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Introduzione alle interazioni piante-patogeni

• Le interazioni tra piante e patogeni sono fondamentali per comprendere la salute delle piante e la loro risposta agli attacchi microbici.

Numeri relativi ai batteri sulle piante

• Su un centimetro quadrato di foglia si trovano tra 10⁶ e 10⁷ batteri.
• Gli organi fotosintetici delle piante ospitano circa 10²⁶ batteri sulla loro superficie totale stimata.
• Sulle radici, il numero di batteri per grammo di peso può raggiungere 10⁹.
• La biomassa di batteri nel suolo varia tra 300 e 3000 kg/ha-1, rappresentando il 28% della biomassa totale senza radici.
• I funghi hanno una biomassa che varia tra 500 e 5000 kg/ha-1, costituendo il 46% della biomassa totale nel suolo senza radici.

Visualizzazione di batteri

• I batteri Pseudomonas fluorescens sulla superficie delle radici possono essere visualizzati tramite microscopia a fluorescenza o microscopia elettronica a scansione.

Tipi di microorganismi e simbiosi

• I microorganismi possono essere autotrofi, saprotrofi, mutualisti o parassiti.
• Le relazioni di convivenza tra organismi di specie diverse sono spesso indicate come simbiosi.
• In sintesi, i partner in una simbiosi includono autotrofi, saprotrofi, mutualisti e parassiti.

Definizione e tipi di simbiosi

• Simbiosi significa letteralmente "vita insieme."
• Secondo de Bary, il termine simbiosi è neutro e utile per indicare associazioni stabili.
• Il termine simbiosi si usa di frequente per indicare interazioni con reciproco vantaggio.
• Secondo Angela Douglas, la simbiosi è un'interazione che permette l'acquisizione di nuove capacità metaboliche.
• I diversi tipi includono il mutualismo (+/+), il commensalismo (0/+), il parassitismo (-/+), competizione (-/-) e amensalismo (-/0).

Limiti della definizione di simbiosi

• La definizione descrive interazioni solo tra due partner.
• La definizione accetta che due organismi possano avere un'interazione senza effetti per uno o entrambi.
• Il segno dell'interazione tra due specie può modificarsi in funzione delle condizioni di contorno.
• Vi è un continuo tra mutualismo e parassitismo in alcune interazioni tra piante e microrganismi.
• Il segno di un'interazione può essere costante, a prescindere dalle condizioni di contorno, specie per i partner “obbligati”.

Parassiti e patogeni

• Sia i parassiti che i patogeni si nutrono a spese della pianta.
• I patogeni, oltre a sottrarre nutrienti, causano danni alla salute della pianta.
• I patogeni delle piante sono principalmente virus, batteri, oomiceti e funghi, con alcuni animali come i nematodi in grado di indurre stati patologici.
• I patogeni entrano nelle piante attraverso ferite, aperture naturali, mediante vettori o per penetrazione diretta.

Classificazione dei patogeni

• I patogeni differiscono per modalità di nutrizione e sono biotrofi, necrotrofi o emibiotrofi.
• Si distinguono per la specializzazione nei confronti della pianta ospite.
• Puccinia graminis e Plasmopara viticola sono patogeni biotrofici.
• Botrytis cinerea è un patogeno necrotrofico.
• Phytophthora infestans è un patogeno emibiotrofo.
• Rhizoctonia cerealis attacca il frumento in modo specialistico.
• Microsphaera quercina causa l'oidio (mal bianco) nel genere Quercus.
• Pythium ultimum attacca il tubero di patata (Solanum tuberosum).

Le difese delle piante

• Le piante possiedono difese che le proteggono dagli attacchi dei patogeni.
• Le difese si articolano in chimiche e strutturali, ciascuna può essere costitutiva o inducibile.
• Le difese hanno un costo energetico, ma il costo delle difese costitutive è implicito nel piano di sviluppo.
• Le difese inducibili possono impattare negativamente sulla crescita.

