유전자 클로닝 및 유전자 라이브러리

유전자 클로닝

• 특정 유전자의 염기서열을 분리하여 벡터(vector)에 삽입하고, 이를 숙주 세포(host cell)에 도입하여 동일한 유전자를 다수 복제하는 분자생물학적 기법입니다.
• 유전자 집합에서 한 종류의 유전자를 분리하고 증폭하는 과정입니다.
• DNA 분자 하나가 하나의 숙주세포 안으로 들어가도록 유전자 도입을 합니다.
• 특정 DNA를 포함하는 숙주세포의 집합체를 선별하여 클론(Clone)을 얻는 과정입니다.

유전자 라이브러리

• 한 생명체의 조작이나 세포의 모든 유전자를 포함하는 DNA 클론 집단입니다.
• 생물의 전체 유전체(DNA) 또는 mRNA에서 유래된 cDNA 조각들을 벡터(vector)에 삽입하여 형질전환된 숙주 세포의 집합체를 의미합니다.
• 특정 유전자를 분리, 분석, 발현 연구하거나 단백질을 생산하는 데 활용됩니다.
• 유전자를 잘게 분절하여 벡터에 삽입한 뒤 形質轉換을 통해 숙주 세포에 도입합니다.
• 이 과정에서 각각의 세포는 하나의 DNA 조각을 포함하게 되어, 전체 세포 집합이 원본 DNA의 전체 유전자 정보를 보유합니다.
• 스크리닝은 라이브러리 속에 존재하는 표적 유전자를 골라내는 작업입니다.

유전자 라이브러리 제조

• 유전자의 분리는 핵산의 분리를 통해 이루어집니다.
  • 플라스미드 DNA, 세포의 유전체 DNA, 파지 DNA, RNA, mRNA 등을 분리합니다.
• 핵산의 침전과 보관, 핵산의 농도 측정이 중요합니다.
• 벡터와 연결(벡터에 삽입)하는 과정이 필요합니다.
• 파지나 숙주세포로의 도입도 중요합니다.

유전자 라이브러리 제조-유전자 분리 단계

• 유전체 DNA 분리 시에는 전체 염색체 DNA를 추출하여 이후 조각 내 삽입을 위한 기초자료로 사용합니다.
• 방법은 세포 파쇄 (lysis buffer, 단백질 분해효소 사용)→ 유기 용매 추출(phenol-chloroform)→에탄올 침전 순으로 진행됩니다.
• mRNA로부터 cDNA 합성 및 분리 시 단백질을 암호화하는 유전자(발현 유전자)만 포함하는 라이브러리를 제작합니다.
  • 폴리-A 테일을 가진 mRNA를 Oligo-dT primer로 선택합니다.
  • 역전사효소(reverse transcriptase)로 cDNA 합성합니다.
  • RNase H와 DNA polymerase로 2가닥 cDNA 완성합니다.

유전자 라이브러리 제조 - 벡터에 삽입

• 벡터에 유전체 DNA를 삽입합니다.
  • 벡터 종류로는 플라스미드, 파지, BAC, YAC 등이 있습니다.
  • 삽입 과정은 유전체 DNA를 제한효소로 절단(혹은 부분절단)하고, 동일한 제한효소로 처리된 벡터에 ligase로 연결하는 것입니다.
• 벡터 내 삽입된 DNA는 유전 정보를 무작위적으로 포함합니다.

유전자 라이브러리 제조-벡터에 삽입

• 벡터에 cDNA를 삽입합니다.
• 벡터 종류에는 발현 벡터, 플라스미드, 파지 등이 있습니다.
• 삽입 과정에서는 cDNA 양 끝에 제한효소 자리 부가가 필요하며, 벡터와 함께 ligation을 진행합니다.

