Biologia Molecular: DNA Recombinante e Clonagem
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Questions and Answers

Com o objetivo de produzir uma proteína humana de interesse por tecnologia de DNA recombinante, em células procariotas:

  • devem ser utilizadas enzimas de restrição que isolem o gene a partir de células humanas, mantendo o promotor original.
  • uma vez isolado o gene de interesse, devem ser utilizadas enzimas de restrição que removam os intrões. (correct)
  • é necessário isolar o mRNA que a codifica e retrotranscrevê-lo a cDNA por RT-PCR. (correct)
  • deve ser isolada a proteína de interesse e transfectada em células procariotas para que a repliquem.

A figura ilustra o processo de clonagem de um mamífero. Caso se pretenda gerar um organismo transgénico que expresse a insulina humana nas células da glândula mamária para que possa ser utilizada para terapia enzimática de substituição, o gene da insulina a transfectar deverá ser associado a:

  • promotor da insulina bovina.
  • ao operão da beta-galactosidase.
  • promotor de uma proteína do leite bovino. (correct)
  • promotor da insulina humana.
  • um promotor procariota.

Com as técnicas hoje disponíveis, é possível sintetizar cromossomas artificiais em laboratório. Se de uma forma bem sucedida forem inseridos numa célula, esta será capaz de replicá-los se contiver:

  • Centrómero (correct)
  • Telómeros (correct)
  • Origem de replicação (correct)
  • Cromossomas sexuais
  • Histonas

Relativamente à dupla cadeia de DNA, qual das seguintes afirmações é verdadeira?

<p>a ligação entre as duas cadeias ocorre por ligações não covalentes por pontes de hidrogénio. (D), as cadeias têm uma orientação antiparalela. (E)</p> Signup and view all the answers

Eukaryotic mRNA transcript requires processing prior to translation, while prokaryotic mRNA transcripts require no processing prior to translation.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

Na transcrição, a cadeia de RNA crescente permanece ligada ao DNA molde, por ligações por pontes de hidrogénio, até que uma enzima venha separá-las.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

A cadeia codificante é sempre a cadeia 5'-3'.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

Em procariotas, a transcrição necessita de fatores de transcrição.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

As regiões da molécula de pré-mRNA dos eucariotas, codificadoras de proteínas, que se ligam para originar mRNA chamam-se exões.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

Relativamente ao processo de splicing, assinale as afirmações verdadeiras: é feito por enzimas endonucleases.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

Relativamente ao processo de splicing, assinale as afirmações verdadeiras: é a ultima etapa do processamento do mRNA e tem lugar no citoplasma.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

Relativamente ao processo de splicing, assinale as afirmações verdadeiras: é feito por RNAs com actividade catalítica snRNAs.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

Relativamente ao processo de splicing, assinale as afirmações verdadeiras: com este processo, diferentes mRNA pode gerar a mesma proteína.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

Relativamente ao processo de splicing, assinale as afirmações verdadeiras: o seu objectivo é aumentar a diversidade de proteínas sem ser necessário um maior número de genes.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

Em eucariotas, a transcrição é feita apenas pela RNA polimerase II.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

RNA polimerase cataliza ligações fosfo-diéster.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

RNA polimerase necessita de um primer para iniciar a transcrição.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

Na síntese proteica, o mRNA é traduzido no sentido _____ e a proteína sintetizada da extremidade _____ :

<p>5'-3'; amino para carboxílica. (C)</p> Signup and view all the answers

Qual das seguintes afirmações é verdadeira?

<p>Ambas a heterocromatina e a eucromatina encontram-se no núcleo. (C), A heterocromatina é mais condensada que a eucromatina. (E)</p> Signup and view all the answers

Qual das seguintes técnicas pode ser usada para a deteção de anomalias cromossómicas:

<p>Microscopia eletrônica (C), Eletroforese (B), Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) (E)</p> Signup and view all the answers

Indique qual das seguintes afirmações NÃO se aplica ao conceito de imprinting.

