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Biología Molecular

• Es la rama de la biología que estudia la composición, estructura, e interacciones de las moléculas celulares.
• Su estudio se centra en cómo el ADN, ARN, y las proteínas forman la base de la vida.

ADN y ARN

• El ADN es el material genético de los seres vivos y se encuentra en 45 ubicaciones, incluyendo 21 nudos.
• El ARN se encarga de la codificación de proteínas y la síntesis de ADN.

Componentes del ADN y ARN

• Se componen de una base nitrogenada, formada por átomos de carbono y nitrógeno.
• Contienen pentosa, que puede ser ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos, con los carbonos identificados del 1' al 5'.
• Incluyen un grupo fosfato.

Nucleótidos

• Están unidos por un enlace éster.
• El grupo OH se encuentra en el carbono 5' de la pentosa.
• Los nucleótidos son moléculas ácidas.
• El grupo fosfato se ioniza en medios acuosos, lo que les da carga negativa.
• En su forma libre, se encuentran trifosfatados.
• En su forma monofosfatada, se encuentran en el ADN y ARN.
• Se unen por un enlace fosfodiéster.

Nucleósido

• Compuesto por una base nitrogenada y una pentosa.
• Unidos por un enlace covalente N-glucosídico.

Nomenclatura

• Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo son bases nitrogenadas presentes en el ARN.
• Adenosina, Guanosina, Citidina y Uridina son nucleósidos de ARN.
• AMP, GMP, CMP y UMP son los monofosfatos de ribonucleótidos.
• ADP, GDP, CDP y UDP son los difosfatos de ribonucleótidos.
• ATP, GTP, CTP y UTP son los trifosfatos de ribonucleótidos.
• d-Adenosina, d-Guanosina, d-Citidina y Timidina son nucleósidos de desoxirribonucleótidos.
• d-AMP, d-GMP, d-CMP y d-TMP son los monofosfatos de desoxirribonucleótidos.
• d-ADP, d-GDP, d-CDP y d-TDP son los difosfatos de desoxirribonucleótidos.
• d-ATP, d-GTP, d-CTP y d-TTP son los trifosfatos de desoxirribonucleótidos.

Estructura del ADN

• Las bases nitrogenadas son hidrófobas.

Ley de Chargaff

• En el ADN, la cantidad de adenina es igual a la de timina ([A] = [T]).
• La cantidad de citosina es igual a la de guanina ([C] = [G]).

Variantes del ADN

• La forma A del ADN se encuentra presente en la muerte.
• Existen otras formas como B, C, y Z.

Nucleosoma

• Está compuesto por 8 histonas.

Histonas

• Existen 4 tipos de histonas donde se enrolla el ADN: H1, H2A, H2B, H3 y H4.
• H1 funciona como un seguro.

Compactación

• La compactación del ADN implica múltiples niveles de organización.
• Desde la fibra de ADN de 2 nm hasta el cromosoma de 1400 nm.
• La eucromatina o cromatina de interfase tiene una fibra de 300 nm.
• La heterocromatina tiene una fibra de 700 nm.

Estructura del ARN

• Es más abundante que el ADN y presenta una sola cadena.
• Contiene uracilo en lugar de timina y ribosa en lugar de desoxirribosa
• Su dirección es de 5' a 3'.

Estructura secundaria del ARN

• Implica el apareamiento complementario dentro de la misma cadena.

Estructura terciaria del ARN

• Involucra la interacción entre bases nitrogenadas de diferentes regiones de la misma molécula de ARN.

Tipos de ARN

• ARN mensajero (ARNm): Molécula de ácidos nucleicos de cadena sencilla; contiene información genética del ADN.
• ARN transferencia (ARNt): Tiene estructura de bucles; transporta aminoácidos al RNAr; posee un anticodón.
• ARN ribosomal (RNAr): 5S, 5.8S y 28S + 49 proteínas forman la subunidad mayor; 18S + 33 proteínas forman la subunidad menor; realiza a la síntesis proteica.

