Biologie Cellulaire: Eucaryotes vs Procaryotes

Outils d'exploration de la cellule : Approches cellulaires

• Le diaporama présente les outils d'exploration cellulaire et les approches utilisées.
• L'auteur est Rabii AMEZIANE EL HASSANI.

Questions explorées

• Recherche documentaire
• L'intérêt d'étudier une cellule.
• Les techniques pour étudier une cellule.

Rappels Historiques sur La Cellule

• Matthias Schleiden et Theodor Schwann (1830-1837) ont postulé que la cellule est l'unité de base de tout organisme vivant.
• Rudolf Virchow (1858) a énoncé que toute cellule provient d'une autre cellule, introduisant le concept de multiplication cellulaire par division.

Classification des Organismes et Cellules

• Les organismes peuvent être unicellulaires ou pluricellulaires.
• Les cellules sont classées en procaryotes et eucaryotes.

Distinction entre Cellules Eucaryotes et Procaryotes

• Cellule eucaryote : vrai noyau, membrane nucléaire, organites intracellulaires, cytosquelette, division cellulaire par mitose ou méiose.
• Cellule procaryote : pas de noyau, pas d'organites intracellulaires, pas de cytosquelette, division cellulaire par scissiparité (bactéries).

Rappels sur le Corps Humain

• Un être humain adulte est constitué de 10^14 cellules issues d'une seule cellule.
• Les cellules subissent une différenciation.
• Il existe des cellules souches.
• La durée de vie d'une cellule varie selon son origine (ex : érythrocyte 120 jours, cellule intestinale 1 semaine).

Régulation Cellulaire

• La régulation cellulaire peut être endocrine, paracrine, autocrine ou juxtacrine.

Structure et Fonctions de la Cellule Eucaryote

• La cellule eucaryote possède un réticulum endoplasmique lisse et rugueux, une membrane nucléaire, un nucléole, de la chromatine, des pores nucléaires, du nucléoplasme, des centrioles, l'appareil de Golgi, une membrane plasmique, des lysosomes, des vacuoles, du cytoplasme, des mitochondries et des ribosomes.

Avantages de la Culture Cellulaire

• Étude in vitro simple.
• Étude de l'expression des gènes (transitoire ou permanente).
• Localisation subcellulaire des protéines.
• Étude des activités cellulaires et de la structure-fonction.
• Analyse de cytotoxicité, prolifération et cycle cellulaire.
• Possibilité de congélation et décongélation.

Conditions de Culture Cellulaire

• Les conditions doivent être stériles et avec un accès contrôlé pour éviter les contaminations.
• Utilisation de hotte à flux laminaire, bain-maire, incubateur cellulaire (37°C, humide, CO2 5%, O2 20%), microscope.

Termes Relatifs à la Culture Cellulaire

• Cellules adhérentes et en suspension.
• Ensemencement et repiquage/passage.
• Comptage cellulaire.
• Tryspinisation / Centrifugation.
• Confluence (inhibition de contact, différenciation).
• Culture primaire, secondaire, tertiaire, dédifférenciation.
• Lignée cellulaire et dérive cellulaire.
• Conditions de stérilité.
• Utilisation de flasque, puits, plaque à puits, boite.

Comptage Cellulaire et Dilution

• Utilisation d'une lame de Malassez.

Exigences de Stérilité en Culture Cellulaire

• Utilisation d'antibiotiques et d'autoclave.
• Prévention contre les bactéries et mycoplasmes.
• Vaccination contre HIV, Myc Tub et hépatite.
• Utilisation de cellules tumorales.
• Contrôle du milieu de culture avec indicateurs.

Culture Cellulaire Primaire

• Se fait à partir de tissu animal/biopsie ou de cellules circulantes (lymphocytes, cellules tumorales du sang).
• Nécessite séparation mécanique ou digestion enzymatique (trypsine, collagénase, dispase), filtration, lavage et centrifugation.
• La mise en culture se fait dans des conditions stériles et spécifiques.
• Nécessite l'accord du comité d'éthique et le consentement des patients.

Lignées Cellulaires

• ATCC (American Type Culture Collection) est une source de lignées cellulaires standardisées.
• La description d'une lignée comportera l'organisme d'origine, le type cellulaire, le tissu, et la maladie associée.
• Le milieu de culture complet sera indiqué.

Limites des Lignées Cellulaires

• Cellules hors contexte in vivo (stroma et système immunitaire).
• Dérive cellulaire au cours du temps.
• Immortalisées (SV40, hTERT).

