Biologie de la reproduction: Fécondation

• M6 – Biologie de la reproduction, Fiche de cours n°5 : FECONDATION

Introduction

• Fécondation est la rencontre et fusion de 2 gamètes haploïdes en termes de chromosomes.
• L'ovocyte II est diploïde en termes d'ADN car la méiose n'est achevée que s'il est fécondé.
• La fécondation permet de reconstituer une cellule unique diploïde : le zygote.
• La fécondation in vitro a lieu en laboratoire.
• La fécondation in vitro implique la mise en contact des gamètes après leur recueil chez l'homme et la femme.
• La fécondation in vitro se base sur la connaissance des mécanismes de la fécondation in vivo.
• La fécondation in vivo est une série d'événements orchestrés dans le temps.
• La fécondation in vivo nécessite la transformation des gamètes indispensable avant la fécondation.
• La fécondation in vivo met en jeu une interaction gamétique : interactions et échanges moléculaires entre l'ovocyte II et le spermatozoïde.
• La fenêtre propice à la fécondation est de 2 à 3 jours avant l'ovulation jusqu'à 1 jour après.

Etapes Préalables à l'Interaction: Dépôt de Sperme

• Le sperme est constitué de spermatozoïdes et de plasma séminal produit par les glandes annexes.
• Les glandes annexes produisant le plasma séminal sont les vésicules séminales (70%), la prostate (15%), l'épididyme (10%) et les glandes de Mery Cowper (5%).
• Le sperme est constitué de quelques dizaines de millions de spermatozoïdes.
• Si la production de spermatozoïdes est normale, le sperme comprend 16 millions de spermatozoïdes par mL.
• Le dépôt vaginal du sperme au cours d'un rapport sexuel conduit à la formation d'un coagulum.
• Le coagulum se forme par polymérisation des séménogélines provenant des vésicules séminales.
• Le coagulum permet la coagulation et limite ainsi la perte de spermatozoïdes par reflux du sperme, mais il y a une persistance d'une élimination partielle du sperme.
• Le coagulum permet un emprisonnement temporaire des spermatozoïdes au fond de la cavité vaginale.
• Le coagulum subit une liquéfaction au bout d'un certain temps.
• La liquéfaction du coagulum se fait par des enzymes d'origine prostatique, ce qui permet la remontée des spermatozoïdes vers le lieu de la fécondation.

Etapes Préalables à l'Interaction: Passage du Col Utérin

• La glaire cervicale en période pré-ovulatoire est un mucus abondant et fluide (hydrogel).
• La glaire cervicale est constituée de longues chaînes de glycoprotéines avec des ponts disulfures S-S.
• Le maillage de la glaire cervicale est large sous l'influence de la production oestrogénique.
• Le col utérin provoque l'élimination du plasma séminal.
• L'absence de plasma séminal dans l'utérus est nécessaire à la capacitation car il y a présence d'inhibiteurs de la capacitation dans le plasma.
• Le col utérin provoque l'élimination des spermatozoïdes peu mobiles ou ayant une mobilité non linéaire; seuls les spermatozoïdes ayant une mobilité progressive linéaire vont progresser.
• Le passage du col est effectué par 2 à 3 millions de spermatozoïdes.
• Le premier lieu de stockage des spermatozoïdes est dans les cryptes cervicales, où ils survivent 3 à 4 jours.
• Les spermatozoïdes ne survivent pas dans le vagin à cause de l'acidité vaginale délétère pour les spermatozoïdes.

