Geni e Leggi di Mendel

Geni e Leggi di Mendel

• La genetica medica utilizza la biologia molecolare per studiare il DNA con metodi definiti e risoluzione elevata.
• Intorno agli anni '70 la conoscenza dei processi molecolari intracellulari era limitata.
• Il DNA è un acido nucleico con l'informazione genetica degli esseri viventi.
• Gli acidi nucleici sono polimeri di nucleotidi con uno zucchero pentoso legato a una base azotata in 1' e a uno o più gruppi fosfato in 5', uniti da legami fosfodiesterici.
• Il DNA si organizza in cromosomi, strutture di DNA, RNA e proteine istoniche.
• I cromosomi contengono geni, le unità di informazione genetica ereditaria, in posizioni precise dette loci.
• Gli alleli sono le forme alternative di un gene, che determinano la variazione dello stesso carattere.
• Gli organismi diploidi a riproduzione sessuale possiedono due alleli per gene, ereditati da entrambi i genitori.
• Il DNA nucleare, all'interno del nucleo, assume la forma di una doppia elica, scoperta nel 1953, con complementarietà tra le basi A-T e C-G.
• La complementarietà delle basi è utilizzata in tecniche di ingegneria genetica, biologia molecolare e genetica molecolare.
• L'uomo è diploide, con cellule somatiche con 46 cromosomi e gameti aploidi con 23 cromosomi.
• Il corredo cromosomico è misto, in parte materno e in parte paterno.
• I cromosomi sono formati da 22 coppie di autosomi e 1 coppia di cromosomi sessuali.
• Il genoma nucleare umano aploide è formato da circa 3 miliardi di coppie di basi.
• Il genoma diploide ne contiene circa 6 miliardi, ma solo una piccola parte è codificante.
• Il genoma umano ha circa 30.000 geni codificanti, tramite trascrizione e traduzione.
• Questi geni codificano oltre 100.000 proteine diverse (ogni gene codifica più proteine grazie alle isoforme).
• Non tutti i geni producono proteine, alcuni producono solo mRNA e altri originano da geni non funzionanti (pseudogeni).
• I singoli geni possono avere porzioni codificanti e non codificanti.
• Solo una piccola parte codifica per le proteine.
• Solo l'1% forma gli esoni (codificanti), il 24% forma gli introni (non codificanti), e il 75% il DNA intergenico (tra i geni).
• Il DNA intergenico ha funzioni in parte sconosciute.
• È importante per l'evoluzione di specie, con sequenze ripetute e regioni regolatorie.
• All'interno delle cellule si trova il DNA mitocondriale, in forma circolare, che costituisce il genoma mitocondriale.
• Alterazioni di geni autosomici o dei cromosomi sessuali provocano malattie genetiche.
• Queste alterazioni colpiscono il DNA nucleare o mitocondriale, quest'ultimo ereditato dalla madre per trasmissione matrilineare.

