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Questions and Answers
Qual a função do tampão de lise CTAB?
Qual a função do tampão de lise CTAB?
Lise de membranas que envolvem a molécula de DNA
Quais dos seguintes componentes fazem parte do tampão CTAB? (Selecione todas as que se aplicam)
Quais dos seguintes componentes fazem parte do tampão CTAB? (Selecione todas as que se aplicam)
O PVP é utilizado como um quelante de cátions divalentes.
O PVP é utilizado como um quelante de cátions divalentes.
False
Qual temperatura é ideal para a Taq DNA polimerase durante a extensão na PCR?
Qual temperatura é ideal para a Taq DNA polimerase durante a extensão na PCR?
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Correspondência entre os componentes da PCR e suas funções:
Correspondência entre os componentes da PCR e suas funções:
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A técnica de _________ é utilizada para a separação de moléculas através de um gel.
A técnica de _________ é utilizada para a separação de moléculas através de um gel.
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O que acontece ao adicionar isopropanol durante a extração de DNA?
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Qual é a função da espectrofotometria na avaliação do DNA?
Qual é a função da espectrofotometria na avaliação do DNA?
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Study Notes
Objetivo do Estudo
- Apresentar técnicas fundamentais na análise de marcadores moleculares: extração, amplificação e quantificação do DNA.
Extração do DNA
- Protocolo de extração baseado no detergente CTAB, desenvolvido em 1987.
- O material vegetal mais indicado para extração é folhas, facilitando o processo.
Etapas da Extração de DNA
- Seleção e maceração do material vegetal.
- Adição de tampão de lise CTAB a 65°C:
- Lise membranas celulares e preservação da integridade do DNA.
Composição do Tampão CTAB
- CTAB: detergente que quebra membranas lipoproteicas e precipita o DNA.
- EDTA: quelante que inativa DNAses, capturando cálcio e magnésio.
- Tris: tamponante que estabiliza o pH.
- NaCl: complexa ao DNA, auxiliando na sua precipitação.
- PVP: antioxidante que protege o DNA.
- 2-Mercaptoetanol: degrada proteínas e combate oxidação, sendo tóxico.
Procedimento após Adição do CTAB
- Formação da fase aquosa (contendo DNA) e fase orgânica (compostos indesejáveis) após adição de clorofórmio e álcool isoamílico.
- Purificação final do DNA com isopropanol e álcool a 70% gelado, resultando em precipitado esbranquiçado.
Avaliação da Quantidade e Qualidade do DNA
- Espectrofotometria: gera uma curva de quantificação.
- Gel de eletroforese: avalia qualidade do DNA; manchas esbranquiçadas indicam degradação.
Amplificação do DNA
- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) desenvolvida por Kary Mullis em 1984.
- A PCR permite a replicação in vitro do DNA, resultando em milhões de cópias.
Componentes da PCR
- Amostra de DNA: quantidade medida em nanogramas.
- Água: meio para as reações de amplificação.
- Tampão 10x: mantém pH e concentrações iônicas ideais.
- MgCl2: cofator para a enzima Taq Polimerase.
- dNTPS: nucleotídeos (A, T, G, C) usados para a amplificação.
- Taq DNA polimerase: enzima proveniente da Thermus aquaticus, atua em 72°C.
Etapas da PCR
- Denaturação do DNA por 1 minuto a 94 °C.
- Anelamento por 45 segundos a 54°C, permitindo união dos primers.
- Extensão a 72 °C por 2 minutos, ideal para Taq Polimerase.
- Termociclador realiza amplificação exponencial, resultando em até 68 bilhões de cópias.
Eletroforese
- Técnica de separação de moléculas utilizando gel de agarose ou poliacrilamida.
- Partículas migram em resposta a diferença de potencial elétrico.
- Gel de agarose é utilizado para separar moléculas de alto peso molecular, enquanto poliacrilamida é indicada para moléculas de baixo peso molecular.
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Description
Este quiz aborda as técnicas laboratoriais utilizadas no estudo dos marcadores moleculares, incluindo a extração, amplificação e quantificação do DNA. Destinado a alunos de Agronomia na disciplina de Biotecnologia, o material tem como objetivo reforçar o conhecimento prático dessas técnicas essenciais.