Etapes Préalables à l'Interaction: Remontée des Voies Génitales

• Le passage des sphincters utéro-tubaires est la deuxième barrière physiologique présente entre l'utérus et la trompe utérine.
• Les trompes sont le principal lieu où se fera la capacitation des spermatozoïdes.
• L'arrivée dans la trompe utérine peut se faire par la trompe du bon côté qui présente le complexe Cumulus-Ovocyte-Corona.
• Le complexe Cumulus-Ovocyte-Corona comprend l'ovocyte mature bloqué en métaphase II qui sera fécondable durant les 24h après l'ovulation.
• Si l'arrivée se fait par la trompe du mauvais côté, elle est sans complexe.
• Le chimiotactisme fait que les spermatozoïdes ont tendance à être attirés vers la bonne trompe.
• La région de l'isthme tubaire est une zone de ralentissement et de stockage d'environ 10 000 spermatozoïdes.
• Le tiers externe de la trompe contient quelques dizaines de spermatozoïdes.
• L'ampoule tubaire est le lieu de la fécondation.
• La fécondation est une interaction avec le Complexe Cumulus Ovocyte, où l'ovocyte mature entouré des cellules du cumulus oophorus dont la corona radiata est fécondable 24h.

Etapes Préalables à l'Interaction: Capacitation

• La capacitation est l'ensemble de changements que doivent subir les spermatozoïdes pour être capables de féconder l'ovocyte.
• Une fois les changements acquis, le spermatozoïde est dit apte à féconder un ovocyte.
• La capacitation a un état éphémère et réversible qui s'accompagne d'un changement de mobilité: mobilité linéaire → mobilité dite « hyperactive ».
• Les canaux calciques Catsper sont localisés au niveau de la pièce principale du flagelle et permettent l'entrée de calcium dans le spermatozoïde.
• La capacitation a lieu lors de la remontée des voies génitales féminines, majoritairement dans les trompes.
• In vivo, les changements possibles lors de la capacitation ont lieu lorsque les spermatozoïdes ne sont plus au contact du plasma séminal.
• L'élimination du plasma séminal se fait lors du passage du col de l'utérus.
• In vitro, les changements de la capacitation sont reproduits afin d'obtenir des embryons par AMP (assistance médicale à la procréation).

Etapes Préalables à l'Interaction: Capacitation - Aspects Moléculaires

• Diverses molécules induisent la capacitation, telles que l'albumine (attraction du cholestérol membranaire en dehors de la cellule), le bicarbonate, le calcium, l'héparine, le glucose et les espèces réactives de l'oxygène (ROS).
• La capacitation comprend une cascade de signalisation impliquant:
  • Augmentation du calcium: rôle des canaux calciques Catsper au niveau de la pièce principale du flagelle du spermatozoïde,
  • Production d'AMPc,
  • Augmentation du pHi dans la cellule,
  • Phosphorylation de protéines par les PKA.

Etapes Préalables à l'Interaction: Capacitation - Changements Membranaires

• La capacitation comprend le départ de protéines de surface fixées sur le spermatozoïde, notamment des protéines inhibitrices de la capacitation.
• La capacitation induit le démasquage de récepteurs spermatiques.
• La capacitation comprend la modification des résidus sucrés protéiques par des enzymes, ainsi que le démasquage de récepteurs spermatiques.
• La capacitation entraine une modification au niveau des glycoprotéines.
• La capacitation provoque la perte de cholestérol libre, qui est normalement intercalé entre les phospholipides avec un effet stabilisant de la membrane; la membrane devient donc instable ou fusiogène.
• La perte de cholestérol libre se fait grâce à des accepteurs de cholestérol (albumine, LDL ou HDL) qui attirent le cholestérol présent dans les sécrétions utérines et tubaires.
• La perte de cholestérol libre provoque l'ouverture des canaux calciques Catsper et donc l'entrée de calcium dans le spermatozoïde.

Etapes Préalables à l'Interaction: Capacitation - Changements du Type de Mobilité

• La visualisation de la trajectoire du spermatozoïde peut se faire de manière subjective (non visible à l'œil nu) ou de manière objective (utilisation d'une caméra scannant la trajectoire des spermatozoïdes et d'un ordinateur pour la caractériser).
• La mesure de différentes vitesses comprend la vitesse curvilinéaire VCL (vitesse obtenue avec la distance parcourue suivant le cheminement du spermatozoïde) et la vitesse linéaire VSL (vitesse obtenue avec la distance entre le point de départ et le point d'arrivée sans détour), ainsi que le battement latéral de la tête du spermatozoïde (ALH).
• La mobilité hyperactivée pour le spermatozoïde capacité comprend une diminution de la vitesse linéaire (VSL) et une augmentation de la vitesse curvilinéaire (VCL).
• La mobilité hyperactivée pour le spermatozoïde capacité comprend une augmentation du battement latéral de la tête (ALH).