Dogma Centrale e Replicazione del DNA

• Il flusso di informazioni genetiche è unidirezionale: DNA → RNA → proteine.
• Solo i retrovirus possono retrotrascrivere DNA da RNA.
• La replicazione del DNA avviene tramite processi di trascrizione, traduzione e sintesi proteica.
• Il modello di duplicazione è semiconservativo: ogni DNA figlio ha un filamento parentale e uno sintetizzato ex novo.
• La trascrizione permette di trascrivere informazioni del DNA in mRNA complementare, che dopo maturazione è tradotto in aminoacidi per sintetizzare proteine.
• Le elicasi e topoisomerasi si legano al DNA in punti di origine di replicazione, formando forcelle di replicazione e rompendo i legami a idrogeno.
• Le single strand binding proteins si legano ai filamenti prodotti per evitare il riaccoppiamento.
• Le topoisomerasi tagliano e riposizionano i filamenti per evitare rotture.
• Un primer innesca la replicazione, con la DNA polimerasi che usa un filamento originale come stampo.
• Il primer viene poi degradato.
• La replicazione avviene in direzione 5' → 3' e lentamente al contrario.
• La crescita del secondo filamento è discontinua, con i frammenti di Okazaki che vengono legati dalla DNA ligasi.
• La trascrizione produce mRNA immaturo, modificato tramite splicing prima di essere tradotto.
• Lo splicing elimina gli introni o crea isoforme proteiche tramite splicing alternativo.
• Lo splicing avviene tra sequenze GT (donatore) e AG (accettore).
• Prima di uscire dal nucleo l'mRNA riceve una coda in 3' e un cap in 5' per protezione.
• Dopo l'uscita, l'mRNA matura va incontro a traduzione, processo che utilizza l'mRNA per sintetizzare amminoacidi e proteine grazie a ribosomi e tRNA, basandosi sul codice genetico.
• Il codice genetico è universale, non ambiguo e degenerato.
• I codoni di stop sono UAA, UAG e UGA, quello di inizio è AUG.
• La traduzione avviene nel citoplasma, con l'intervento del tRNA che presenta anticodoni complementari ai codoni.
• I ribosomi contengono 3 siti di legame per consentire la sintesi della catena aminoacidica.
• L'energia per la traduzione è fornita dall'idrolisi di ATP.
• Dopo la sintesi, le proteine possono subire modificazioni post-traduzionali come la glicosilazione o la fosforilazione.

RNA, Mutazioni e Polimorfismi

• L'RNA è un acido nucleico simile al DNA, ma contiene ribosio e uracile.
• L'RNA messaggero (mRNA) trasferisce informazioni genetiche dal nucleo al citoplasma.
• L'RNA transfer (tRNA) lega amminoacidi e mRNA, fungendo da adattatore.
• L'RNA ribosomiale (rRNA) è un componente strutturale dei ribosomi.
• Lo small nuclear RNA(smRNA) regola la quantità di RNA e ne degrada le porzioni in eccesso.
• Le sequenze geniche possono subire mutazioni e polimorfismi, con effetti positivi, neutri o negativi.
• Una mutazione è una variazione ereditaria, spontanea o indotta, ma non necessariamente dannosa.
• Un polimorfismo è una variazione genetica in almeno 1% della popolazione, spesso senza cambiamenti significativi.
• Il termine polimorfismo si riferisce a cambiamenti nella sequenza del DNA, come SNP (Single Nucleotide Polymorphisms), variazioni genetiche molto comuni che coinvolgono un singolo nucleotide.
• Molti SNP sono neutri, altri influenzano la regolazione genica o alterano la funzione proteica predispongono a malattie.

Cromatina, Cromosomi, Ciclo Cellulare

• Il DNA è spiralizzato in cromatina, contenente DNA, RNA e proteine istoniche, organizzata in nucleosomi.
• Ogni cellula somatica umana è diploide, con 23 coppie di cromosomi omologhi (46 totali).
• 22 di queste coppie sono autosomi, mentre una coppia è formata da cromosomi sessuali, dai quali dipende il sesso dell'individuo (XX femmina, XY maschio).
• Le cellule germinali (gameti) hanno invece 23 cromosomi (22 autosomi e 1 cromosoma sessuale, X o Y).
• I cromosomi possono essere rappresentati in un cariogramma.
• Alcuni polimorfismi riguardano un intero cromosoma.
• I polimorfismi cromosomici comportano espansione o riduzione di aree e provocano condizioni patologiche.
• I cromosomi presentano telomeri, elementi genetici essenziali per la corretta struttura che stabilizzano e proteggono.
• La DNA telomerasi mantiene invariata la lunghezza del DNA telomerico ed è presente nelle cellule trasformate o tumorali.
• Il ciclo cellulare è una serie ordinata di eventi che determinano crescita e divisione cellulare.
• L'interfase comprende le fasi G1 (sintesi di RNA e proteine), S (sintesi e duplicazione del DNA), G2 (sintesi di elementi necessari alla mitosi). Esiste anche la fase G0 (quiescenza).
• La mitosi comprende profase, metafase, anafase, telofase, citochinesi, e genera 2 cellule figlie identiche.
• La meiosi prevede 2 divisioni cellulari che generano 4 cellule aploidi (gameti) diversi dalla madre.
• I gameti vengono prodotti tramite gametogenesi, diversa in uomo e donna.
• Le ovaie producono ovociti primari (2n), che formano ovociti secondari (n) con l'eliminazione di un globulo polare.
• Gli ovociti secondari maturano in cellule uovo mature (n).
• L'ovogenesi spiega la maggiore probabilità di anomalie cromosomiche in gameti di donne in età avanzata.
• I testicoli producono spermatogoni, differenziandosi in spermatociti primari (2n), secondari (n) e spermatozoi maturi (n).
• Ogni spermatocita primario genera 4 spermatozoi maturi.
• Il crossing over avviene durante la fase pachitene della profase della meiosi I.
• Permette di rimaneggiare il DNA e generare diversità genetica dei gameti.