Flujo de Información

• Replicación: ADN polimerasa produce ADN.
• Transcripción: ARN polimerasa produce ARN.
• Traducción: ARNm, ARNt y ARNl se traducen en proteínas.
• Retrotranscripción: transcriptasa reversa produce ADNc a partir de ARN.

Replicación

• La síntesis de las cadenas de ADN ocurre en dirección 5' a 3'.
• Proceso semiconservador: cada nueva molécula de ADN conserva una de las cadenas originales.
• Proceso bidireccional: la síntesis ocurre en ambas direcciones desde sitios de origen ricos en A y T.
• Proceso continuo y discontinuo: la replicación es continua en la cadena 5'-3' (hebra líder) y discontinua en la cadena 3'-5' (con fragmentos de Okazaki en la hebra discontinua/rezagada).

Proteínas involucradas en la replicación

• Helicasa (MCM2-7): separa las hebras de ADN y rompe puentes de hidrógeno causando superenrollamientos.
• Proteínas de unión a cadena sencilla (RPA o SSB): evitan la formación de puentes de hidrógeno entre las cadenas, se pega a las cadenas sencillas.
• Primasa: sintetiza primers y proporciona un extremo 3', poniendo nucleótidos para generar hidroxilos en 3'.
• Topoisomerasa: cortan y forman enlaces fosfodiéster, eliminando el superenrollamiento.
• Nasa H: retira los primers en la cadena continua.
• Endonucleasa Flap I: remueve los primers de los fragmentos de Okazaki.
• Ligasa: forma el enlace fosfodiéster entre nucleótidos contiguos.
• Telomerasa: transcriptasa reversa que sintetiza secuencias específicas de ADN.
• Antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA): interactúa con la ADN polimerasa y mantiene unida a la ADN polimerasa con el ADN.
• ADN Polimerasa: sintetiza cadenas de ADN y forma enlaces fosfodiéster; ADN pol α actúa como primasa; ADN pol δ alarga las hebras rezagadas; ADN pol ε elonga la hebra líder; ADN pol β repara errores; ADN pol γ replica el ADN mitocondrial.

Fases de la replicación

• Inicio: identificación del origen de replicación; proteínas iniciadoras rompen puentes de hidrógeno; helicasas y ADN polimerasa alfa y primasa se activan.
• Elongación: ocurre en la hebra líder (un solo primer) y en la hebra rezagada (varios cebadores); los fragmentos en eucariotas miden 100 y 400 nt; los primers se eliminan por la RNAsa I y la endonucleasa Flap I; la ADN ligasa une los fragmentos.
• Terminación: la ADN pol delta y épsilon llegan al extremo del fragmento de ADN; se completa la maduración de los fragmentos de Okazaki; se unen los fragmentos, se eliminan los primers, se desacoplan todas las proteínas, y se replica el telómero.

Telómeros

• Son secuencias de nucleótidos al final de los cromosomas con repeticiones en tándem de secuencias cortas.
• En humanos, la secuencia es GGGTTA y se repite 100 veces en cada telómero.
• La hebra 3' es más larga que la hebra 5' y forma un t-loop.

Telomerasa

• Reconoce la punta de los telómeros y contiene una secuencia de ARN utilizada para alargar los telómeros
• Es semejante a la transcriptasa reversa y sintetiza la hebra rezagada.

Transcripción

• La información en el ARN está en el mismo lenguaje que en el ADN (nucleótidos).
• Es la síntesis de una cadena de ARN complementaria y antiparalela a la cadena molde.

ARN

• Nucleótidos unidos por enlace fosfodiéster.
• Ácido ribonucleico con adenina, citosina, guanina y uracilo.
• Una sola hebra con capacidad de tomar diferentes formas.

Tipos de ARN

• ARNm: Molécula de ARN que copia una secuencia del ADN.
• ARNr: Forman los ribosomas.
• ARNt: Se adaptan a aminoácidos y los colocan en el ribosoma para formar proteínas.

Gen

• El gen posee diversas secuencias reguladoras como promotores, potenciadores y silenciadores.
• También contiene secuencias codificantes como intrones (regiones no traducidas) y exones (regiones que codifican el producto).