Etapes Préalables à l'Interaction: Réaction Acrosomique (RA)

• La majorité des spermatozoïdes ont subi leur réaction acrosomique avant d'entrer en contact avec le complexe Cumulus-Ovocyte-Corona.
• La liaison du spermatozoïde avec la Zone pellucide (ZP) n'est pas suffisante pour induire la réaction acrosomique.
• Le déclenchement précis est mal connu, mais implique le rôle du calcium et d'autres facteurs.
• L'acrosome est constitué par la membrane acrosomique externe et la membrane acrosomique interne.
• Entre les deux membranes acrosomiques se trouve le contenu acrosomique avec des enzymes comme la hyaluronidase, l'acrosine...
• Les mécanismes de la réaction acrosomique impliquent une entrée massive de calcium dans le spermatozoïde.
• La réaction acrosomique comprend une fusion entre la membrane plasmique et la membrane acrosomique externe, ce qui entraine :
  • Formation de petites vésicules mixtes formées à partir de la membrane plasmique et de la membrane acrosomique externe.
  • Contenu acrosomique libéré dans le voisinage du spermatozoïde.
  • Membrane acrosomique interne se retrouve alors exposée à l'extérieur.
• Les modifications membranaires post-acrosomiques ont lieu au niveau de la région équatoriale et de la région post-acrosomique.
• La réaction acrosomique prépare le spermatozoïde à la fusion avec la membrane plasmique de l'ovocyte et est une étape indispensable.
• Cette réaction pourrait se produire lors de la migration tubaire.
• Les spermatozoïdes ayant fait leur RA traversent les cellules du cumulus avant de se lier à la zone pellucide.
• Un spermatozoïde ayant fait ou non sa RA est capable de se lier à la zone pellucide.

Etapes Préalables à l'Interaction: Traversée du Cumulus

• Le cumulus est composé de 3 000 et 6 000 cellules.
• Le cumulus est maintenu en place par une matrice riche en acide hyaluronique.
• Les mécanismes facilitant le passage des spermatozoïdes sont le mouvement hyperactif et le battement latéral de la tête du spermatozoïde.
• Les spermatozoïdes ayant fait ou non leur réaction acrosomique sont capables de traverser le cumulus.

Interaction avec la Zone Pellucide: Constitution de la Zone Pellucide

• La zone pellucide est composée de glycoprotéines (chaîne polypeptidique sur laquelle sont fixés des résidus de sucre).
• La zone pellucide est composée de différentes protéines en fonction des espèces animales.
• Chez la souris, la zone pellucide est composée de glycoprotéines ZP1, ZP2 et ZP3 qui forment des filaments hétérodimériques de ZP2 et ZP3 disposés en alternance, reliés par des ponts ZP1.
• Chez l'espèce humaine, on retrouve 4 glycoprotéines: ZP1, ZP2, ZP3 et ZP4 dont le rôle de ZP4 n'est pas conu.
• La zone pellucide est spécifique d'espèce et constitue une barrière à la fécondation inter-espèce.
• Un spermatozoïde humain est incapable de féconder un ovocyte de cochon d'inde.

Interaction avec la Zone Pellucide: Fixation Primaire et Traversée de la Zone Pellucide

• La fixation primaire, ou fixation du spermatozoïde sur l'ovocyte, met en jeu une reconnaissance ligand/récepteur.
• La fixation primaire est causée par partie N-terminale de ZP2 sur l'ovocyte chez la femme et la souris.
• Plusieurs récepteurs de la membrane plasmique du spermatozoïde sont impliqués dans la fixation primaire.
• La traversée de la zone pellucide se fait par un mécanisme chimique, comprenant la digestion de la zone pellucide grâce à deux enzymes: acrosine cible ZP1 et N acétylglucosaminidase cible ZP2 et ZP3.
• La traversée de la zone pellucide peut se faire par un mécanisme physique, qui implique l'hyperactivité du spermatozoïde.

