biomol 3/3

Clonaggio e Interazione delle Proteine

• Utilizzo di cDNA da geni espressi nel cervello per effettuare clonaggio casuale delle proteine.
• Un miscuglio di cDNA clonato è posizionato a valle della GAL activation domain come preda.
• Controllo della clonazione tramite SDS-PAGE e analisi con elettroforesi.
• Trasformazione di lieviti con la genoteca, seguito da piastra di selezione senza leucina per identificare i sopravvissuti.
• Replica plating su piastra contenente X-Gal per confermare interazioni proteiche.

Fattori di Trascrizione Eucariotici

• Attivano o reprimono la trascrizione legandosi a elementi genetici chiave, come enhancer e silencer.
• Importante nel reclutamento della RNA polimerasi e nell’interazione con il complesso trascrizionale.
• Modificano la cromatina per facilitare o inibire l’accesso ai geni target da parte dei fattori di trascrizione.
• Proteine modulari con domini distintivi per legame al DNA e attivazione/repressione della trascrizione.

Sequenze Consenso e Domini di Legame

• I fattori di trascrizione riconoscono sequenze specifiche del DNA, definite come sequenze consenso, per il legame.
• Sequenze consenso riconosciute comprendono posizioni chiave nei promotori, simili a quelle nei procarioti.
• Domini di legame al DNA come Homeodomain, Zinc-finger, e Basic Helix-loop-helix sono fondamentali per l’attività dei fattori di trascrizione.

Trasfezione e Studio dei Geni

• Processo di trasfezione tramite lipidi cationici per introdurre plasmidi nelle cellule.
• Le cellule devono esprimere geni specifici per avere una risposta evidenziabile, tramite un sistema di reporter come la luciferasi.
• Comportamento delle cellule dipende dalla presenza di fattori di trascrizione che legano gli enhancer o reprimono l’espressione.

EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)

• Utilizzato per dimostrare il legame tra proteine e specifiche sequenze di DNA.
• Consiste nella formazione di complessi proteina-DNA da analizzare in gel di poliacrilamide.
• La migrazione del DNA è influenzata dalla presenza o meno della proteina legante, indicante l’interazione.

Modifiche della Cromatina

• Fattori di trascrizione interagiscono con nucleosomi e rimodellano la cromatina per aumentare l'accessibilità ai geni.
• Inclusione di proteine stabilizzanti e fattori necessitati per mantenere l’organizzazione nucleosomiale.
• Modifiche della carica degli istoni influenzano la loro interazione con il DNA, facilitando l’accesso per i complessi di trascrizione.

Meccanismi di Attivazione della Trascrizione

• La struttura del DNA organizzato in nucleosomi può essere alterata per consentire accesso a fattori di trascrizione specifici.
• La formazione delle fibre di cromatina (10nm e 30nm) è influenzata dal legame di fattori di trascrizione e complessi di rimodellamento.
• Nucleosomi costituiti da istoni fondamentali (H2A, H2B, H3, H4) circondano il DNA, con codici istonici che partecipano all'organizzazione della cromatina.

Questo quiz esplora le tecniche di clonaggio proteico utilizzando cDNA e la loro applicazione nell'analisi delle interazioni proteiche. Inoltre, si discute il ruolo dei fattori di trascrizione e come influenzano la trascrizione genica nei sistemi eucariotici. Metodi come SDS-PAGE e trasformazione di lieviti verranno analizzati per comprendere meglio questi processi cellulari.