Leggi di Mendel, Manipolazione del DNA, Sonde Molecolari

• I geni sono unità di informazione genetica che determinano i caratteri.
• Il genoma è tutto il DNA.
• Gli alleli sono forme alternative di un gene.
• Il genotipo è la combinazione di alleli di un individuo.
• Il fenotipo è il carattere che manifesta un individuo.
• L'omozigote ha due alleli uguali; l'eterozigote ha due alleli diversi.
• Il carattere dominante si manifesta anche se eterozigote; quello recessivo solo se omozigote.
• La prima legge di Mendel (dominanza) afferma che incrociando due linee pure con un solo carattere diverso, la generazione F₁ sarà uguale e presenterà il carattere dominante.
• La legge di segregazione afferma che ogni individuo possiede due alleli per gene, che si assortiscono indipendentemente.
• Mendel dimostrò che l'ereditarietà è particolata (i determinanti ereditari sono di natura particolata).
• Le scoperte di mendel sono state, I determinanti ereditari sono di natura particolata; I geni sono presenti a coppie di alleli ed ogni espressione di un carattere è determinata da essi; I membri di ciascuna coppia genica (alleli) si separano con uguale frequenza nei gameti; Ogni gamete porta un solo allele; I gameti si combinano a formare lo zigote indipendentemente dagli alleli che contengono.
• La genetica medica studia la trasmissione e patogenesi di malattie causate da variazioni e mutazioni a livello genetico.
• La genetica medica e quella molecolare si basano sulle tecniche diagnostiche delle biotecnologie per identificare le mutazioni.
• Le tecnologie di diagnosi genetica possono essere analisi a bassa o alta risoluzione.
• Le sonde o probes molecolari sono reagenti che identificano specifiche sequenze nucleotidiche di DNA o RNA sfruttando la complementarietà delle basi.
• Le sonde si legano a sequenze bersaglio a loro complementari, permettendo la rilevazione del materiale genetico.
• Le sonde sono specifiche e marcate con radioisotopi, fluorocromi o enzimi.
• Esistono sonde cDNA, oligonucleotidiche e RNA.
• Con tante sonde marcate in modo diverso si può effettuare l'analisi cariotipica spettrale.
• L'immagine a lato si ottiene con un'ibridazione in situ fluorescente detta FISH.
• La FISH è una tecnica di ibridazione che permette, dopo fissazione su vetrino dei cromosomi in metafase e dei nuclei in interfase, di identificare sequenze specifiche negli acidi nucleici grazie a sonde marcate con fluorocromi che emettono luce a diverse lunghezze d'onda.
• In altri casi possono essere usate sonde diverse per sequenze che si trovano sullo stesso cromosoma.
• Questa tecnica è usata per controllare la presenza di delezioni cromosomiche.
• Le sonde permettono di riconoscere i cromosomi anche in periodi come l'interfase, durante la quale i cromosomi non sono compattati al massimo (come durante la metafase mitotica).
• Le endonucleasi di restrizione sono enzimi prodotti naturalmente da alcuni batteri come meccanismo di difesa contro i virus.
• Questi enzimi riconoscono sequenze specifiche di DNA e le tagliano ed hanno un’azione selettiva.
• Le sequenze tagliate dalle endonucleasi sono solitamente corte e palindrome.
• Le endonucleasi prendono il nome dai batteri da cui vengono ricavate (es. EcoRI - Escherichia Coli).
• II taglio produce estremità coesive o sticky ends (tagli sfalsati) o estremità piatte o blunt ends (tagli netti).
• La mutazione di una singola base può impedire il taglio specifico, quindi le endonucleasi venivano utilizzate per il riconoscimento di mutazioni in siti precisi.
• Applicazioni delle endonucleasi: clonaggio genico (taglio di DNA da inserire in vettori plasmidici) e mappatura del DNA (identificando i siti di restrizione).