Entrée dans le Cytoplasme Ovocytaire

• L'entrée du spermatozoïde dans le cytoplasme ovocytaire comprend une interaction avec la membrane plasmique de l'ovocyte.
• L'arrivée du spermatozoïde dans l'espace péri-vitellin aboutit à une fusion entre 2 membranes plasmiques.
• La fusion entre les membranes plasmiques se fait entre la membrane plasmique de la région équatoriale et post-acrosomique ou cape post-acrosomique du spermatozoïde et la membrane plasmique de l'ovocyte.
• La fusion des membranes débute au niveau de la région équatoriale puis se propage à l'ensemble de la membrane plasmique.
• Les molécules impliquées dans cette étape de fusion sont IZUMO1 (Ig like) et SPACA6 (Ig like) sur le spermatozoïde et JUNO (récepteur de IZUMO1), CD9 (tétraspanines) et CD81 (tétraspanines) sur l'ovocyte.
• Lors de l'entrée dans le cytoplasme ovocytaire, c'est l'intégralité du spermatozoïde qui est incorporée, pas que la tête.

Activation de l'Ovocyte: Oscillations Calciques

• L'activation de l'ovocyte se fait par des oscillations calciques.
• La libération de la phospholipase C zêta, contenue dans le cytoplasme du spermatozoïde, provoque l'activation de seconds messagers à l'intérieur de l'ovocyte, notamment le PIP2.
• L'activation de PIP2 induit la libération d'IP3 et une action sur des canaux calciques.
• Le calcium est relargé dans le cytoplasme ovocytaire, stocké dans le réticulum endoplasmique ovocytaire, ce qui provoque= Oscillations calciques.

Activation de l'Ovocyte: Formation des Pronoyaux

• La formation des pronoyaux se fait environ 2h après la fusion du spermatozoïde et de l'ovocyte.
• L'activation de l'ovocyte induit l'achèvement de la 2ème division méiotique: expulsion du 2ème Globule Polaire, contenant les chromatides sœurs, dans l'espace périvitellin et organisation du reste des chromosomes au centre d'une membrane nucléaire pour former un pronoyau (PN) femelle haploïde.
• Le pronoyau femelle mesure environ 22 microns de diamètre pour l'espèce humaine.
• Le pronucléus mâle subit des modifications nucléaires, comprenant la rupture de la membrane nucléaire, la réduction des ponts disulfures (SS) en groupements thiols (SH) via le glutathion GSH contenu dans l'ovocyte, le remplacement des protamines au niveau de l'ADN par des histones issues de l'ovocyte et la reformation de la membrane nucléaire.
• Les chromosomes paternels sont rassemblés dans une structure mesurant 24 microns de diamètre.
• On obtient un ovocyte fécondé ou zygote qui effectue sa première division cellulaire (première division de segmentation).
• Ovocyte fécondé = 2 pronoyaux + 2 globules polaires.

Activation de l'Ovocyte: Blocage de la Polyspermie

• La polyspermie est la fécondation de l'ovocyte par plusieurs spermatozoïdes et est une situation pathologique qui n'est pas à l'origine de la naissance de jumeaux.
• Il existe deux types de jumeaux : faux jumeaux (2 ovocytes fécondés par 2 spermatozoïdes différents) et vrais jumeaux (1 ovocyte fécondé par 1 spermatozoïde suivi de la division de l'œuf).
• Le blocage de la polyspermie implique une fusion des granules corticaux avec la membrane plasmique ovocytaire avec la libération de leur contenu dans l'espace périvitellin.
• Les granules corticaux sont des petits sacs d'enzymes situés sous la membrane plasmique ovocytaire depuis le pic de LH.
• Le blocage de la polyspermie comporte deux types de blocages:
  • Blocages immédiats comprenant une libération de zinc (quelques minutes après la fécondation) qui induit une modification de la densité de la zone pellucide, une inhibition de la fixation à la zone pellucide et une inhibition de la mobilité des spermatozoïdes, et une libération de JUNO dans l'espace péri-vitellin (40 minutes après la fécondation) qui fait office de leurre empêchant la fixation des spermatozoïdes sur la membrane ovocytaire.
  • Blocages différés comprenant la libération de l'ovastacine (4 heures après la fécondation) qui induit un clivage de la région N-terminale de ZP2 empêchant la fixation sur la zone pellucide.