유전자 라이브러리 제조 예시

• 유전체 DNA 라이브러리의 예시로는 인간 유전체 라이브러리 (Human Genome Project에서 사용)가 있습니다.
  • 벡터로는 BAC (Bacterial Artificial Chromosome), λ 등이 사용됩니다.
• cDNA 라이브러리의 예시로는 간세포의 발현 유전자 라이브러리 (예: 간 특이적 단백질 발현 확인)가 있습니다.
  • 벡터로는 pUC, pBluescript 계열 플라스미드, λ phage, 표현벡터 등이 사용됩니다.

유전자 라이브러리 제조 시 주의할 점

• DNA 순도: 단백질 및 RNase 오염 제거가 필수적입니다.
• 제한효소 절단: 부분 절단 조절로 DNA 조각 길이를 유지해야 합니다.
• 라이게이션 효율: 벡터:insert 비율을 최적화해야 합니다.
• 숙주 세포 선택: 형질전환 효율이 높고, 재조합 DNA 유지 능력이 강한 균주가 필요합니다.
• 라이브러리 다양성: 가능한 한 많은 clone 확보해야 rare gene도 포함됩니다.
• 스크리닝 전략: 원하는 유전자를 식별할 수 있는 시스템이 필요합니다 (예: hybridization, PCR, reporter assay 등).

스크리닝 방법

• 혼성화(hybridization)에 의한 스크리닝
  • 방사성 표지 탐침, 중합효소 반응법 (Primer Extension or Nick Translation), 말단표지법 (End-labeling), 비방사성 표지 탐침 등을 사용합니다.
• 항체결합에 의한 스크리닝 (Immunoscreening)
• 발현 차이를 이용한 스크리닝 (Differential Expression Screening)
• 단백질-결합 기반 스크리닝
  • 효모 이중 하이브리드법 (Yeast Two-Hybrid Assay), 파지 디스플레이법 (Phage Display) 등을 사용합니다.
• 기능에 기반한 스크리닝 (Functional Screening)

스크리닝 방법-혼성화(hybridization)에 의한 스크리닝

• 방사성 표지 탐침
  • 32P, 35S 등의 방사성 동위원소로 라벨된 DNA 또는 RNA 탐침을 사용합니다.
  • X-ray film에 노출하여 autoradiography로 검출하며, 민감도가 매우 높습니다.
  • 방사선 취급 필요 및 폐기물 문제가 발생합니다.
• 중합효소 반응법 (Primer Extension or Nick Translation)
  • DNA polymerase를 이용하여 탐침 DNA의 일부를 합성하며 표지된 뉴클레오타이드를 도입합니다.
• 말단표지법 (End-labeling)
  • 폴리뉴클레오타이드 키나아제(polynucleotide kinase)를 이용해 탐침의 말단에 방사성 또는 비방사성 표지를 부착합니다.
• 비방사성 표지 탐침
  • Digoxigenin (DIG), biotin, fluorescein 등을 사용하며, 효소(conjugated enzyme) 또는 항체를 통해 colorimetric, chemiluminescent detection을 합니다.
  • 안전하고 재사용 가능하지만 방사성에 비해 민감도가 다소 낮습니다.

스크리닝 방법-항체결합에 의한 스크리닝

• 라이브러리에서 특정 단백질(항원)을 발현하는 클론을 선별합니다.
• 클론을 배양하여 단백질을 발현하고, nitrocellulose membrane에 전사합니다.
• 1차 항체로 항원을 인식하고, 2차 항체(효소 표지 항체)로 결합 후 colorimetric 또는 chemiluminescence로 검출합니다.
• 단백질 수준에서 직접 검출이 가능하나, 항체가 필요하고 단백질 발현 체계의 조건 맞춤이 필요합니다.

스크리닝 방법-발현 차이를 이용한 스크리닝

• 두 조건 간 발현량 차이가 나는 클론을 식별합니다.
• cDNA 라이브러리 중 질병 vs 정상에서 발현이 다른 유전자 탐색에 활용됩니다.
• Differential hybridization: 두 조건의 표지 탐침을 각각 이용하여 hybridization 신호 차이로 비교합니다.
• 발현량 조절 유전자 발굴, 조직 특이적 유전자 탐색 등에 응용됩니다.

