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Questions and Answers
¿Cuál es el nombre del método de electroforesis que utiliza un gel de poliacrilamida como soporte y SDS para desnaturalizar la proteína?
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¿Qué es lo que se utiliza para desnaturalizar la proteína en el método de electroforesis SDS-PAGE?
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¿Cuál es el objetivo principal de la electroforesis de proteínas SDS-PAGE?
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¿Qué es lo que se utiliza para detectar las proteínas totales después de la electroforesis?
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¿Qué es el resultado de la separación de macromoléculas en un campo eléctrico?
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¿Cuál es el nombre del investigador que formuló originalmente el método de electroforesis SDS-PAGE?
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¿Qué es lo que se utiliza para preparar la muestra de proteínas totales del citoplasma?
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¿Cuál es el resultado de la formación del gel de poliacrilamida?
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¿Cuál es la distancia adecuada para trazar una línea en el cristal largo?
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¿Qué debe hacerse con la peinilla después de trazar la línea?
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¿Cuál es el propósito del Sample loading guide (Bio Rad)?
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¿Cuánto electrodo buffer se agrega al depósito interior de la cámara de electroforesis?
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¿Cuál es el pH del Tris-Cl-glycine-SDS Buffer?
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¿Cuántas muestras se pueden preparar mientras se polimeriza el stacking gel?
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¿Cuál es el propósito de rotular los microtubos?
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¿Cuánta cantidad de proteínas totales se utilizarán en este laboratorio?
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¿Cuál es el papel del TEMED en el proceso de polimerización?
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¿Cuál es el resultado de la reacción entre el TEMED y el persulfato de amonio?
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¿Por qué el oxígeno interfiere con la polimerización del gel?
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¿Cómo se evita que el oxígeno afecte el proceso de polimerización?
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¿Qué determina el tamaño de los poros en el gel?
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¿Cuál es la concentración de proteínas totales en la muestra del citoplasma?
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¿Cuál es el propósito de la bisacrilamida en la formación del gel?
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¿Por qué se utiliza un porcentaje específico de acrilamida en la preparación del gel?
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¿Cuál es la cantidad de microgramos que se utilizará en el experimento?
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¿Cuál es el volumen total a preparar para el marcador?
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¿Qué ocurre cuando se aumenta la concentración de acrilamida?
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¿Cuál es el orden correcto para añadir los componentes?
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¿Cuál es la temperatura necesaria para desnaturalizar las proteínas?
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¿Cuál es la dilución del marcador?
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¿Qué se utiliza para evitar la evaporación de la muestra?
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¿Qué se debe evitar después de calentar la muestra?
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¿Cuánto volumen de agua ultrapura se necesita para una muestra de 0.5 µl?
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¿Qué proteína del marcador Broad Range tiene un peso molecular de 66 kDa?
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¿Cuántos µl de marcador Broad Range se necesitan para la electroforesis?
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¿Cuál es la velocidad de centrifugación necesaria para preparar la muestra?
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¿Cuánto tiempo se necesita para centrifugar la muestra?
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¿Qué se utiliza para ajustar el voltaje en la electroforesis?
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¿Cuál es el voltaje adecuado para la electroforesis?
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¿Qué se utiliza para conectar los electrodos en la electroforesis?
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¿Cuál es el nombre de la proteína que se busca detectar en la electroforesis?
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¿Cuántos µl de muestra se necesitan para la electroforesis?
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Study Notes
La Polimerización de la Poliacrilamida
- La bisacrilamida introduce enlaces cruzados entre las cadenas de poliacrilamida.
- El TEMED y el persulfato de amonio ayudan en el proceso de polimerización.
- El TEMED cataliza la descomposición del persulfato de amonio para formar los radicales (SO4-) que activan el monómero de acrilamida.
El Proceso de Polimerización
- El monómero activado activa otro monómero inactivo para formar una cadena alargada.
- Durante el crecimiento de la cadena, la bisacrilamida entrecruza los monómeros de acrilamida resultando en la formación de un polímero en forma de red, con una porosidad característica.
- El oxígeno atrapa los radicales libres SO4-, por lo que interfiere con la polimerización del gel.
Preparación del Gel
- El tamaño del poro del gel depende de la concentración de acrilamida.
- Mientras mayor es el porcentaje de acrilamida, menor es el tamaño del poro del gel.
- El porcentaje del gel que se prepare dependerá de la proteína o muestra que desee caracterizar.
Electroforesis de Proteínas
- La electroforesis de proteínas se utiliza para identificar una proteína específica o de interés basado en tamaño o peso molecular.
- La electroforesis (SDS-PAGE) se utiliza para monitorear el proceso de lisis y recuperación, monitorear el proceso de purificación de una proteína, y detectar modificaciones post-traduccionales.
- El método más utilizado para separar proteínas por electroforesis en gel fue formulado originalmente por Laemmli (1971).
Preparación de las Muestras
- La muestra de proteínas totales se prepara mezclando agua ultrapura, muestra y Laemmli buffer (sample buffer) 5X.
- La cantidad de proteínas totales que se estará utilizando es de 5 o 7 µg.
- La muestra se calienta durante 5 minutos en el “Heat block” a 95°C para desnaturalizar las proteínas.
Corrida de la Electroforesis
- La electroforesis se realiza a un voltaje de 90 voltios hasta que alcance el nivel del gel de separación.
- El profesor decidirá la cantidad de microgramos (µg) a utilizar dependiendo de las concentraciones obtenidas de proteínas totales en el experimento de BCA.
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Prueba tus conocimientos sobre la electroforesis de proteínas SDS-PAGE, incluyendo los principios básicos, cálculos de muestras y detección de proteínas. Evalúa tus habilidades en el laboratorio de biología celular y molecular.