<p>causa o aumento da expressão de um gene. (H)</p> Signup and view all the answers

Qual das seguintes opções melhor explica o imprinting genómico?

<p>Metilação do DNA (E)</p> Signup and view all the answers

As doenças resultantes de variantes genéticas patogénicas em locus sujeitos a imprinting podem ter por base vários mecanismos. Qual destes NÃO é um mecanismo associado à expressão da doença?

<p>hipometiliação da região de controlo de imprinting. (B)</p> Signup and view all the answers

Dois dos mecanismos que as células eucariotas utilizam para regular a transcrição são do DNA e das histonas.

<p>Acetilação; metilação (A)</p> Signup and view all the answers

Nas mulheres, a lionização tem como resultado:

<p>A inactivação do cromossoma X paterno em algumas células. (D)</p> Signup and view all the answers

A inativação do cromossoma X em mamíferos inicia-se no zigoto.

<p>False (B)</p> Signup and view all the answers

Em todas as células diploides com 2 cromossomas X normais há inativação de um destes.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

Uma vez inativado o cromossoma X paterno ou materno, as células filhas mantém o padrão de inativação.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

A inativação do cromossoma X ocorre por silenciamento epigenético, por ação do RNA XIST.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

No cromossoma X inativo são encontradas modificações de histonas típicas de heterocromatina.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

O padrão de inativação é aleatório mas, uma vez definido, é fixo nas células-filhas.

<p>True (A)</p> Signup and view all the answers

Considere a seguinte representação de um gene e vários mRNAs. Qual a afirmação verdadeira?

<p>Os mRNAs representados correspondem a todos os produtos possíveis deste gene. (B)</p> Signup and view all the answers

A figura representa os vários níveis de controlo da expressão génica numa célula eucariota. O mecanismo assinalado com “X” diz respeito ao controlo de(a):

<p>atividade da proteína (C)</p> Signup and view all the answers

Na regulação da expressão do operão da biossíntese do triptofano, em procariotas:

<p>o repressor do operador só é produzido na ausência do triptofano. (A), o operador é uma sequência de nucleótidos incluída na região do promotor. (B), na ausência de triptofano, o repressor encontra-se inativo e não ocorre transcrição. (D)</p> Signup and view all the answers

Qual dos seguintes exemplos ilustra o processo de transdiferenciação ou reprogramação direta?

<p>desdiferenciação de fibroblastos em células estaminais pluripotentes induzidas e posterior diferenciação em cardiomiócitos. (B)</p> Signup and view all the answers

Flashcards

Para que o gene da insulina seja expresso nas células da glândula mamária, ele deve ser associado a qual promotor?

O gene a transfectar deverá ser associado a um promotor de uma proteína do leite bovino. Dessa forma, a expressão do gene da insulina será regulada pela expressão da proteína do leite bovino, garantindo a produção de insulina pela glândula mamária.

O que é o promotor?

A sequência de DNA que se liga diretamente à RNA polimerase, iniciando o processo de transcrição.

O que são elementos regulatórios?

Sequências de DNA que controlam a expressão de um gene. São reconhecidas por proteínas regulatórias que ativam ou inibem a transcrição.

O que é a replicação?

É a produção de novas cópias de moléculas de DNA a partir de um molde pré-existente.

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O que é a transcrição?

É o processo pelo qual a informação genética codificada no DNA é transcrita para uma molécula de RNA mensageiro (mRNA).

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O que são enzimas de restrição?

As enzimas de restrição são ferramentas essenciais para o isolamento de genes pois atuam como tesouras que cortam o DNA em locais específicos.

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O que é cDNA?

O cDNA é uma cópia de DNA que foi sintetizada a partir de uma molécula de RNA.

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O que é a transcrição reversa?

O processo de transcrição reversa consiste em gerar DNA a partir de RNA.