Southern Blotting, Polimorfismi e PCR

• Il Southern blotting è una tecnica di biologia molecolare per rilevare una specifica sequenza di DNA in un campione complesso.
• Il southern blotting consente di identificare e localizzare uno specifico frammento di DNA all'interno di una miscela sfruttando una sonda complementare marcata.
• Questa tecnica viene applicata per la diagnosi genetica, tipizzazione di geni, rilevazione di sequenze specifiche, clonaggio genico.
• Il Southern blotting è costituito da: preparazione del DNA, separazione elettroforetica, denaturazione del DNA, trasferimento su membrana, ibridazione con la sonda, rilevazione del segnale.
• La tecnica ha dei limiti: tecnica laboriosa e relativamente lunga che richiede quantità significative di DNA e marcature speciali.
• II Southern blotting può essere utilizzato per diagnosticare la sindrome da androgeno resistenza, dimostrando che la patologia è X-linked recessiva (mutazione causata da delezione sul cromosoma X).
• Gli RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) sono polimorfismi utilizzati per analizzare il DNA e si manifestano come differenze nella lunghezza dei frammenti osservati e questa a sua volta si usa per analizzare il legame genetico.

Polimorfismi, DNA Fingerprinting, Bloting

• Gli STR sono sequenze più corte che gli VNTR.
• Le sonde possono riconoscere sequenze ripetute come i minisatelliti o VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) o i microsatelliti o STR (Short Tandem Repeats).
• I minisatelliti VNTR sono sequenze di DNA tandem lunghe più di 12 basi, ereditati in maniera mendeliana, quindi ottimi marcatori per l'analisi genetica.
• I microsatelliti STR sono sequenze di DNA tandem lunghe da 2 a 4 basi, che si trasmettono alle generazioni successive secondo le regole mendeliane.
• Gli polimorfismi elencati sono analizzati con tecniche di Southern blot o PCR.
• II test del DNA fingerprint ha un'ampia applicazione nella ricerca di paternità e funziona analizzando bande ottenute grazie al Southern blotting.

Bloting e PCR

• La tecnica del Northern blotting è come il Southen bloting solo che applicata all'RNA, e serve per determinare la lunghezza. o la quantita di mRNA. Può anche essere utilizzata per verificare se un gene è sovra o sotto espresso nelle cellule tumorali.

• La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica di biologia molecolare che consente di amplificare sequenze di DNA in vitro, generando moltissime copie o cloni.

• Per fare questo sono necessarie una polimerasi termostabile, uno stampo di DNA, due primer, deossinucleotidi, e acqua.

• La PCR avviene in cicli ripetuti, e di preciso 25-35 cicli, in cui si ripetono tra fasi principali, con il processo di denaturazione ad alta temperatura.

Utilità della PCR

• Per effettuare la PCR sono sufficienti piccole quantità di DNA, anche degradato.
• La PCR è riproducibile, specifica, sensibile, rapida e di costi contenuti.
• Tuttavia, la PCR è utilizzabile solo se si conosce la sequenza fiancheggiante il frammento target (quella complementare ai primer).
• Applicazioni della PCR: genotipizzazione, analisi di espressione, clonaggio, diagnosi molecolare
• PCR e RFLP per l'analisi dell'anemia falciforme.