Difese chimiche costitutive

• Le difese costitutive di tipo chimico includono una varietà di molecole prodotte nel metabolismo secondario.
• Le piante diversificano i prodotti del metabolismo secondario con funzione difensiva a causa dell'assenza di un sistema immunitario "con memoria" e la competizione evolutiva tra ospiti e patogeni.
• I composti includono fenilpropanoidi, glucosinolati, glucosidi cianogenici, saponine, lattoni insaturi e proteine.

Dettagli sui fenilpropanoidi come difesa chimica

• I fenilpropanoidi sono costituiti da un anello aromatico con un gruppo -OH e una catena di tre atomi di carbonio.
• La via biosintetica parte dallo scikimato e porta alla sintesi di lignina, suberina e cutina, che si assemblano tramite polimerizzazione complessa.
• Questi composti sono localizzati a livello di parete con funzione protettiva e possono formare stilbeni, flavonoidi e tannini attraverso vie enzimatiche alternative.
• Stilbeni, flavonoidi, tannini e lignani possiedono attività antibiotica e antimicotica.
• A questo si aggiunge la capacità di essere degli ottimi antiossidanti a naturale difesa per la pianta.

Dettagli sui glucosinolati come difesa chimica

• I glucosinolati sono glucosidi contenenti un atomo di zolfo.
• Sono composti caratteristici delle Brassicales.
• Il danneggiamento della cellula mette i glucosinolati in contatto con l'enzima mirosinasi.
• Gli isotiocianati, rilasciati dall'idrolisi del legame glucosidico, agiscono come deterrenti contro gli erbivori.

Dettagli sui glucosidi cianogenici come difesa chimica

• I glucosidi cianogenici entrano in contatto con enzimi idrolitici in seguito al danneggiamento dei tessuti.
• A seguito entrano in contatto e liberando acido cianidrico (HCN).
• Si trovano localizzati nei semi.
• L'amigdalina presente nei semi di molte Rosaceae ne sono l'esempio più noto .

Dettagli sulle saponine come difesa chimica

• Le saponine sono glicosidi con una componente saccaridica.
• L'aglicone può essere un triterpene o uno sterolo.
• Il nome deriva da Saponaria officinalis, in passato utilizzata per lavare la lana.
• Le saponine interagiscono con le componenti steroliche delle membrane fungine, causando permeabilizzazione della membrana e morte dei funghi.
• L'avena è l'unica Poacea a produrre saponine, risultando più resistente agli attacchi fungini.

Dettagli sui lattoni insaturi come difesa chimica

• I lattoni insaturi sono esteri ciclici derivanti dalla condensazione di un gruppo alcolico e un acido carbossilico.
• Hanno attività antibatterica e antimicotica ed esercitare effetti antigerminativi e allelopatici nella competizione tra piante.

Dettagli sulle proteine come difesa chimica

• Alcune proteine interferiscono con lo sviluppo, la crescita o il processi infettivi di funghi, batteri, virus.
• Altre interferiscono con la capacità degli animali erbivori di digerire materiali di origine vegetale.
• Le proteine possono essere classificate come idrolasi, proteine capaci di legare, inibitori della crescita e proteine capaci di inattivare i ribosomi.

Difese inducibili nelle piante

• Le difese costitutive sono sempre presenti.
• Quando una pianta subisce un attacco da parte di un patogeno, attiva le difese inducibili.
• In sintesi, le risposte che attiva la pianta sono sia di tipo strutturale sia chimico.

Difese strutturali inducibili

• Le difese strutturali inducibili consistono nel rinforzo delle strutture di parete. Sono realizzate mediante ispessimento (deposizione di cellulosa e materiale di matrice oppure di callosio) e irrobustimento (produzione di cutina, suberina, lignina).
• Le zone rinforzate possono contenere molecole con funzione difensiva.

Difese chimiche inducibili

• Si attiva la sintesi di diverse molecole.
• Le due categorie principali sono le fitoalessine e le proteine di patogenesi (PR).

