מבוא למיקרוביולוגיה: עץ פילוגנטי ויכולות מטבוליות

מבוא למיקרוביולוגיה

• מיקרוביולוגיה היא תחום העוסק בחקר מיקרואורגניזמים.

שיעור 1: הקדמה

• עץ פילוגנטי הוא גרף המתאר היסטוריה אבולוציונית, המבוסס על נתונים רצפיים של דנ"א או חלבונים.
• המרחק האבולוציוני בין זוגות רצפים נקבע לפי הדמיון ביניהם.
• עץ פילוגנטי מתחיל בשורש וממשיך בהתפצלויות המייצגות קבוצות שונות של אורגניזמים.
• הקו האדום הימני בעץ מכיל את כל בעלי החיים והפטריות, בעוד שהקו השמאלי מייצג צמחים ואצות.
• כל נקודה אדומה בעץ מייצגת filum שלם ללא אורגניזם אחד בתרבית, אלא רק עדויות סביבתיות.
• רוב המחקרים נערכים על חלק קטן מאוד מהמגוון הגדול בעולם.

יכולות מטבוליות

• המגוון המטבולי של חיידקים גדול יותר משל צמחים ובעלי חיים בכללותם.
• ההמרה של פחמימות בנוכחות חמצן לפד"ח ומים (CarbonHydrates + O2 → CO2 + H2O) מתרחשת גם בצמחים וגם בבעלי חיים.

השפעת החיידקים על האדם

• החיידקים מגדירים את תנאי הקיום הקיצוניים ביותר, במצבים שבני אדם ויצורים אאוקריוטים אחרים אינם יכולים להתקיים, נקראים אקסטרמופילים - extremophiles.
• מחלות מדבקות, כמו המוות השחור ואבעבועות שחורות, נגרמו מחיידקים וגרמו לתמותה המונית.
• חיידקים משתתפים במארג המזון ובחקלאות, למשל, קיבוע חנקן, מחזור חומרים בקרקע, ופירוק מולקולות מורכבות אצל מעלי גירה (Rumen).

תעשייה ועולם המזון

• תסיסה היא תהליך אנאירובי שבו חיידקים מפרקים סוכר ומייצרים תוצרים שונים.
• תעשייה משתמשת בחיידקים לטיפול בשפכים, ניקוי קרקעות מזוהמות, ייצור אינסולין ושימושים רפואיים.

סיווג העולם המיקרוביולוגי

• בקטריה וארכאה הן פרוקריוטים (חסרי גרעין ואברונים).
• האאוקריוטים התפצלו מתוך הארכאות.
• וירוסים אינם מסווגים כחלק מעולם החי ואינם שייכים לעץ הפילוגנטי; סיווגם נעשה לפי הגן המקודד לרנ"א ריבוזומלי.

שיטות מחקר

• מיקרוסקופיה (מסתמכת על מיקרוסקופ אור ואלקטרונים)
• תרביות (יכולת לגדל את היצורים במעבדה)
• מיקרוביולוגיה שאינה תלוית תרבית (לימוד פעילות החיידק בסביבה)

מיקרוסקופים

• המיקרוסקופ הראשון הומצא במאה ה-17 ע"י רוברט הוק.
• אנטוני ואן לוונהוק ההולנדי היה הראשון שצפה בחיידקים ב-1676.
• פרדינד קוח עסק בסיווג מורפולוגי.
• עוצמת ההגדלה ורזולוציה (המרחק הקטן ביותר בין שני עצמים שאפשר להבדיל ביניהם) הם פרמטרים מרכזיים של מיקרוסקופ..
• לא לכל החיידקים יש פיגמנטים לכן פותחו חומרים לצביעתם כדי שניתן יהיה לראות אותם.

צביעה

• באופן כללי הצבען הוא חומר טעון חיובית שנקשר לחומר טעון שלילית בתא החיידק.
• השמן עוזר לאור לעבור לינארית.
• מיקרוסקופ מכיל עדשות אובייקטיב (מבצעת את רוב ההגדלה) ועדשת אוקולר (המוסיפה הגדלה של פי 10).

גרהאם

• הנס בריסטאן גרהאם המציא את צביעת גרהאם, פרוטוקול צביעה בו חלק מהחיידקים נצבעו בצבע אחד וחלק באחר.
• שמים צבען ראשון, שוטפים אותו והוא נשאר קשור לחלק מהחיידקים (גרהאם חיובי).
• צובעים עם צבען אחר שנקשר לכל החיידקים וכך מי שנותר שקוף נצבע גם הוא (גרהאם שלילי).

מבנה הממברנה

• הקורלציה בין סיווג גרהאם לעץ הפילוגנטי נובעת מכך שהממברנה זהה לתא האם.
• גרהאם חיובי: דופן תא עבה של פפטידוגליקנים שהצבען הראשון נקשר אליהם.
• גרהאם שלילי: ממברנה נוספת מעל דופן התא הדקה יותר.

