección cualitativa de un segmento específico es más rápido
  • Resultados más fiables, las detecciones son más objetivas -Reduce contaminaciones
  • Es posible cuantificar lo producido en la muestra.

PCR a Tiempo Real: Aplicaciones

• Entre las aplicaciones más importantes se encuentra la detección de las mutaciones en curvas de fusión y PCR Cuantitativa.
• Por lo que es una tecnología que cuantifica la cantidad inicial de una molécula en la muestra, cuenta con cuantificación absoluta y relativa que expresan las concentraciones de secuencia.
• Es una importante aplicación para medir si alguien porta las mutaciones en su composición la cual detectada mediante curvas de fusión.