Citometría de Flujo: Análisis y Aplicaciones

• La biología celular es el estudio de la regulación celular, específicamente el ciclo celular.

Unidad Didáctica 11: Ciclo Celular

• Se explorará el descubrimiento de los factores de división celular en levaduras.
• Se examinará el ciclo celular en eucariotas, los reguladores de su progresión y los acontecimientos de la fase M.

La Importancia de las Levaduras

• Las levaduras son hongos unicelulares con pared celular rígida y relativamente inmóviles.
• Son eucariotas simples usados en la producción de pan y cerveza.
• Proveen un modelo crucial para comprender la biología celular eucariota.
• Ejemplos son Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe.
• S. pombe recibe su nombre de una cerveza africana y tiene forma de bastón.
• Se dividen por gemación o fisión.
• Presentan características típicas de células eucariotas.
• Su genoma consta de 12 millones de pares de bases de ADN y alrededor de 6000 genes.
• El ADN genómico se organiza en 16 cromosomas lineales, con citoesqueleto y orgánulos como mitocondrias.
• Fueron los primeros organismos eucariotas con genoma secuenciado.
• Se dividen cada 2 horas y forman colonias fácilmente.
• Las levaduras mutantes son importantes para entender procesos eucariotas fundamentales como la replicación del ADN, transcripción, procesamiento del ARN, ensamblaje de proteínas y regulación de la división celular.
• Entre 2001 y 2013, se otorgaron cuatro premios Nobel por investigaciones relacionadas con levaduras.

Científicos Clave y sus Descubrimientos

• Leland Hartwell: Usó Saccharomyces cerevisiae para estudios genéticos del ciclo celular y aisló células de levadura con genes mutados que controlan el ciclo.
• Identificó genes involucrados en el control del ciclo celular, llamados genes CDC, incluido el CDC28 que controla el primer paso en la progresión a través de la fase G1.
• Identificó la función crucial de los "puntos de control" que supervisan la correcta ejecución de los pasos en la fase anterior y asegurar el orden correcto entre las fases del ciclo celular.
• Paul Nurse: Identificó el gen cdc2 como regulador clave del ciclo celular entre 1976 y 1980.
• Descubrió que el producto de este gen controla la división celular (transición de G2 a M) e identificó el gen cdc2 en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe.
• Mostró que cdc2 tenía la misma función que el gen CDC28 en la levadura de panificación.
• Aisló el gen humano correspondiente, llamado CDK1, mostrando la conservación de la función CDK a través de la evolución.
• El gen CDK1 codifica una proteína que pertenece a una familia llamada quinasas dependientes de ciclina (CDK).
• Las moléculas CDK funcionan uniendo grupos de fosfato a otras proteínas (fosforilación).
• Se han encontrado varias moléculas CDK diferentes en humanos.
• La cantidad de moléculas CDK es constante durante el ciclo celular, pero su actividad varía según la función reguladora de las ciclinas, comparando CDK con un motor y las ciclinas con una caja de cambios.
• Tim Hunt: Descubrió las ciclinas, proteínas que se unen a las moléculas CDK.
• Las ciclinas regulan la actividad de CDK y seleccionan las proteínas objetivo para ser fosforiladas.
• Las proteínas fueron nombradas ciclinas por su variación cíclica en cantidad durante el ciclo celular.
• Descubrió el primer molécula de ciclina en 1982, utilizando huevos de erizo de mar y encontró que las ciclinas, al igual que CDK, se conservaban durante la evolución.
• Hoy en día, se han encontrado alrededor de diez ciclinas diferentes en humanos.
• El mecanismo molecular fundamental que controla el ciclo celular está altamente conservado a través de la evolución y funciona de la misma manera en levaduras, insectos, plantas, animales y humanos.
• Randy W. Schekman: Descubrió genes que codifican proteínas que son reguladores clave del tráfico de vesículas en células de levadura.

Mutantes y Genes del Ciclo Celular

• Los mutantes crecen normalmente a temperatura permisiva pero pierden la función génica a temperaturas restrictivas.
• Se han identificado más de 70 genes de ciclo celular a partir de mutantes sensibles a la temperatura.
• Las CDK y las ciclinas humanas pueden reemplazar la función de las proteínas de levadura alteradas.
• La división celular debe estar finamente regulada y coordinada con el crecimiento celular y la replicación del ADN.
• La progresión a lo largo del ciclo celular está controlada por una serie de proteínas quinasas cuya función se ha conservado desde las levaduras hasta los mamíferos.
• En eucariotas superiores, la división celular está controlada por factores de crecimiento que controlan la proliferación celular, lo que coordinar la división de las células individuales con las necesidades del organismo en su totalidad.

Ciclo Celular Eucariota

• Los procesos del ciclo celular están altamente coordinados.
• Incluye crecimiento celular, replicación del ADN, distribución de los cromosomas duplicados a las células hijas y división celular.
• Un ciclo celular en cultivo dura aproximadamente 24 horas.
• Las dos fases diferenciadas son la interfase y la mitosis.
• La separación de los cromosomas corresponde a la parte más llamativa del ciclo y termina división celular o citocinesis.