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O que é a RT-PCR?

A RT-PCR é uma técnica que permite amplificar e detectar sequências de DNA usando como molde o RNA.

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O que é a polaridade do DNA?

É a orientação da cadeia de DNA na molécula, 5' para 3' ou 3' para 5'.

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Como se orientam as cadeias de DNA?

As cadeias de DNA são antiparalelas, significando que se orientações opostas, mas com as bases azotadas pareadas na mesma direção.

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Como são ligados os nucleótidos dentro da cadeia de DNA?

A ligação entre os nucleótidos de uma cadeia de DNA é feita por ligações covalentes glicosídicas, que ligam o fosfato à pentose.

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O que une as duas cadeias de DNA?

As duas cadeias de DNA são estabilizadas por pontes de hidrogénio entre as bases azotadas complementares: Adenina com Timina (A-T) e Guanina com Citosina (G-C)

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O que são intrões?

Os intrões são regiões não codificantes no RNA que são removidas durante o processamento do mRNA.

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O que são exões?

Os exões são regiões codificantes no mRNA que são traduzidas em proteínas.

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O que é splicing?

O splicing é o processo de remoção dos intrões e junção dos exões dentro do pré-mRNA.

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O que faz o splicing?

O processo de splicing é realizado por snRNAs, que são RNAs com atividade catalítica.

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O mRNA dos eucariotas precisa de processamento antes da tradução?

Após a transcrição, o mRNA dos eucariotas requer processamento antes de poder ser traduzido, incluindo a adição de um 5'-cap e poliA na extremidade 3' e o splicing dos intrões.

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O que é a tradução?

A tradução é o processo pelo qual a informação genética contida nos genes é transformada em proteínas.

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Qual é a direção da tradução e da síntese proteica?

O mRNA é traduzido no sentido 5' para 3' e a proteína sintetizada da extremidade amino para a carboxílica.

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O que é o reparo de despareamento?

O sistema de reparo de despareamento é um mecanismo de reparo do DNA que corrige falhas de replicação introduzidas pela DNA polimerase.

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O que é o reparo por excisão de bases?

É um tipo de reparo do DNA que é utilizado quando o DNA é danificado antes da replicação.

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Como o sistema de reparo de despareamento reduz a taxa de erro?

O sistema de reparo de despareamento reduz a taxa de erro durante a replicação do DNA em 100 vezes.

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O que é a junção de extremidades não homólogas?

A junção de extremidades não homólogas é um processo de reparo do DNA que junta os dois extremos de uma molécula de DNA de cadeia dupla quebrada.

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A junção de extremidades não homólogas é precisa?

A junção de extremidades não homólogas não é um processo preciso e pode resultar na perda de informação genética.

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O que é modificação de histonas?

É um tipo de regulação da expressão de um gene que envolve a modificação das histonas.

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Que tipos de modificações as enzimas modificadoras de histonas podem introduzir?

As enzimas modificadoras de histonas podem introduzir vários tipos de modificações, incluindo a acetilação, metilação e sulfurilação.

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O que acontece com as modificações de histonas?

As modificações de histonas podem promover a compactação ou descondensação da cromatina, afetando o acesso à informação genética.

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O que é a eucromatina?

A eucromatina é uma forma menos compactada de cromatina, que é transcrita ativamente.

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O que é a heterocromatina?

A heterocromatina é uma forma mais compactada de cromatina, que é menos transcrita.

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Como a metilação da histona H3 afeta a cromatina?

A metilação de lisina 9 da histona H3 é uma modificação que está frequentemente associada à heterocromatina e à inativação de genes.

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Qual é a técnica utilizada para identificar anomalias cromossómicas?

A técnica de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) é usada para visualizar e identificar anomalias cromossómicas.

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O que caracteriza uma doença de imprinting?

Uma doença de imprinting é causada por uma expressão anormal de um gene devido a um padrão de metilação erróneo do DNA.