Promotor

• Secuencia mínima requerida para la unión de la maquinaria basal de transcripción.
• El iniciador (INR) es donde comienza la transcripción.
• Elemento promotor corriente abajo (DPE).
• CAAT y GC son promotores reguladores.

Factores de transcripción (TF)

• Las proteínas reguladoras aumentan o disminuyen la tasa de transcripción.

ARN pol I

• Precursor de ARN ribosomal 18S, 28S y 5.8S.

ARN pol II

• ARNm, microARN, ARN pequeño nuclear, ARN pequeño nucleolar, ARN telomerasa.

ARN pol III

• ARN de transferencia y ARN ribosomal 5S, U6ARN.

Fases de la transcripción

• Formación del complejo de iniciación.
• Inicio.
• Elongación.
• Terminación.

Formación del complejo de iniciación

• Principalmente, unión del factor de transcripción TFIIID a la caja TATA.
• El factor TBP (proteína de unión específica para la caja TATA) deforma la estructura del ADN al unirse a ella.
• TFIIB se une al TBP y posiciona a la ARN pol II al inicio de la transcripción.
• TFIIA estabiliza la unión de TBP al ADN.
• TFIIF fija la ARN pol II al TFIIB, TFIIE regula la función de TFIIH, y TFIIH funciona como helicasa usando ATP para desenrollar la doble hélice, exponiendo el ADN templado y fosforilando la ARN pol II.

Inicio

• El mediador permite que las proteínas activadoras se comuniquen con la polimerasa y los factores TF.
• Ocurre la remodelación de la cromatina y facilita el deslizamiento de los nucleosomas.
• Mantiene el silenciamiento técnico.
• Promueve el desalojo de los nucleosomas.
• La enzima modificadora de histonas realiza la acetilación, metilación y fosforilación.

Elongación

• TFIIH fosforila el carboncillo terminal de la ARN polimerasa II.
• Ocurre la liberación del promotor.

Factores de elongación

• NELF y Gdown1 pausan la ARN polimerasa.
• PAFC1 pausa y activa la ARN polimerasa.
• P-TEFb fosforila la ARN polimerasa.
• SPT4,5 activa y ancla la ARN polimerasa al ADN.

Adición de CAP al transcrito de ARN

• La enzima de capping humano realiza modificaciones al ARN.
• La ARN trifosfatasa elimina un grupo fosfato.
• Guanilil transferasa añade nucleótidos de guaninina.
• Metil transferasa realiza la metilación.

Terminación

• Reconocimiento de la secuencia de poliadenilación.
• Desintegración del complejo de transcripción
• El factor de corte y poliadenilación específico CPSF reconoce la secuencia de terminación AAUAAAA.
• El factor estimulante de corte CstF participa en la escisión.
• La poli A polimerasa añade 200nt de adenina.

Transcrito primario / inmaduro

• Cadena que aún contiene los intrones.

Traducción

• Es la síntesis de una proteína de acuerdo a la información genética contenida en una molécula de ARN mensajero.

Complejo tradicional

• ARN mensajero
• ARN de transferencia
• ARN ribosomal

ARN ribosomal

• Está formado por tres sitios: A, P y E.
• El sitio A se encarga de aceptación del aminoacil ARNt y corresponde a la lectura del codón.
• En el sitio P, se elonga la cadena peptídica y se localiza el peptidil-ARNt.
• Finalmente, el ARNt sale del sitio E sin aminoácido.
• El ARN ribosomal permite la unión del ARNm al ARNt, catalizando la transferencia del aminoacil ARNt al peptidil ARNt.

Código genético

• Cada triplete o codón corresponde a un aminoácido.
• El mismo es continuo y no se superpone (no se puede utilizar una base para 2 aminoácidos).
• Los aminoácidos son codificados por más de un codón.

Bamboleo

• Las primeras bases de un codón son específicas; la tercera base puede ser intercambiada.