Citometría de Flujo

• Técnica de análisis del número, tamaño y forma de una suspensión celular.
• Cuantifica el número de células específicas marcadas con sustancias fluorescentes y aísla poblaciones celulares.
• Es útil para el estudio de poblaciones normales y patológicas de células sanguíneas y de médula ósea.
• El citómetro incluye un sistema fluídico, un sistema óptico de iluminación láser y un detector electrónico.
• Las células pasan por un capilar muy delgado de una en una.
• El rayo láser impacta en las células produciendo una distorsión registrada por el detector.
• Cuantifica el número de eventos (células) y analiza la forma y complejidad interna.
• La dispersión frontal (FSC) se relaciona con el tamaño de la célula, mientras que la dispersión lateral (SSC) indica la complejidad interna.
• Se usa el yoduro de propidio, un fluorocromo usado para marcar una población celular específicamente.

Fases del Ciclo Celular y su Contenido de ADN

• Las células en diferentes etapas del ciclo celular se distinguen por la cantidad de ADN.
• Las células en G1 son diploides (2n), donde n es el contenido de ADN haploide.
• Durante la fase S, la replicación del ADN transforma la célula de 2n a 4n.
• En las fases G2 y M, la cantidad de ADN es 4n. Después de la citocinesis, se reduce a 2n.
• La cantidad de ADN celular se determina experimentalmente incubando las células con yoduro de propidio y cuantificando la intensidad mediante citometría de flujo.

Regulación del Ciclo Celular

• La progresión a través del ciclo de división se regula por señales extracelulares e internas.
• El ciclo se coordina a entre las diferentes fases gracias a un sistema de puntos de control, previniendo la entrada a la siguiente fase hasta que se completen los eventos de la fase anterior.

Reguladores del Ciclo Celular

Factor Promotor de la Mitosis (MPF)

• El ciclo celular de los eucariotas está controlado por proteínas quinasas.
• Es un dímero de ciclina B y proteína quinasa Cdk1, donde la ciclina B cataliza la actividad.
• El complejo Cdk1-ciclina B tiene niveles de regulación.
• Después de ser activado, Cdk1 fosforila proteínas que inician la fase M y degrada la ciclina B por proteólisis mediada por ubiquitina.
• La proteólisis es mediada por la ubiquitina ligasa llamada "complejo promotor de anafase/ciclosoma" (APC/C), que se activa como consecuencia de la fosforilación por Cdk1/ciclina B.

Familias de Ciclinas y Quinasas Dependientes de Ciclinas

• Las uniones entre las ciclinas y las Cdk son altamente específicas.

Mecanismos de regulación de Cdks

• Los inhibidores, la asociación con ciclinas y la fosforilación influyen en la regulación de Cdks.

Control del Ciclo en G1 por Daño en el ADN

• En caso de daño en el ADN, p53 activa una Cdk inhibidora, deteniendo el ciclo en G1.

Factores de Crecimiento y Regulación de las Cdks de G1

• La síntesis de la ciclina D es inducida por factores de crecimiento, a través de Ras/Raf/MEK/ERK señalización y persiste mientras estos factores están presentes.
• Regulación del Ciclo Celular por Rb y E2F: Rb, en estado hipofosforilado, se une a miembros de la familia E2F reprimiendo genes. Su fosforilación por complejos Cdk4,6/ciclina D causa su disociación de E2F, activando los genes diana (incluyendo la Ciclina E).
• La progresión a través del punto de restricción y entrada a la fase S está mediada por la activación de complejos Cdk2/ciclina E.
• En fase G1 temprana, los complejos Cdk2/ciclina E se inhiben por p27. El paso por el punto de restricción induce síntesis de ciclina E vía activación de E2F. La activación de Cdk2 fosforila y marca p27 para su degradación, provocando activación plena de Cdk2/ciclina E la entrada en la fase S.

Fase S y la Replicación del ADN

• Los complejos Cdk2/ciclina E inician la fase S activando la síntesis de ADN en los orígenes de replicación, que constituye el complejo ORC.
• La replicación está minuciosamente controlada y se inicia mediante las proteínas MCM helicasa, reguladas por los complejos Cdk/ciclina. Las proteínas MCM helicasa se unen al complejo ORC constituyendo el complejo de pre-replicación.
• En fase S, Cdk2/ciclina E activan proteínas de activación reclutadas en el complejo de pre-replicación y la proteína quinasa DDK.
• DDK y Cdk2/ciclina E activan a las proteínas MCM helicasa; la activación de MCM inicia la replicación del ADN, y las proteínas MCM se alejan del origen de replicación.
• La alta actividad de Cdks evita se reasocien proteínas MCM a los ORC durante fases S, G2 y M.

Puntos de Control de Lesiones del ADN

• Las proteínas quinasas ATR y ATM se activan en complejos de proteínas reconociendo el ADN dañado y fosforilan/activan las quinasas de los puntos de control, Chk1 y Chk2, respectivamente.
• Chk1 y Chk2 fosforilan/inhiben a la proteína fosfatasa Cdc25 para activar Cdk1 y Cdk2.