Activation de l'Ovocyte: Elimination des Mitochondries Paternelles

• L'élimination des mitochondries paternelles implique l'entrée intégrale du spermatozoïde entraînant avec sa pièce intermédiaire contenant les mitochondries.
• L'œuf contient uniquement des mitochondries maternelles : les mitochondries paternelles sont détruites dans l'œuf.

Maladies Trophoblastiques Issues d'Anomalies de la Fécondation

• Les maladies trophoblastiques issues d'anomalies de la fécondation sont caractérisées par la présence d'un lot surnuméraire de chromosomes paternels (non équivalence des génomes paternel et maternel) et une prolifération exagérée du trophoblaste au dépend des tissus embryonnaires (absence de la masse cellulaire interne).
• Les maladies trophoblastiques issues d'anomalies de la fécondation ont une fréquence de 0,1 à 0,5% des grossesses totales.
• Le diagnostic se fait par la détection d'un taux très élevé de ẞhCG.
• Le diagnostic se fait également par échographie détectant une structure tissulaire sans embryon ni cavité amniotique.
• Les maladies trophoblastiques issues d'anomalies de la fécondation peuvent évoluer vers une interruption spontanée.
• Les maladies trophoblastiques issues d'anomalies de la fécondation peuvent évoluer après le 1er trimestre => môle hydatiforme.

Maladies Trophoblastiques Issues d'Anomalies de la Fécondation: Môle Hydatiforme Complète

• La môle hydatiforme complète a un caryotype normal diploïde mais tous les chromosomes sont issus du père.
• Le zygote androgénote peut avoir deux possibilités :
  • Fécondation par 2 spermatozoïdes puis élimination du noyau femelle
  • Fécondation par 1 spermatozoïde, élimination du noyau femelle puis duplication du noyau mâle.
• La môle hydatiforme complète correspond à du trophoblaste uniquement et a une possibilité de transformation en tumeurs malignes: choriocarcinome.
• La la môle hydatiforme complète à pour fréquence accrue les âges extrêmes de la vie : très jeunes femmes ou femmes proches de la ménopause, ainsi que les ethnies africaines et asiatiques.

Anomalies de la Fécondation: Anomalies Méiotiques

• Le sexe de l'embryon est déterminé à la fécondation, par le chromosome sexuel porté par le spermatozoïde: X ou Y.
• Le sexe est déterminé dès la 1ère division méiotique au cours de laquelle il y a séparation des chromosomes X et Y, avec un ovocyte normal (23, X).
• Des anomalies de ségrégation des chromosomes appelées non-disjonctions chromosomiques (en 1ère division méiotique, en 2ème division méiotique) sont à l'origine de l'apparition d'anomalies de nombre appelées aneuploïdies.
• Gamète disomique pour un chromosome (24 chromosomes) est à l'origine d'un embryon trisomique (47 chromosomes) et un Gamète nullosomique pour un chromosome (22 chromosomes) est à l'origine d'un embryon monosomique (45 chromosomes).

Anomalies de la Fécondation: Anomalies Méiotiques (Non Disjonction des Gonosomes au Niveau des Cellules Germinales Mâles)

• Plusieurs anomalies de la fécondation peuvent avoir lieu : 47, XXY (syndrome de Klinefelter avec un phénotype masculin), 45, XO (syndrome de Turner avec un phénotype féminin), 47, XYY et 47, XXX.

Anomalies de la Fécondation: Anomalies Méiotiques (Non Disjonction des Gonosomes au Niveau des Cellules Germinales Femelles)

• Plusieurs anomalies de la fécondation peuvent avoir lieu : 47, XXY (syndrome de Klinefelter), 47, XXX, 45, XO (syndrome de Turner) et 45, YO.