Fractionnement Cellulaire

• Le fractionnement cellulaire est une technique utilisée pour séparer les organites intracellulaires.

Découverte du Peptide Signal

• Günter Blobel a reçu le prix Nobel de médecine en 1999 pour sa découverte du peptide signal.
• Les protéines possèdent des signaux intrinsèques qui gouvernent leur transport et leur localisation dans les cellules.

Biotechnologie et Immunofluorescence (IF)

• L'immunofluorescence est une technique pour marquer des éléments cellulaires, comme la mitochondrie dans des cellule vivante.
• Cela peut ce traduire par une colocalisation en jaune si deux éléments sont présents.

Protocoles d'Immunofluorescence (IF).

• Elle sert à l'étude des dommages ou de la localisation de protéines.

Immunofluorescence (IF) Immunofluorescence directe et indirecte

• Les fluorochromes (SYBR Green qRT-PCR , phycoérythrine (rouge), FITC, fluorescein isothiocyanate (vert), Alexa Fluor (488 (vert) et 610 (rouge), GFP) émettent de la fluorescence sous excitation.
• Elle requiert une mise en culture dans des conditions spécifiques (confluence, stimulation, extinction, expression, etc), Lavage, Fixation, Perméabilisation et Saturation puis Marquage Ac et Lavage pour finir par un marquage des noyaux et montage

Cytométrie de Flux (FACS)

• Permet d'analyser le cycle cellulaire et l'état de division des cellules.
• Un marquage avec iodure de propidium peut être fait.

Modifications Post-Traductionnelles

• Sont importantes pour la fonction des protéines (acétylation, phosphorylation, oxydation, glycosylation, etc.).
• L`étude de ces modifications peut être faite grâce à L'électrophorèse et Immunoblot ou aux anticorps.

SDS-PAGE et Western Blot

• Nécessitent des conditions dénaturantes (avec SDS et β-mercaptoéthanol) ou non dénaturantes.

Maturation et Adressage des Protéines

• Les protéines, issues des gènes, subissent une biosynthèse, acquièrent une structure tridimensionnelle, et peuvent subir maturation et glycosylation, avant d'être dégradées ou acheminées vers leur compartiment fonctionnel.

Étapes de l'Exploration Cellulaire

• L'isolement des cellules intactes nécessite que leur structure et fonctions soient préservées.
• D'où la nécessité d'un broyage des cellules au potter (pH, T°, inhibiteurs des protéases/phosphatases).
• Séries de centrifugation (Culot et surnagement).
• un Unltra-centrifugeuse réfrigéré (4°C)
• Suivi/Isolement/Purification/Caractérisation fonctionnelle

Cytométrie de Flux (FACS): cycle cellulaire

• Exemples de résultats cycle cellulaire Marquage au BrdU et iodure de propidium

Homéostasie Cellulaire

• Selon Walter Bradford Cannon, « l'homéostasie est l'équilibre dynamique qui nous maintient en vie. "
• Ex d'homéostasie: hydrique, pH sanguin, Température, Glycémie, prolifération, mort, Redox etc..

Homéostasie Cellulaire-réductions & oxydations

• Maintien de processus cellulaire normaux

Espèces Réactives de l'Oxygène (ERO):

• Radicaux libres se caractèrisent par Un électron(s) non apparié(s) ou célibataire(s) sur sa couche externe générant une Grande instabilité / Forte réactivité.
• Ce sont Entre autre le radical superoxyde (O2 -) où le radical hydroxyl (OH).
• Les dérivés non radicalaires: peroxyde d 'hydrogène (H2O2).

Rôle des Espèces Réactives de l'Oxygène

• Peuvent être issues des organelles (mitochondrie, peroxisome, etc.) et attaquer plusieurs composantes cellulaires (ADN, protéines, lipides).
• Les fonctions altérées se traduisent par des dommages cellulaires avec un impacte dans le vieillissement et maladies dégénératives.

Espèces Réactives de l'Oxygène et Hormones

• La biosynthèse T4 est la synthèse des hormones 3',5',3,5-tétriodotyrosine.

Equilibres Redox-Phagocytose

• Des déficits de l'oxydase peuvent causer la maladie chronique granulomateuse.

Régulation Redox de la signalisation cellulaire

• Inactivation & dégradation des phosphatases par l'H2O2.

Régulation Redox & Transcription

• Différentes Interractions peuvent inhiber le système transcriptionnel
• Un stress oxydant peut contribuer à ces altérations.

Apport de la Biologie Moléculaire

• L'Introduction ainsi que les outils d'exploration des séquences sont présentés.