Papel de p53 en la Detención del Ciclo Celular

• ATM y Chk2 fosforilan y estabilizan p53 para generar rápida respuesta a lesiones de ADN.
• P53 activa la transcripción del inhibidor de Cdk p21, inhibiendo a los complejos de Cdk2/ciclina E o ciclina A y a la detención del ciclo celular.

Acontecimientos de la Fase M: Etapas de Mitosis en Célula Animal

• La mitosis se divide en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase.
• En profase, los cromosomas se condensan y los centrosomas se al otro extremo del núcleo y se forma el huso mitótico. La envoltura nuclear se rompe y los microtúbulos del huso se anclan a los cinetócoros.
• En prometafase, los cromosomas se mueven hacia delante y hacia atrás los centrosomas, quedan anclados en la zona media del huso (metafase). En anafase, las cromátidas hermanas se separan y migran polos opuestos del huso
• En telofase, las envolturas nucleares se reconstituyen y cromosomas se descondensan. Finalmente, la célula realiza citocinesis dando lugar a dos células hijas.

Protección por Proteínas Quinasas

• La fase de la mitosis está también regulada por proteínas quinasas.
• El complejo Cdk1/ciclina B son reguladores clave por la activación de proteínas y por la fosforilación directa de proteínas en la reorganización celular.
• Las cinasas Aurora (A y B) y tipo Polo son también activadas en las proteínas quinasas.
• Las cinasas Aurora y de tipo Polo actúan con Cdk1 como en un bucle de retroalimentación positiva.
• Esta activación induce cambios en el núcleo/citoplasma en la mitosis fosforilando condensinas, cohesinas, láminas, proteínas matriz de Golgi y proteínas asociadas a centrosomas, cinetocoros y microtúbulos.

Acción de las Cohesinas y Condensinas

• Las cohesinas y condensinas pertenece a las proteínas SMC que juegan un papel de mantenimiento estructural de los cromosomas eucariotas.
• Las cohesinas se unen al ADN en fase S y mantienen la unión entre cromátidas hermanas.
• En la fase M, Aurora B y las quinasas Polo fosforilan a las condensinas.
• Las cohesinas sufren sustitución por partes condensadas en la mayor partes del cromosoma pero sólo se conservan en el centrómero.
• Las condensinas inducers condensación de la cromatina.

Mecanismos de la Degradación de la Envuelta Nuclear

• Cdk1/ciclina B fosforila las láminas nucleares además de las proteínas de los poros nucleares y de la envoltura.
• La fosforilación de las láminas hace que los filamentos que forman la lámina nuclear se disocien en dímeros libres de laminina y se absorben por el retículo endoplásmicom, que forman una red intacta en la mitosis y se distribuye a las células hijas.

Reorganización del Aparato de Golgi

• El aparato de Golgi de fragmenta en pequeñas vesículas en la mitosis que pueden se absorben o distribuidas a las células hijas durante la citocinesis.
• La descomposición está causada por la fosforilación mediada por Cdk1 y las quinasas tipo Polo que actuan sobre las proteínas de la Matriz de Golgi.

Reorganización del citoesqueleto

• En la profase, los centrosomas duplicados se separan y desplazan a extremos opuestos del núcleo, reclutan tubulina y se alargan.
• La separación del centrosoma y la construcción del huso están producidas pot las cinasas Aurora A y tipo Polo que se sitúan en los 　centrosomas.
• La rotura de la envuelta nuclear permite a los microtúbulos del huso unirse a los cinetócoros de los cromosomas se unan.
• Aurora B es una de las proteinas que se une al cinetocoro.

Punto de control del ensamblaje del uso

• La progresión de la anafase mediada por la activación de la uiquitina ligasa de APC/C.
• Los cinetocoros libres liberan una serie de proteínas que forman el complejo del punto de control mitótico, MCC， que inhiben APC/C.
• Una vez que todos los cromosomas se han alineado en el uso, el complejo inhibidor ya no se forma y se activa APC/C.
• El APC/C ubiquitiniza a la ciclina B, dando lugar a su degradación e inactiva a Cdk1.
• Asimismo los APC/C ubiquitiniza a las securina, dando lugar a la activa de la separasa, que desintegra una subunidad de la cohesina.
• La senarasa degrada la conexión enre las cromátidas hermanas, dando paso al inicio de la anafase.
• Alcanzando la anafase, el APC/C degrada las quinasas Aurora y Polo.

Citocinesis

• Tras concluse la mitosis, tiene lugar la citocinesis, una fase de división celular y la citocinesis es disparatada por la inactivación de Cdk1.
• La citocinesis tiene su origen en la contracción de filamentos de actina y miosina y estrangula la dividiendo a la célula en 2.
• las quinasas Aurora y tipo Polo actiivan la activación.

Este cuestionario evalúa los componentes, principios y aplicaciones de la citometría de flujo. Incluye preguntas sobre dispersión de la luz, ciclo celular y uso de fluorocromos en el análisis celular. Perfecto para estudiantes de biología y medicina.