Sequenziamento del DNA

• In genetica forense, la PCR viene utilizzata per amplificare il DNA estratto dai reperti sulla scena del crimine. Questo DNA viene poi analizzato con sonde multi-locus con molti alleli (microsatelliti o minisatelliti).

• La polimerizzazione dei nucleotidi avviene mediante legame del gruppo fosfato del monomero successivo in posizione 3', indipendentemente se l'acido nucleico è DNA ο RNA.

• Il DNA (zucchero desossiribosio) lega, in 2' un atomo di idrogeno H, mentre I'RNA (zucchero ribosio) lega, in 2', un gruppo ossidrile -OH.

• Il metodo si basa sulla sintesi controllata di un nuovo filamento di DNA a partire da un modello.

• Durante la sintesi vengono utilizzati dideossinucleotidi (ddNTP), che, quando incorporati dalla polimerasi, interrompono la crescita del filamento, consentendo di ottenere frammenti di lunghezza variabile che riflettono la sequenza del DNA.

Progetto genoma umano, Mutazioni genetiche, Citogenetica

• Il Progetto genoma umano o HGP (Human Genome Project) è un progetto il cui obiettivo è stato mappare, sequenziare e studiare tutto il genoma umano, ovvero tutto il DNA presente in una cellula (circa 3 miliardi di paia di basi).

Questo progetto ha permesso di:

• Costruire una mappa dei mappatori genetici (polimorfismi)

• Individuare la localizzazione dei vari geni sui cromosomi e la loro funzione

• Sequenziare l'intero genoma aploide (circa 25mila geni)

• Le mutazioni genetiche sono variazioni nella sequenza nucleotidica del DNA che possono causare malattie o cambiamenti funzionali di determinate proteine. Sono fattori evolutivi.

• Durante la replicazione del DNA spesso possono insorgere mutazioni causate da errori della DNA polimerasi o di altri enzimi. All'interno di ogni cellula ci sono sistemi di riparazione che correggono gli errori insorti per evitare la comparsa di vere e proprie mutazioni.-La citogenetica studia i cromosomi e le loro anomalie numeriche (poliploidie e aneuploidie).

• La citogenetica classica permette di identificare riarrangiamenti cromosomici coinvolgenti non meno di 5 Mb, la citogenetica molecolare permette analisi più mirate e consente di identificare riarrangiamenti di alcune centinaia di chilobasi.

Tecniche di studio dei cromosomi

• Le tecniche di citogenetica permettono lo studio dei cromosomi e delle loro anomalie. Si usano colture cellulari, colchicina, colorazioni per bandeggi e soluzioni ipotoniche.
• La ricostruzione del corredo cromosomico è il cariotipo, in cui le 22 paia di autosomi sono ordinate per lunghezza e i sessuali sono in basso.
• I cromosomi sono cromatina con cromatidi fratelli legati al centromero, con braccio corto (p) e lungo (q).
• Il DNA è eterocromatina vicino al centromero e ai telomeri, eucromatina tra centromero e telomeri.
• I cromosomi sono classificati come metacentrici, submetacentrici o acrocentrici in base alla posizione del centromero.
• Il bandeggio cromosomico permette di identificare i cromosomi e le anomalie strutturali. Ci sono bandeggio Q, G, R e C.

Classificazioni anomalie cromosomiche

• Le anomalie cromosomiche sono riguardanti i cromosomi autosomici o sessuali.
• Possono essere bilanciate o sbilanciate.
• Un esempio di anomalia bilanciata è la fusione di due cromosomi a formare un unico cromosoma più lungo ma con tutto il materiale genetico necessario a una vita sana. Questo esempio non sempre ha conseguenze neutre, può provocare patologie come la sindrome di Down o trisomia 21. Sono stati anche analizzati tipi di anomalie cromosomiche:
• traslocazioni cromosomiche
• anomalie costituzionali e somatiche
• mosaici e chimere
• anomalie di numero e struttura
• anticipazione
• imprinting
• aneuploidia e traslocazioni robertsoniane

Studio delle anomalie

• Una traslocazione sbilanciata può causare sindrome di Down quando coinvolge il cromosoma 21 o altre aneuploidie se coinvolge altri cromosomi.