Noyau Cellulaire

• Principal lieu de stockage et de préservation de l'information génétique (Chromatine, nucléole, réplication, génome)

Réplication et Expression des Gènes

• Les différentes étapes sont l'ADN (Réplication en ADN polymérase et Transcription vers ARN polymérase) puis vers les protéines et fonctions codés.

Les Acides Nucléiques et la Réplication

• Ils sont composés de squelette sucre/phosphate qui servent à l'appariement de bases complémentaires via une liaison hydrogène.

Organisation de l'ADN

• L'Adn doit être organisé de manière efficace dans le noyau pour optimisation et compaction de l'espace.
• Facilitant ainsi la réplication et le transcription.

Dynamisme de la chromatine - Réplication

• Il existe deux classes : Euchromatine & Hétérochromatine ayant diverses organisations, réplications et transcriptions.

Réplication de l'ADN - Intérêt

• Le but est de dupliquer une copie conforme de l'ADN.
• Préservant ainsi une information génétique codée transmise entre la cellule mère et génitrice.

Réplication de l'ADN - Etapes

• Différentes protéines (SSB) ADN polymérase, Ligase, Primase et nucléotides permettent la protection, stabilisation et la propagation de l'ADN.
• Tout en déroulant la double hélice et en éliminer le surenroulement.

Biotechnologie - Réplication de l'ADN

• Utilisé dans la détection de perturbations (mutation, délétions, etc.)
• Amplification our clonage moléculaire, ou encore l'étude de l'expression des gènes.

Lignées cellulaires - la réplication de L'ADN

• La PCR (polymerase chain reaction) sert à l'amplification d'ADNs.

PCR & L'amplification

• Peut se faire avec plusieurs paramètres comme l'adjonction d'amorces (amorces), la temperature/cycles et la taille des d'amplicons.

La Nested-PCR & l'expression De genes

• Son expression est corrélée avec une hyperméthylation et la déacétylation de gènes silencieux.

LM-PCR

• Est la technique par électrophorèse sur gel d'agarose permettant d'examiner les produits PCR de détection du cancer.

Transcription des gènes

• Au cours de laquelle les protéines sont générées (transcription) à partir de l'ADN.
• Pour ensuite faire la Traduction et l'expression.

Classe d'ARN et gènes

• Le ARNm (messager )pour un gène unique.
• Les ARNr ribosomiques pour structure épingle / boucle.
• Les ARNt: transfert.

Classe d'ARN et leur Génèse

• Les ARN se génèrent dans les noyaux et sont de différentes natures ARNr/ARNt/ARNm.
• En utilisant le système d'interactions ARNm -Exons et d'ajouts polyA: .

Unité de Transcription d'un Gène

• Le gène unité se compose des signaux et des promoteurs de transcription.

Facteurs Impactant la transcription

• L'activation de l'ARN polymérase et facteurs sont important au processus.
• Au même titre que le Code génétique ARNm avec ou sans Exons.

Mécanismes du Contrôle de la Réplication

• De multiples contrôles et transcriptions sont à prendre en compte une analyse de la réplication.

Réplication et ARN pré-messager

• L'Ajout polymérase avec Exons sert d'édition avec l'addition d'un ARN en queue.

Régulation pour la Réplication

• Utilisation d'un domaine TAD au niveau de la transcription.

RT-PCR (Reverse Transcription PCR )

• Amplifie une cible à partir d'ADNc.

RT-PCR (Application & Amplification)

• Peut se faire sur des tumeurs ou des études d'expression génique.

qRT-PCR Application de l'ARTpcR)

• Quantifie l'expression de l'ARN et l'amplification et la transcription inverse.

Mutagénèse Dirigée

• Méthode de mutagenèse du code afin d'induire des changements dans les cellules.

Epigénétique et Mutagenèse

• Il s'agit d'ingérer des siRNA au sein de la cellule tout en mutagénèse.

Transfection

• Est le système d’extinction de la transfection des ARN.

ARN interférence (RNAi) Transcription

• Est un mécanisme qui inhibe l'expression de gènes spécifiques par la dégradation de l'ARNm.

ARN interférence (RNAi) Processus

• RNA interférence se caractérise par être un processus évolutivement conservé qui utilise de petits ARN appelés ARN interférents (ARNi) pour contrôler l'expression des gène.

(en anglais) ARN interference-Genome Editing Process

• C'est tout simplement l'édition des génomes au sein des populations.

RNAi-Processus

• Inactivation rapide des protéines.

Epigénétique & Cancer

• Liées aux tumeurs.

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