Fases de la traducción

• Activación de aminoácidos.
• Inicio de la síntesis proteica.
• Elongación de la cadena polipeptídica.
• Terminación de la síntesis de proteínas.

Activación de aminoácidos

• La enzima aminoacil-ARNt sintetiza aminoacil-ARNt y consume ATP en el proceso.
• La pirofosfatasa hidroliza grupos fosfato.
• Un aminoácido se une a un ARNt y genera aminoacil ARNt.
• El factor de iniciación(if) une a metionil-ARNt a la subunidad menor en el sitio P.
• Se reconoce el codón de inicio AUG (metionina) y se forma el primer enlace peptídico.
• IF4E e IF4G reconocen al ARNm por la identificación de la estructura 5'cap
• La subunidad menor recorre al ARNm hasta encontrar el codón de inicio (AUG).
• Se libera IF2 y la subunidad mayor forma complejo con la subunidad menor.

Elongación

• Se incorporan aminoácidos transportados por aminoacil-ARNt.
• El radical carboncillo del aminoácido se une con el radical amino del siguiente aminoácido.
• El aminoacil-ARNt se descodifica en el sitio A.
• Ocurre la transferencia del peptidil-ARNt al sitio P.
• Ocurre el desplazamiento del ribosoma.

Factores de elongación

• EF1 lleva el ARNt al sitio A.
• EF2 realiza la translocación del ribosoma.

Terminación

• Se encuentran codones de paro en el sitio A.
• Se utilizan factores de liberación que imitan al ARNt y reconocen el codón de terminación.
• Usan GTP para liberar a la proteína del complejo traduccional y permiten la disociación del ARNm y ARNt.

Daño y reparación del ADN

• Puede ser causado por factores endógenos y exógenos.

Daño endógeno

• Error replicativo: las ADN polimerasas cometen errores al insertar o duplicar nucleótidos incorrectos.
• Topoisomerasas: pueden causar mal alineamiento, desenrollamiento o imposibilidad de formar enlaces fosfodiéster.

Polimerasas con síntesis a través de la lesión

• La ADN polimerasa se detiene cuando hay daño en el ADN, reclutándose una polimerasa TLS.
• Las polimerasas TLS rellenan el espacio.

Desaminación espontánea

• Pérdida de un grupo amino en bases como citosina (convirtiéndose en uracilo), adenina (convirtiéndose en hipoxantina), y guanina (convirtiéndose en xantina).
• 5-metil citosina se trasnforma en timina.

TLS

• Polimerasa de síntesis

Sitios abásicos

• Ruptura del enlace N-glucosídico; pueden ser causados por hidrólisis espontánea, ADN glucosilasa, pH alto o altas temperaturas
• Ocurren en un sitio AP.

Daño oxidativo

• Radical superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidróxido (OH).
• Oxidación de bases nitrogenadas.
• 8-oxoguanina (8-oxo G) genera mutaciones G→T en la siguiente realización y se aparea erróneamente con adenina en lugar de citosina.
• Rupturas del ADN.
• El ROS ataca enlaces fosfodiéster, causando rupturas de hebra simple.
• Si no se reparan antes de la realización, pueden convertirse en rupturas de doble hebra.

Daño al ADN por agentes exógenos

• Radiación ionizante (transferencia lineal de energía) baja (rayos X y gamma) o alta (alfa, beta, gamma, neutrones; bajo LET del 65% genera ROS como 8-oxoguanina; el alto LET causa daño directo y ruptura de doble hebra.
• Radiación ultravioleta (UV-C, UV-B y UV-A), que causan la disorsión de la hebra e inducen union covalente entre bases (especialmente entre 2 timinas o citosinas), provocando la formación de dímeros de pirimidina (CPD)
• Agentes alquilantes (componentes dietéticos, tabaco, gas mostaza, ciclofosfamida y cisplatino), que generan enlace covalente entre misma hebra e inducen ruptura del enlace n-glucosídico (alterando la complementación y generando sitios AP)
• Aminas aromáticas, tabaco, combustibles y tintes industriales., que generan enlaces covalentes con la guanina en la posición C8 o adenina en C6.
• Hidrocarburos policíclicos aromáticos, presente en el humo de los coches y en comidas carbonizadas.
• Los mismos causan distorsión estructural en la doble hélice del ADN, bloqueo de la realización y transcripción, siendo causa de mutaciones puntuales.