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O que é o imprinting genómico?

O imprinting genómico é um fenômeno que acontece quando um alelo parental específico é silenciado mediante a metilação do DNA.

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O que é a lionização?

É a inativação aleatória e permanente de um cromossoma X nas mulheres, ocorrendo no início do desenvolvimento embrionário.

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Como a lionização funciona nas células-filhas?

A lionização ocorre de forma aleatória, mas uma vez estabelecida, é mantida nas células-filhas, resultando na expressão diferencial dos genes do cromossoma X

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O que é splicing alternativo?

O splicing alternativo é um processo que permite a produção de diferentes proteínas a partir do mesmo gene, através da união de diferentes combinações de exões durante o processamento do mRNA.

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O que representa a etapa 3 na figura do controlo da expressão genética?

A etapa 3 representa o controlo da degradação de mRNAs no citoplasma, que pode afetar a quantidade de proteína produzida.

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O que são microRNAs?

Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA que regulam a expressão de genes através da interação com o mRNA, levando à sua degradação ou bloqueio da tradução.

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O que são siRNAs?

Os siRNAs (small interfering RNAs) são pequenas moléculas de RNA de dupla cadeia que agem como moléculas de RNA guiadas para clivar o RNA, resultando no silenciamento de genes.

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O que são ilhéus CpG?

Os ilhéus CpG são regiões do DNA que contêm uma alta frequência de dinucleótidos CpG e estão frequentemente associados a locais de início da transcrição.

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O que são pseudogenes?

Os pseudogenes perderam a sua função original pela acumulação de mutações e não são expressos como proteínas, mas podem conter sequências de DNA semelhantes aos seus genes funcionais.

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O que são retrotransposões?

Os retrotransposões são sequências de DNA que se replicam através de uma molécula intermediária de RNA, utilizando a enzima transcriptase reversa.

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O que são lisossomas?

Os lisossomas são organelos que contêm enzimas hidrolíticas responsáveis pela digestão intracelular de moléculas e organelos danificados.

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Como as proteínas lisossomais chegam aos lisossomas?

As proteínas lisossomais são transferidas do Golgi para os endossomas tardios, onde são direcionadas para os lisossomas por um sinal de manose-6-fosfato.

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Para onde as proteínas sintetizadas em ribossomas livres no citosol são direcionadas?

As proteínas que são sintetizadas em ribossomas livres no citosol, são destinadas aos seguintes locais: citosol, núcleo, mitocôndrias, peroxissomas e alguns organelos.

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Para onde as proteínas sintetizadas em ribossomas associados ao RE são direcionadas?

As proteínas que são sintetizadas em ribossomas associados ao retículo endoplasmático (RE) são destinadas ao RE, Golgi, lisossomas, endossomas, membrana plasmática e exterior da célula.

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Qual é o papel da sequência de localização nuclear?

A sequência de localização nuclear (NLS) é uma sequência rica em aminoácidos básicos localizada em proteínas que vão para o núcleo, crucial para a sua entrada no núcleo.

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Qual é o papel da proteína Ran no transporte nuclear?

A proteína Ran é essencial para o transporte nuclear, ela se liga aos receptores de transporte nuclear e regula a sua localização.

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O que é a mitocôndria?

A mitocôndria é um organelo que produz a maioria da energia da célula através da respiração celular.

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O que é o DNA mitocondrial?

O DNA mitocondrial (mtDNA) é uma cadeia circular de DNA que codifica alguns polipéptidos da cadeia de transporte de elétrons da respiração celular.

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O que é heteroplasmia?

A heteroplasmia é a presença de diferentes populações de mtDNA dentro da mesma célula.

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Porque a herança mitocondrial é materna?

A herança mitocondrial é materna, pois as mitocôndrias do embrião provêm do óvulo, enquanto as mitocôndrias do espermatozóide são eliminadas durante a fertilização.

