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Questions and Answers
Qual a função do tampão de lise CTAB?
Lise de membranas que envolvem a molécula de DNA
Quais dos seguintes componentes fazem parte do tampão CTAB? (Selecione todas as que se aplicam)
O PVP é utilizado como um quelante de cátions divalentes.
False
Qual temperatura é ideal para a Taq DNA polimerase durante a extensão na PCR?
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Correspondência entre os componentes da PCR e suas funções:
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A técnica de _________ é utilizada para a separação de moléculas através de um gel.
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O que acontece ao adicionar isopropanol durante a extração de DNA?
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Qual é a função da espectrofotometria na avaliação do DNA?
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Study Notes
Objetivo do Estudo
- Apresentar técnicas fundamentais na análise de marcadores moleculares: extração, amplificação e quantificação do DNA.
Extração do DNA
- Protocolo de extração baseado no detergente CTAB, desenvolvido em 1987.
- O material vegetal mais indicado para extração é folhas, facilitando o processo.
Etapas da Extração de DNA
- Seleção e maceração do material vegetal.
- Adição de tampão de lise CTAB a 65°C:
- Lise membranas celulares e preservação da integridade do DNA.
Composição do Tampão CTAB
- CTAB: detergente que quebra membranas lipoproteicas e precipita o DNA.
- EDTA: quelante que inativa DNAses, capturando cálcio e magnésio.
- Tris: tamponante que estabiliza o pH.
- NaCl: complexa ao DNA, auxiliando na sua precipitação.
- PVP: antioxidante que protege o DNA.
- 2-Mercaptoetanol: degrada proteínas e combate oxidação, sendo tóxico.
Procedimento após Adição do CTAB
- Formação da fase aquosa (contendo DNA) e fase orgânica (compostos indesejáveis) após adição de clorofórmio e álcool isoamílico.
- Purificação final do DNA com isopropanol e álcool a 70% gelado, resultando em precipitado esbranquiçado.
Avaliação da Quantidade e Qualidade do DNA
- Espectrofotometria: gera uma curva de quantificação.
- Gel de eletroforese: avalia qualidade do DNA; manchas esbranquiçadas indicam degradação.
Amplificação do DNA
- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) desenvolvida por Kary Mullis em 1984.
- A PCR permite a replicação in vitro do DNA, resultando em milhões de cópias.
Componentes da PCR
- Amostra de DNA: quantidade medida em nanogramas.
- Água: meio para as reações de amplificação.
- Tampão 10x: mantém pH e concentrações iônicas ideais.
- MgCl2: cofator para a enzima Taq Polimerase.
- dNTPS: nucleotídeos (A, T, G, C) usados para a amplificação.
- Taq DNA polimerase: enzima proveniente da Thermus aquaticus, atua em 72°C.
Etapas da PCR
- Denaturação do DNA por 1 minuto a 94 °C.
- Anelamento por 45 segundos a 54°C, permitindo união dos primers.
- Extensão a 72 °C por 2 minutos, ideal para Taq Polimerase.
- Termociclador realiza amplificação exponencial, resultando em até 68 bilhões de cópias.
Eletroforese
- Técnica de separação de moléculas utilizando gel de agarose ou poliacrilamida.
- Partículas migram em resposta a diferença de potencial elétrico.
- Gel de agarose é utilizado para separar moléculas de alto peso molecular, enquanto poliacrilamida é indicada para moléculas de baixo peso molecular.
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Description
Este quiz aborda as técnicas laboratoriais utilizadas no estudo dos marcadores moleculares, incluindo a extração, amplificação e quantificação do DNA. Destinado a alunos de Agronomia na disciplina de Biotecnologia, o material tem como objetivo reforçar o conhecimento prático dessas técnicas essenciais.