Reparación

• El ADN puede ser reparado mediante reparación por escisión de bases, reparación por escisión de nucleótidos o mediante reparación mismatch/errores de emparejamiento
• Endonucleasa: Enzimas que cortan enlaces fosfodiéster dentro de la cadena.
• Exonucleasa: Enzimas que cortan enlaces fosfodiéster por fuera de la cadena.

Reparación por escisión de bases

• Se da cuando daños involucran 1 solos base (modificada por desaminación, la oxidación o alquilaciones)
• Las proteínas involucradas son la DNA glucosilasa, AP endonucleasa, DNA polimerasa beta y DNA ligasa.
• Proceso: La DNA glucosilasa reconoce la base dañada y deja un sitio abásico el cual es cortado por AP endonucleasa. La polimerasa then rellena el hueco y la DNA ligasa une la cadena
• La glucosilasa restaura la base correcta.

Reparación por escisión de nucleótidos

• Se da durante la transcripción de DNA o si la hélice contiene lesiones voluminosas, como lo es el caso de dimeros de pirimidina causados por radiación UV.
• Proceso: La distorsión de la doble hélice se reconoce, las hebras se abren and unaserie de enzimas eliminan varios nucleótidos en la zona dañada, La ADN polimerasa añade nucleótidos y la ADN las une. Durante el proceso la proteína de transcripción TFIIH separa las hebras con ayuda e la proteína RPA and las enocucleasas cortan la cadena hasta que la hélice se repara.

Reparación por mismatch/errores de emparejamiento

• El DNA puede ser reparado cuando hay errores en la replicación (inserciones, deleciones o errores de apareamiento de bases) usando los sistemas Mut que reclutan exonucleasas que eliminan un segmento de DNA dañado, para que luego una ADN polimerasa reinserta el segmento correcto.

Reparación por mismatch Especifico para guanina oxidada

• Proceso que se inicia con una enzima llamada DNA OGG1 (glicosasa para guanina oxidada)
• La enzima llama a una enzima Mut que quita un pedazo del DNA contaminado.
• Una ADN polimerasa crea une cadena de DNA nueva y la enzima que une (ligasa) une la cadena, restaurando la secuencia original.

Reparación no homóloga

• Se activa cuando hay rupturas en ambas cadenas de DNA.
• La rupturas estimulan una proteína ATM encargada de emitir una señal y la proteína P53 deteniene el ciclo celular. Los partes que se encuentran en los extremos del DNA se agarran/protegen con proteína Ku para poder atraer una cinasa encargada de activar una exonucleasa (Artemisa) y empezar a cortar un pedazo de la cadena, hasta que los partes que se encuentran en los extremos de ambas hebras queden iguales. Después, la cadena se une gracias a la enzima ligasa.

Recombinación homóloga contra reparación no homóloga

• En reparación no homologa, es importante recordar que los pedazos que se encontraban cortando de ambas hebras se pierden forever; este tipo de alteración no es aceptable en cromáticas hermanas.
• Para cromátidas durante la división célular, en vez, existe la reparación mas precisa y elaborada , llamada recombinación homóloga.
• En recombacion homologa, los rayos UV primero rompen el DNA, lo cual se llama a "ATM". Seguido, la rotura del DNA provoca que llegue la sistemas MRN (proteínas reparadoras encargadas de mantener hebras de DNA separadas. Después un conjunto de proteínas (BRCA 1 y 2, y RAD 51) trasladan una hebra del DNA dañado a una cadena no dañado con las mismas seccuencia genéticas. La hebra donada recibe pedacitos de la hebra hermana, de tal manera que la hebra con roturas de DNA queda completada al leer las instruciones en ala DNA correcto (es básicamente copiar y pegar.