Dettagli sulle fitoalessine

• Le fitoalessine non appartengono ad un'unica famiglia chimica.
• Le fitoalessine sono molecole di basso peso molecolare che appartengono a diverse categorie chimiche.
• Le fitoalessine sono di norma assenti o a concentrazioni molto basse nelle piante sane.
• Vengono prodotte rapidamente, per sintesi de novo, in piante soggette a un attacco di patogeni.
• Esplicano la loro azione tramite inibizione della crescita microbica.

Precisioni sulle proteine di patogenesi

• Le proteine di patogenesi (PR) sono state identificate originariamente come differenzialmente espresse in piante di tabacco infettate dal virus del mosaico (TMV).
• Esse appartengono ad un ampio gruppo di proteine la cui espressione si osserva in diverse specie vegetali esposte a stress biotici o abiotici e sono accumunate dal fatto di far parte del sistema di difesa della pianta e di essere espresse in seguito ad induzione

Classificazione delle proteine di patogenesi

• Esistono 17 famiglie di proteine PR.
• Le proteine PR includono b-1,3-glucanasi (PR-2), chitinasi (PR-3, PR-4, PR-8), inibitori delle proteasi (PR-6), perossidasi (PR-6) e ribonucleasi (PR-10).
• Alcune proteine PR hanno attività antifungina generica (PR-1), mentre l'attività di altre non è nota in dettaglio (PR-17).

Riconoscimento dei patogeni

• Che le piante riconoscano i patogeni come tali è la condizione necessaria perché le risposte difensive possano esplicarsi.
• Il riconoscimento avviene tramite la percezione di strutture molecolari conservate e caratteristiche dei patogeni, definite microbe-associated molecular patterns (MAMPs).
• Esempi di MAMPs includono peptidoglicano, componenti dei flagelli, chitina e beta glucano.
• La presenza dei MAMPs è percepita dalla pianta mediante recettori sul plasmalemma chiamati pattern recognition receptors (PRRs).
• La stimolazione di questi recettori indica il superamento delle barriere passive.
• Il primo recettore di PAMP scoperto è stato LRR-RK FLS2 di Arabidopsis, che riconosce la flagellina batterica.
• Ulteriori molecole riconosciute da recettori di superficie includono il fattore di elongazione batterico (EF) e il peptidoglicano.
• Nel caso dei funghi, una delle molecole tipicamente riconosciute è la chitina.
• Il processo di riconoscimento della chitina differisce tra riso e Arabidopsis, pur presentando proteine ortologhe (CERK1).
• Il riconoscimento dei MAMPs da parte dei recettori PRR e l'attivazione delle risposte inducibili porta alla pattern triggered immunity (PTI).
• Oltre ai MAMPS anche frammenti di parete o oligomeri possono venire riconosciuti e si parla quaindi di DAMPs, damage-associated molecular patterns.
• MAMPs e DAMPs sono noti come elicitori, segnali riconosciuti dalle piante che permettono l'attivazione di una risposta difensiva e indice della presenza di un patogeno.

Obiettivi attuali della scienza sulle interazioni pianta-patogeno

• Sono allo studio metodi che utilizzano gli elicitori per stimolare le difese delle piante, riducendo la somministrazione di molecole tossiche.

Effettori e ETI

• La ETI, effector-triggered immunity è una contromisura che viene attivata a seguito dell'azione di molecole chiamate effettori che i microrganismi hanno sviluppato per superare la PTI con il rilascio di alcune molecole, dette effettori, che sopprimono le misure difensive della pianta.
• Gli effettori sono proteine o metaboliti secondari rilasciati nell'apoplasto o all'interno delle cellule vegetali.
• Esempi di effettori includono tossine, enzimi che degradano la parete cellulare, fattori di virulenza e proteine ricche di cisteina.
• Gli effettori possono agire inibendo l'attività di enzimi idrolitici, legando la chitina o bloccando le difese della pianta.
• Le piante che riconoscono la presenza degli effettori possono agire contrariamente alla risposta altrimenti inibita e dispiegare la linea difensiva indicata come ETI.
• I geni di resistenza codificano i recettori che individuano la presenza degli effettori.
• La maggior parte di questi recettori sono di tipo NB-LRR (nucleotide binding – leucine rich repeat).
• L'ETI è stata definita in passato "immunità gene-per-gene" basandosi sulla necessità del recettore per reagire alla presenza di un effettore, tale definizione è stata poi superata.