• Le traslocazioni robertsoniane possono essere identificate analizzando il cariotipo o con altre tecniche citogenetiche come la FISH.

• Durante la traslocazione, i bracci lunghi di due cromosomi acrocentrici si fondono a livello del centromero, creando un cromosoma "derivativo" unico. I bracci corti sono persi, ma la perdita non causa problemi perché contengono per lo più sequenze ridondanti di RNA ribosomiale.

• La non disgiunzione cromosomica è un errore che si verifica durante la divisione cellulare (mitosi o meiosi), per cui i cromosomi omologhi o i cromatidi fratelli non si separano correttamente e migrano tutti allo stesso polo del fuso mitotico

• I fattori che influenzano la non disgiunzione non sono ben conosciuti, sappiamo però che essa può essere causata da errori nel fuso ed è influenzata dall'età materna avanzata, che aumenta il rischio di trisomie autosomiche

• Trisomia 21 o sindrome di down Si presenta in circa 1 nato vivo su 800.

• Anomalie cromosomiche delle cellule germinali Le anomalie delle cellule germinali (spermatozoi o cellule uovo) originano solitamente per insorgenza di nuova mutazione durante la gametogenesi di soggetti sani.

###Malattie, diagnosi e malformazioni-

• Le malattie mendeliane sono patologie genetiche dovute alla mutazione di un singolo gene che seguono la modalità di ereditarietà mendeliana.

• La maggior parte delle malattie mendeliane si sviluppa in età pediatrica, tuttavia maggiore è la gravità della mutazione, più precoce sarà l'insorgenza della malattia.

• L'ipercolesterolemia familiare è a trasmissione verticale indipendente dal sesso. La terapia avviene, oltre che con un controllo della dieta, con beta bloccanti, resina o statine.

• Sindrome di Marfan (incidenza = 1 su 5.000-10.000) Malattia autosomica dominante con effetto pleiotropico (tante conseguenze, soprattutto riguardanti il tessuto connettivo). Ha un effetto dominante negativo (fibrillina mutata) che influisce su ossa, legamenti, occhi, cuore, vasi…

###Ereditarietà, studi genealogici

• Essendo una malattia autosomica recessiva, la fenilchetonuria si trasmette verticalmente indipendentemente dal sesso, solo all'interno di una fratria e solitamente non nella generazione successiva.La penetranza genetica descrive la probabilità con cui un determinato genotipo si manifesta fenotipicamente in un individuo, cioè indica la frequenza con cui un gene o una mutazione genetica causa l'espressione di un tratto specifico o di una malattia in individui con quel genotipo.

• Studi genealogici: L'analisi di linkage model free viene utilizzata per studiare l'eredità complessa dei caratteri qualitativi.

###Epigenetica e Tumori

• L'epigenetica è una branca della genetica classica che studia tutto ciò che è in grado di modificare l'espressione genica mediante metilazione del DNA o tramite altri fattori.

• I tumori sono causati dall'insorgenza di mutazioni che creano varianti cellulari in grado di proliferare più velocemente e con un vantaggio selettivo. I tumori possono essere benigni o maligni (cancri). Il cancro, ovvero il tumore maligno, è sempre genetico (dovuto ad alterazioni dei geni) e talvolta è ereditario (5-10% dei tumori hanno aggregazione familiare).

• L'influenza genetica e l'influenza ambientale sui tumori sono generalmente in equilibrio tra loro. See la componente genetica è molto forte, solitamente l'influenza ambientale è minore.

La genetica medica studia il DNA a livello molecolare. Il DNA, acido nucleico, contiene l'informazione genetica. I cromosomi contengono i geni, unità di informazione ereditaria, con alleli che ne determinano la variazione.