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O que são filamentos de actina?

Os filamentos de actina são polímeros de subunidades protéicas de actina que formam microfilamentos, estruturas flexíveis e dinâmicas que participam em vários processos celulares, incluindo a movimentação celular e a contração muscular.

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O que são queratinas?

As queratinas são proteínas estruturais que formam filamentos intermediários, proporcionando suporte e resistência aos tecidos epiteliais.

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O que é a epidermólise bolhosa simplex?

A epidermólise bolhosa simplex é uma doença genética que causa a formação de bolhas na pele devido à alteração nos filamentos intermediários da queratina.

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O que é a apoptose?

A apoptose, ou morte celular programada, é um processo que elimina células indesejáveis ou danificadas de maneira controlada.

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O que é a via intrínseca da apoptose?

A via intrínseca da apoptose é ativada por estresse intracelular, como o dano ao DNA.

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O que é a via extrínseca da apoptose?

A via extrínseca da apoptose é ativada por sinais extracelulares, como a ligação de ligantes de morte às células.

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O que é o PDGF?

O PDGF (Platelet Derived Growth Factor) é um fator de crescimento que estimula a proliferação e a diferenciação celular durante a cicatrização de feridas.

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O que é o câncer?

O câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento e proliferação celular descontrolados.

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O que é CRISPR-Cas9?

A CRISPR-Cas9 é um sistema de edição genética que utiliza a enzima Cas9 para cortar o DNA em um local específico e a RNA guia para direcionar a Cas9 para o local correto.

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O que é a terapia genética?

A terapia genética consiste em inserir genes funcionais em células para corrigir ou tratar doenças genéticas.

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Study Notes

DNA Recombinante em Células Procariotas

  • Para produzir uma proteína humana, utiliza-se enzimas de restrição para isolar o gene de interesse a partir de células humanas, mantendo o promotor original.
  • Isolam-se o mRNA que codifica o gene e retrotranscreve-se o cDNA por RT-PCR
  • A proteína de interesse é, então, transfectada em células procariotas para ser replicado.

Clonagem de Mamíferos e Transfecção

  • Para um organismo transgénico que expresse insulina humana, o gene da insulina deve ser associado a um promotor de uma proteína do leite bovino.

Cromossomas Artificiais

  • Um cromossoma artificial pode ser replicado se contiver: Origem de replicação, Telómeros e Centrómero e Histonas.
  • Cromossomas sexuais não são um componente necessário.

Estrutura do DNA

  • As fitas duplas de DNA têm orientação antiparalela.
  • As bases azotadas estão orientadas para o interior do DNA.
  • As ligações entre duas cadeias de DNA são por pontes de hidrogénio, não covalentes.
  • A complementaridade das cadeias é estabelecida pelos pares de bases.

Transcrição

  • O mRNA eucariótico precisa de processamento antes da tradução, enquanto o procariótico não.
  • A cadeia de RNA cresce ligada ao DNA molde por pontes de hidrogénio, até ser separada por uma enzima.
  • A cadeia codificante é a cadeia 5´-3´.
  • A transcrição nos procariotas necessita de fatores de transcrição.
  • A RNA polimerase catalisa ligações fosfodiéster, mas não necessita de um primer para iniciar a transcrição.
  • RNA polimerase em eucariotas é RNA pol II

Tradução de mRNA

  • O mRNA é traduzido de 5'-3', com a síntese de proteína ocorrendo da extremidade amino para carboxílica.

Reparação por Descasamento

  • O sistema de reparação por descasamento diminui a taxa de erros de replicação.
  • O sistema de reparação por descasamento diminui a taxa de erro de replicação em 100 vezes.

Mutação

  • A desaminação de citosina em TCAT pode levar a mutações.
  • Após réplicas sucessivas, a mutação TCAT torna-se TTAT.