Risposte immunitarie nelle piante

• Sia la PTI che l'ETI inducono una serie di risposte immunitarie.
• Le risposte includono la chiusura degli stomi, la diminuzione del trasferimento di nutrienti, la generazione di ROS, il rilascio di ioni calcio.
• Le risposte includono la produzione di ormoni (jasmonato, etilene, acido salicilico), la sintesi di proteine correlate alla difesa e l'ispessimento delle pareti.
• Nei siti di infezione, in seguito ad ETI, si possono attivare processi di morte cellulare programmata (PCD), portando a una risposta ipersensibile (HR).

Articolazione della risposta immunitaria

• La risposta immunitaria delle piante è articolata su due linee.
• La PTI si basa sul riconoscimento di molecole generiche prodotte da microrganismi tramite recettori transmembrana.
• L'ETI risponde ai fattori di virulenza dei patogeni in modo specifico, mediante recettori intracellulari o di membrana.
• La differenza risiede nella maggior durata e intensità della risposta di difesa e i fenomeni della resistenza indotta, oltre che nella morte cellulare programmata.
• Integrazione dei segnali è probabilmente mediata da reti regolative di fattori di trascrizione.

Burst ossidativo

• Se è stata rilevatala presenza dei patogeni la cellula attiva in seguito alla percezione di un elicitore dal recettore, attivano i canali del calcio sul plasmalemma.
• Questa attivazione, in seguito, causa a sua volta un incremento di concentrazione del calcio nel citoplasma.
• Si possono osservare ulteriori fenomeni in contemporanea, e tra questi l'apertura di altri canali ionici, il che porta alla fuoriuscita degli ioni idrossido e potassio, e all'ingresso di di ioni di idrogeno.
• Il picco di concentrazione dello ione calcio innesca un percorso che porta alla formazione di specie reattive dell'ossigeno.

Fasi del burst ossidativo

• Il primo passo è la sintesi, tramite enzimi, dello ione superossido (02-).
• Lo ione superossido si trasforma tramite una dismutazione in un'altra ROS.
• Il prodotto di questa trasformazione è il perossido di idrogeno (H₂O₂).
• La dismutazione che trasforma lo ione superossido in perossido di idrogeno può avvenire in ambiente acquoso.
• La dismutazione suddetta anche può essere facilitata dall'ambiente acido delle pareti o dagli enzimi chiamati superossido dismutasi.

Reazione di Fenton:

• Lo ione superossido e di idrogeno in presenza di metalli di transizione (rame o ferro) reagiscono dando luogo alla formazione del radicale idrossile.
• Si tratta della specie reattiva dell'ossigeno più aggressiva.
• Il processo si svolge i due fasi distinte.

Effetti delle specie reattive dell'ossigeno

• I ROS sono molecole tossiche che possono attivare reazioni a catena di ossidoriduzione.
• I ROS portano alla formazione di vari intermedi estremamente reattivi.
• Gli eccessi delle specie chimiche vengono eliminati da meccanismi deputati nelle cellule vegetali come il perossido di idrogeno.

Dettaglio sulle azioni in presenza di agenti patogeni

• La produzione di ROS innescata dalla cellula come risposta alla presenza di patogeni è detta "burst ossidativo".
• I ROS agiscono in prima istanza a livello delle membrane, poi come segnale.