스크리닝 방법-단백질-결합 기반 스크리닝

• 효모 이중 하이브리드법 (Yeast Two-Hybrid Assay)
  • 두 단백질이 상호작용할 경우 reporter gene 발현을 이용합니다.
  • Bait: DNA-binding domain과 융합된 단백질 A와 Prey: activation domain과 융합된 단백질 B로 구성됩니다.
  • 상호작용 시 reporter gene (예: LacZ, HIS3 등)이 발현되어 선별 가능합니다.
  • 단백질-단백질 상호작용 스크리닝에 사용됩니다.
• 파지 디스플레이법 (Phage Display)
  • 단백질 또는 펩타이드를 박테리오파지 외막 단백질과 융합하여 파지 표면에 발현합니다.
  • 원하는 결합체(항체, 수용체 등)에 파지를 노출하여 결합하는 파지를 선택합니다.
  • 높은 다양성, 반복 선별이 가능하며, 항체 개발, 리간드 탐색, 펩타이드 라이브러리 분석 등에 응용됩니다.

스크리닝 방법 - 기능에 기반한 스크리닝

• 목적: 특정 기능을 수행할 수 있는 클론을 선별합니다.
  • 항생제 내성 유전자를 가진 클론만이 선택 배지에서 생존하는 방식을 예로 들 수 있습니다.
  • 효소 기능을 가진 클론은 색 변화 유도 기질을 사용합니다.
• 장점은 유전자 발현 및 단백질 기능이 일치하는 경우 직접적 스크리닝이 가능하다는 점입니다.
  • 환경에서 유래된 메타지노믹 DNA 라이브러리에서 새로운 효소 탐색에 활용됩니다.
  • 특정 대사산물 생산 가능 유전자 탐색에도 사용됩니다.

중합효소 연쇄반응법(PCR)

• 유전자 라이브러리의 스크리닝에 의하지 않고도 유전자를 빠르게 얻을 수 있는 방법입니다.
• PCR Components에는 DNA Sample, Primers, Nucleotides, Taq polymerase, Mix Buffer, PCR Tube 등이 있습니다.
• PCR Process (ONE Cycle)는 95°C에서 Denaturing, 55°C에서 Annealing, 72°C에서 Extension 순으로 진행됩니다.

PCR에 사용하는 내열성 중합효소의 종류 및 특징

• Taq (Thermus aquaticus): 5'-3' 말단분해효소 활성을 가지며, 95℃에서 40분 열 안정도를 보입니다.
• Tth (Thermus thermophilus): 5'-3' 말단분해효소 활성을 가지며, 95℃에서 20분 열 안정도를 보입니다.
• Deep vent (Pyrococcus sp): 3'-5' 말단분해효소 활성을 가지며, 비점착성 말단을 갖습니다.
• Pfu (Pyrococcus furiosus): 3'-5' 말단분해효소 활성을 가지며, 비점착성 말단을 갖습니다.

PCR 최적화

• 프라이머는 PCR(중합효소 연쇄반응)에서 표적 DNA를 증폭시키기 위해 사용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오타이드입니다.
  • Taq polymerase가 결합할 수 있는 시작점을 제공하는 역할을 합니다.
• 프라이머 디자인의 기본 조건은 다음과 같습니다.
  • 길이: 1824, GC 함량: 4060%, Tm(녹는점): 55~65°C (Forward와 Reverse 간 ±2°C 이내), 구조: Hairpin, dimer 형성 회피, 3' 말단: G/C로 끝나면 안정적 결합 유도 (GC clamp)
• 디자인 주의사항
  • 자기 상보성 회피: 자기 자신과 결합해 hairpin 구조를 만들지 않도록 설계합니다.
  • 프라이머 간 상보성 회피: Forward/Reverse 프라이머 간 결합 방지 (primer dimer 방지)합니다.
  • 특이성 유지: 타겟 유전자 외 다른 영역에 결합하지 않도록 고유한 서열을 선택합니다.