Ligação Não Homóloga de Extremidades

  • A ligação de extremidades não homóloga une uma extremidade dupla de DNA à extremidade dupla mais próxima, mantendo a integridade do DNA.

Modificações de Histonas

  • As modificações químicas de histonas são irreversíveis e ocorrem nos nucleossomas.
  • Incluem modificações como acetilação, metilação e sulfurilações
  • Alteram a estrutura da cromatina para activar ou desactivar genes.

Eucromatina e Heterocromatina

  • A eucromatina é menos condensada que a heterocromatina e geralmente transcrita, enquanto a heterocromatina é mais condensada, geralmente não transcrita (exceções).
  • Ambos existem no núcleo.
  • A metilação da lisina 9 da histona 3 é a modificação da cromatina que mais frequentemente induz a formação de heterocromatina.

Técnicas para Anomalias Cromossómicas

  • PCR
  • FISH (Hibridização in situ fluorescente)
  • Eletroforese
  • Microscopia eletrônica
  • Cromatografia

Imprinting Genômico

  • Referencia-se ao silenciamento de um alelo (por metilação)
  • Resulta na expressão diferencial de um gene baseado no sexo do progenitor.
  • Pode levar a doenças ao alterar a expressão génica.
  • Pode afetar múltiplos genes numa região cromossómica.

Imprinting Genômico

  • É regulado pela metilação de alelos
  • Afecta vários genes
  • O padrão de metilação/silenciamento é estabelecido durante o desenvolvimento e é mantido através de gerações.

Inativação do Cromossomo X

  • Nas mulheres, o mecanismo de inativação de um cromossoma X na maioria dos seus tecidos/órgãos para evitar a expressão excessiva de genes.

Níveis de Regulação de Genes

  • Regulação da expressão génica pode ser feita a nível da transcrição, RNA, tradução ou degradação das proteínas.
  • Em eucariotas, pode ser através da regulação da cromatina.
  • A regulação pode ser feito através das modificações das histonas.

Tipos de RNA

  • Os microRNAs, siRNA, snRNA, ncRNA, tRNA, mRNA, rRNA podem induzir o silenciamento de genes.

MicroRNAs

  • São sintetizados a partir de um precursor de cadeia dupla no núcleo.
  • Regulam a expressão génica associando-se ao mRNA complementar.
  • Os microRNAs atuam no processo de degradação dos mRNAs ou inibindo a sua tradução.

Citoesqueleto e Filamentos de Actina,

  • Os monómeros de actina têm atividade ATPase.
  • A formação de lamelipodia ocorre por polimerização da actina na extremidade positiva.
  • Os monómeros de actina livres estão ligados a GTP, que é hidrolisado a GDP após a polimerização.
  • Filamentos de actina possuem polaridade.

Apoptose

  • A inativação de p53, em resposta a dano de ADN, não desenrola a via intrínseca da apoptose.
  • A ativação da via intrínseca da apoptose é determinada pelo equilíbrio das proteínas pro/antiapoptóticas.
  • O apoptossomo é constituído por citocromo c, proteínas adaptadoras, e procaspases-9.

Proto-oncogenes e Oncogenes

  • Proto-oncogenes são convertidos em oncogenes por translocação, amplificação, mutações ou a inserção de novos promotores.
  • Proto-oncogenes não se tornam oncogenes por metilação do promotor.

Terapia Génica e Edição Génica

  • O sistema CRISPR-Cas9 é utilizado para edição genética.

Fibrose Cística

  • A proteína CFTR recombinante não é usada na terapia, devido à dificuldade de entrega da proteína às células epiteliais.

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Este quiz aborda conceitos essenciais sobre DNA recombinante em células procariotas, clonagem de mamíferos e a estrutura básica do DNA. Explore a importância dos cromossomos artificiais e as técnicas utilizadas na transgenia para a produção de proteínas humanas. Teste seus conhecimentos sobre biotecnologia moderna!

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