42 Questions
¿Cuál es el nombre del método de electroforesis que utiliza un gel de poliacrilamida como soporte y SDS para desnaturalizar la proteína?
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
¿Qué es lo que se utiliza para desnaturalizar la proteína en el método de electroforesis SDS-PAGE?
Sodium Dodecyl Sulfate
¿Cuál es el objetivo principal de la electroforesis de proteínas SDS-PAGE?
Identificar una proteína específica o de interés basado en tamaño o peso molecular
¿Qué es lo que se utiliza para detectar las proteínas totales después de la electroforesis?
Coomassie Blue
¿Qué es el resultado de la separación de macromoléculas en un campo eléctrico?
Electroforesis
¿Cuál es el nombre del investigador que formuló originalmente el método de electroforesis SDS-PAGE?
Laemmli
¿Qué es lo que se utiliza para preparar la muestra de proteínas totales del citoplasma?
Microlitros de proteínas
¿Cuál es el resultado de la formación del gel de poliacrilamida?
Polímeros lineales
¿Cuál es la distancia adecuada para trazar una línea en el cristal largo?
0.5 cm
¿Qué debe hacerse con la peinilla después de trazar la línea?
Dejarla hasta que se llene con amortiguador
¿Cuál es el propósito del Sample loading guide (Bio Rad)?
Ayudar a cargar la muestra en la fosa
¿Cuánto electrodo buffer se agrega al depósito interior de la cámara de electroforesis?
140 mL
¿Cuál es el pH del Tris-Cl-glycine-SDS Buffer?
8.3
¿Cuántas muestras se pueden preparar mientras se polimeriza el stacking gel?
Varias
¿Cuál es el propósito de rotular los microtubos?
Identificar la muestra
¿Cuánta cantidad de proteínas totales se utilizarán en este laboratorio?
7 µg
¿Cuál es el papel del TEMED en el proceso de polimerización?
Catalizar la descomposición del persulfato de amonio para formar radicales
¿Cuál es el resultado de la reacción entre el TEMED y el persulfato de amonio?
La formación de radicales libres SO4-
¿Por qué el oxígeno interfiere con la polimerización del gel?
Atrapando los radicales libres SO4-
¿Cómo se evita que el oxígeno afecte el proceso de polimerización?
Añadiendo etanol al 95% al gel
¿Qué determina el tamaño de los poros en el gel?
La concentración de acrilamida
¿Cuál es la concentración de proteínas totales en la muestra del citoplasma?
1844 µg/mL
¿Cuál es el propósito de la bisacrilamida en la formación del gel?
Formar enlaces cruzados entre las cadenas de poliacrilamida
¿Por qué se utiliza un porcentaje específico de acrilamida en la preparación del gel?
Para influir en la porosidad del gel
¿Cuál es la cantidad de microgramos que se utilizará en el experimento?
1 µg
¿Cuál es el volumen total a preparar para el marcador?
100 µL
¿Qué ocurre cuando se aumenta la concentración de acrilamida?
El tamaño de los poros del gel disminuye
¿Cuál es el orden correcto para añadir los componentes?
Agua ultrapura, muestra, Laemmli buffer
¿Cuál es la temperatura necesaria para desnaturalizar las proteínas?
95°C
¿Cuál es la dilución del marcador?
1:20
¿Qué se utiliza para evitar la evaporación de la muestra?
Un lid lock
¿Qué se debe evitar después de calentar la muestra?
Colocarla en hielo
¿Cuánto volumen de agua ultrapura se necesita para una muestra de 0.5 µl?
15.5 µl
¿Qué proteína del marcador Broad Range tiene un peso molecular de 66 kDa?
Albúmina de bovino (BSA)
¿Cuántos µl de marcador Broad Range se necesitan para la electroforesis?
5 µl
¿Cuál es la velocidad de centrifugación necesaria para preparar la muestra?
4,000 rpm
¿Cuánto tiempo se necesita para centrifugar la muestra?
30 segundos
¿Qué se utiliza para ajustar el voltaje en la electroforesis?
Un power supply
¿Cuál es el voltaje adecuado para la electroforesis?
90 voltios
¿Qué se utiliza para conectar los electrodos en la electroforesis?
Una cubierta
¿Cuál es el nombre de la proteína que se busca detectar en la electroforesis?
GAPDH
¿Cuántos µl de muestra se necesitan para la electroforesis?
10 µl
Study Notes
La Polimerización de la Poliacrilamida
- La bisacrilamida introduce enlaces cruzados entre las cadenas de poliacrilamida.
- El TEMED y el persulfato de amonio ayudan en el proceso de polimerización.
- El TEMED cataliza la descomposición del persulfato de amonio para formar los radicales (SO4-) que activan el monómero de acrilamida.
El Proceso de Polimerización
- El monómero activado activa otro monómero inactivo para formar una cadena alargada.
- Durante el crecimiento de la cadena, la bisacrilamida entrecruza los monómeros de acrilamida resultando en la formación de un polímero en forma de red, con una porosidad característica.
- El oxígeno atrapa los radicales libres SO4-, por lo que interfiere con la polimerización del gel.
Preparación del Gel
- El tamaño del poro del gel depende de la concentración de acrilamida.
- Mientras mayor es el porcentaje de acrilamida, menor es el tamaño del poro del gel.
- El porcentaje del gel que se prepare dependerá de la proteína o muestra que desee caracterizar.
Electroforesis de Proteínas
- La electroforesis de proteínas se utiliza para identificar una proteína específica o de interés basado en tamaño o peso molecular.
- La electroforesis (SDS-PAGE) se utiliza para monitorear el proceso de lisis y recuperación, monitorear el proceso de purificación de una proteína, y detectar modificaciones post-traduccionales.
- El método más utilizado para separar proteínas por electroforesis en gel fue formulado originalmente por Laemmli (1971).
Preparación de las Muestras
- La muestra de proteínas totales se prepara mezclando agua ultrapura, muestra y Laemmli buffer (sample buffer) 5X.
- La cantidad de proteínas totales que se estará utilizando es de 5 o 7 µg.
- La muestra se calienta durante 5 minutos en el “Heat block” a 95°C para desnaturalizar las proteínas.
Corrida de la Electroforesis
- La electroforesis se realiza a un voltaje de 90 voltios hasta que alcance el nivel del gel de separación.
- El profesor decidirá la cantidad de microgramos (µg) a utilizar dependiendo de las concentraciones obtenidas de proteínas totales en el experimento de BCA.
Prueba tus conocimientos sobre la electroforesis de proteínas SDS-PAGE, incluyendo los principios básicos, cálculos de muestras y detección de proteínas. Evalúa tus habilidades en el laboratorio de biología celular y molecular.
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