Ruolo di ioni e membrana nel burst ossidativo

• Tra le varie ROS prodotte dalla cellula a seguito dell'attacco, H2O2 ha un importante ruolo primario.
• H202 esplica questa funzione sia all'interno, sia al di fuori della cellula e nelle pareti intercellulari.
• Negli spazi intercellulari il perossido di idrogeno ha un'azione tossica diretta verso le cellule patogene attraverso l'ossidazione dei propri lipidi.
• Attraverso l'azione che avviene all'esterno delle cellule vegetali sotto attacco promuove l'irrobustimento delle pareti favorendo la formazione di legami tra alcune glicoproteine.
• La morte cellulare programmata e la risposta ipersensibile avvengono in fine, sempre attraverso il rilascio delle specie che abbiamo descritto, dopo che attraversano grazie alla variazioni di PH le membrane cellulari ed entrano all'interno.

Hypersensitive Response

• L'attivazione delle risposte inducibili avviene in una precisa serie di passaggi:
• Prima si riconosce un elicitore da ambo le parti(Damps e Mamps), in seguito si ha un burst ossidativo combinato con la lingnificazione delle pareti stesse
• La membrana cellulare si degrada perché perossidata e subisce questa azione che viene percepita dalle cellule circostanti
• Le cellule circostanti reagiscono e attraverso un "programmed cell death, PCD" avviene la "hypersensitive response, HR" .

Effetti della Hypersensitive Response

• Durante la Hypersensitive Response le cellule rilasciano composti chimici come fitoalexxine, composti fenolici e lignificano le pareti.
• Si ha il blocco del patogeno è l'acquisizione di resistenza (a livello locale o sistemico).
• A livello morfologico la HR porta alla comparsa di zone decolorate dove sono presenti le cellule che sono andate incontro all'attivazione del PCD.
• La velocità con cui avviene la HR è inversamente proporzionale all'estensione della zona interessata: maggiore sarà la velocità, minore sarà l'area interessata, più si allungherà la risposta, maggiore sarà l'area interessata.

Resistenza indotta

• In condizioni ottimali una pianta può sviluppare una sorta di immunità ai patogeni particolarmente virulenti
• Questo fenomeno si chiama induzione di resistenza è richiede l'attivazione preliminare dei sistemi di difesa attraverso un elicitore apposito.
• A seguito di tali interazioni la pianta "recluta" la sua energia favorendo il processo di difesa che porta ad un amento dei composti di risposta allo stresse del ritmo della respirazione.
• La resistenza può essere indotta a livello local, sistematico o dopo le interazioni con determinati batteri (rizosfera)

Resistenza indotta: SAR e LAR

• SAR e LAR sono entrambe innescate da un evento di morte cellulare (come la HR)
• Possono essere innescate o ad un organo specifico, una LAR in questo caso, oppure se estesa la resistenza innescherà una SAR.
• L'espressione di determinate proteine (PR) è segno affidabile dell'attivazione della SAR.
• La creazione e mantenimento delle PR deriva dall'utilizzo dell'acido salicico (SA) che favorisce anche il burst ossidativo, inibendo gli agenti che potrebbero degradare tale processo.

Resistenza sistemica indotta dall'utilizzo di elicitori

• La SAR può essere attivata usando elicitori esogeni che stimolino la risposta di difesa.
• A seguito di svariati esperimenti si è scoperto come i chitosani, derivati dalla chitina, apportano miglioramenti nell'attività delle risposte al stress favorendo anche la virosi.

Resistenza sistemica indotta (ISR)

• L'ISR è innescata dall'azione di batteri PGPB (promotori della crescita).
• tali batteri appartengono perlopiù a ceppi non patogeni come ilo "Pseudomonas fluorescens"
• Il mantenimento del'ISR avviene attraverso l'azione dell'acido di jasmonico e dell'etilene (sostanze di tipo ormonico)
• L'attività si manifesta in assenza di lesioni necrotiche differenti quindi dalla SAR/LAR.