การสกัดกรดนิวคลีอิกในตัวอย่างทางคลินิก

การสกัดกรดนิวคลีอิกจากตัวอย่างทางคลินิก

• วิธีการสกัดกรดนิวคลีอิกมีหลากหลายวิธี ได้แก่
  • วิธีเฟสแข็ง (Solid-Phase)
  • วิธีเกลือไล่ออก (Salting-out)
  • วิธีฟีนอล-คลอโรฟอร์ม (Phenol-Chloroform)

เป้าหมายการเรียนรู้

• อธิบายวิธีการสกัดกรดนิวคลีอิก
• อธิบายขั้นตอนการสกัดกรดนิวคลีอิก
• อธิบายคุณสมบัติของสารเคมีที่ใช้ในการสกัดกรดนิวคลีอิก

ชนิดของตัวอย่าง

• เลือด (Whole blood, Buffy coat)
• เซลล์ (Cells)
• เชื้อจุลินทรีย์ (Microorganisms) เช่น ไวรัส, แบคทีเรีย, รา
• สารคัดหลั่งจากกระพุ้งแก้ม (Swab)

วิธีการสกัดดีเอ็นเอ (Genomic DNA)

• Cell lysis: การทำลายเซลล์เพื่อปลดปล่อยดีเอ็นเอ
  • ใช้ Buffer Lysis
• Extraction: การสกัดดีเอ็นเอ
  • ใช้ Phenol Chloroform
  • ใช้ Salting-Out
  • ใช้ Solid Phase
• Precipitation/Washing: การตกตะกอนและทำความสะอาดดีเอ็นเอ
  • ใช้ Isopropanol/Ethanol
• Suspension/Elution: การนำดีเอ็นเอออกมา
  • ใช้ TE buffer

ส่วนประกอบของ Buffer Lysis

• เบต้า-เมอร์แคปโทอีธานอล (Beta-mercaptoethanol): ช่วยลดปฏิกิริยาออกซิเดชัน
• Triton X-100 หรือ SDS: ช่วยละลายเยื่อหุ้มเซลล์
• กัวนิดีนไทโอไซยาเนต: ช่วยแยกโปรตีนออกจากดีเอ็นเอ
• โปรตีเอสเค (Protease K): ทำลายโปรตีน
• RNase A หรือ RNase H : ทำลาย RNA ป้องกันการปนเปื้อน

วิธีฟีนอล-คลอโรฟอร์ม (Phenol Chloroform Extraction)

• ฟีนอลและคลอโรฟอร์มเป็นตัวทำละลายที่แยก ดีเอ็นเอ หรืออาร์เอ็นเอ จากสารปนเปื้อน based on ความสามารถในการละลายที่แตกต่างกัน
• วิธีนี้เป็นวิธีมาตรฐานทองคำ (gold standard) ในการผลิตดีเอ็นเอคุณภาพสูง
• Phenol มีความสัมพันธ์สูงกับโปรตีน ทำให้โปรตีนแยกตัวออกจากสารละลาย
• Chloroform ทำหน้าที่แยกส่วนผสมของเหลวจากส่วนที่เป็นของเหลวอินทรีย์
• ใช้ Isoamyl Alcohol เพื่อลดการฟูมและสลาย RNase

วิธีเกลือไล่ออก (Salting-Out Method)

• เป็นวิธีเลือกใช้อีกวิธีหนึ่งเพื่อหลีกเลี่ยงการใช้สารเคมีที่เป็นพิษ
• การเพิ่มเกลือ เช่น Sodium Chloride, Potassium Acetate หรือ Ammonium Acetate ทำให้โปรตีนสูญเสียความสามารถในการละลายและเกิดการตกตะกอน
• ข้อจำกัดหลักของวิธีนี้คือ คุณภาพของดีเอ็นเอที่สกัดได้อาจไม่บริสุทธิ์เท่ากับวิธีอื่น

วิธีเฟสแข็ง (Solid-Phase Extraction)

• DNA จะยึดติดกับเมทริกซ์เฟสแข็ง (เช่น ซิลิกา, แม่เหล็ก) ขณะที่สารปนเปื้อนถูกกำจัดออก
• DNA มีประจุลบ จึงเกาะติดกับเมมเบรนซิลิกาที่มีประจุบวกขณะทำการปั่น
• ทำให้ได้ดีเอ็นเอคุณภาพดีขึ้น แต่ปริมาณที่ได้อาจน้อยกว่าวิธีอื่น

วัสดุและอุปกรณ์ที่ใช้ในการสกัดกรดนิวคลีอิก

• หลอดทดลอง
• หลอดปั่นหมุนเหวี่ยง
• เครื่องปั่นหมุนเหวี่ยง
• เครื่องปั่นหมุนเหวี่ยงแบบ Solid-Phase (ถ้าใช้)
• ชุดเคมี
• เครื่องมือวัด
• อุปกรณ์อื่น ๆ

Buffer ที่ใช้ในการสกัดกรดนิวคลีอิก

• Buffer Elution (ใช้ออก DNA)
• Low-Salt Buffer (จะลดปฏิกิริยาทางไฟฟ้าสถิตย์
• Nuclease-Free Water

การสกัด RNA

• ขั้นตอนคล้ายกับการสกัด DNA แต่ใช้สารเคมีที่แตกต่างกัน เช่น Tris-HCI, Guanidine Thiocyanate
• มี Buffer ชนิดพิเศษที่ใช้ในกระบวนการสกัด RNA เช่น Trizol

RNA Extraction: วิธีฟีนอล-คลอโรฟอร์ม

• การเตรียมตัวอย่าง
• การ Homogenize
• การแยกเฟส
• การสกัด/ตกตะกอน
• การละลาย
• การทำ pellet RNA

ข้อดีข้อเสียของแต่ละวิธีการสกัด

• การสกัดโดยวิธีฟีนอล-คลอโรฟอร์ม (Phenol-Chloroform): มีข้อดี คือ คุณภาพดี แต่มีข้อเสียคือ ใช้เวลานานและมีสารเคมีอันตราย
• การสกัดโดยวิธีเกลือไล่ออก (Salting-out): มีข้อดี คือ ง่ายและประหยัด แต่มีข้อเสีย คือ คุณภาพสารสกัดต่ำ
• การสกัดโดยวิธีเฟสแข็ง (Solid-Phase): มีข้อดี คือ วัสดุบริสุทธิ์ รวดเร็ว แต่มีข้อเสียคือ ราคาแพง

เครื่องมืออัตโนมัติ

• VERSA (อัตโนมัติเต็มรูปแบบ): เหมาะกับการสกัดกรดนิวคลีอิกจำนวนมาก
• ADNAP (กึ่งอัตโนมัติ) การใช้เม็ดแม่เหล็กเพื่อจับหรือแยกโมเลกุล DNA

การประยุกต์ใช้ในทางคลินิก

• การตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อ (เช่น วัณโรค, ไวรัสตับอักเสบ)
• การตรวจทางพันธุกรรม (เช่น ธาลัสซีเมีย, มะเร็งเม็ดเลือดขาว)
• การศึกษาการแสดงออกของยีน