מיקרוסקופיה פלואורסנטית

• שיטה נוספת שבה מאירים על הדוגמה בצבע מסוים ואז החומר הפלואורסנטי מחזיר את האור בצבע שקרוב יותר לסקאלה האדומה.
• יכול לצבוע דגימה במספר חומרים פלורסנטים, למשל DAPI הנקשר לדנ"א או מולקולת אוליגונוקלאוטידים הקשורים לחומר פלורסנטי (צביעת FISH).
• צובעים באמצעות חלבונים, כמו GFP שאפשר להנדס חיידקים שיכילו את הגן ואז רואים את החלבון כאשר התא עדיין בחיים.
• מיקרוסקופיית אלקטרונים: במקום להקרין פוטונים מקרינים אלקטרונים, מה שמאפשר רזולוציה גדולה לאין ערוך (מאפשר להבין את הרמה התוך תאית).

מצעי גידול

• לואי פסטר היה הראשון שהגה את הרעיון של מצע גידול; הוא הוכיח שתהליך ייצור היין (הפיכת סוכר לאלכוהול) הוא תהליך ביולוגי.
• הוא הפריך את תיאוריית הבריאה הספונטנית והוכיח באמצעות מכשיר שאפשר לאוויר להיכנס לתוך הדוגמה אבל לא לחומרים ביולוגים ושום דבר לא גדל.
• רוברט קוח פיתח את הפוסטולטים (כללים) שגורם מחלה צריך לעמוד בו: לקחת דגימה מחולה, בידוד וגידול החיידק בתרבית, הדבקה של מודל בריא בתרבית המבודדת כך שהוא מפתח את המחלה, בידוד מהחולה החדש את החיידק.
• בשביל לבודד מיקרואורגניזמים מהסביבה צריך מצע גידול מוצק ולא נוזלי כי אז הם מתערבבים (זה לא טריוויאלי).
• יוליוס פטרי המציא את צלחת הפטרי.
• וולטר הסה התייעץ עם אשתו שהייתה שפית והיא סיפרה לו שהם משתמשים לפעמים בחומר המופק מאצות – אגר במקום ג'לטין.
• ברינג הגה את רעיון מצע ההעשרה, בו משתמשים עד היום כדי לברור חיידק מהסביבה באמצעות תנאים מסוימים.

מבנה של חיידקים

• אמנם חיידקים הם קטנים אך יש טווח רחב של גדלים אפשריים; הנהוג במעבדות שימוש בפילטרים שגודל החור שלהם הוא 0.2 מיקרון.
• לחיידקים גדולים יש בד"כ גופיפים של חומר לא מומס (חומר תשמורת).
• ההגבלה המרכזית לגודל של חיידק נובעת מיחס שטח פנים לנפח.

תכונות המשותפות לכל החיידקים

• מבנית: לכולם יש ממברנה ציטופלזמטית, ציטופלסמה, גנום שעשוי מדנ"א, ריבוזומים ופלסמידים.
• מטבוליזם: חילוף חומרים עם הסביבה אנבוליזם וקטבוליזם.
• חלוקה: גדילה.
• אבולוציה: כולם משתנים.

תכונות שיש לרוב החיידקים

• דיפרנציאציה (למשל היצירה של Spore תאי קיימא).
• תקשורת בעיקרה בינם לבין עצמם. מ
• מעבר גנים אופקי.

:cell envelope – מעטפת התא

• הממברנה הציטופלזמטית מורכבת משכבה כפולה של פוספוליפידים (ביילר).
• תפקידי הממברנה הציטופלזמטית חילוף חומרים סלקטיבי עם הסביבה, עיגון חלבונים (בעיקר כאלו שתפקידם הוא תקשורת לסביבה) וייצור אנרגיה .
• בדופן התא קיימת שכבת פפטידו גליקן עבה יותר בחיידקי גרהאם חיובי.
• בתאי גרהאם חיובי יש חוטי Teichoic acid.

מבנה חיצוני

• קיים קפסולה או סליים (בד"כ עשוי מפוליסכרידים) שמאפשרים: אדהזיה, הגנה מעקות והתגוננות מפני מערכת חיסון.
• לחלק מהחיידקים יש pili או Fimbriae שתפקידן ביצוע קוניוגציה וגם תנועה.
• איברים אחרים בשם flagella משמשים בעיקר לתנועה; הם סוג של מנוע ביולוגי הפועל באמצעות מנוע ביולוגי – כמו דינמו שמונע ממפל ריכוזים של פרוטונים.

סוגי תנועה:

• תנועה ע"י פלאגלה: החיידק מבצע תנועה בשם Tumble (תנועה אקראית).
• תנועה שנייה היא תנועה בכיוון מוגדר, לפעולה זו קוראים Run.
• סמי-אקראית כי לחיידקים של מנגנון של בימו-טקסיס שבעצם הבקטריה נעה בעקבות מפל ריכוזים של גורם סביבתי כלשהו
• Twitching: מתווכת ע"י הפילוס וזו תנועה על גבי משטח.
• Gliding מערכות חלבוניות שעוטפות את התא כמו סליל כמו בורג ומניעות אותו קדימה.

מבנים פנימיים

• אנדוספורה – התפקיד זהה לתפקיד של זרע של צמח – התא רדום והוא מחכה לתנאים טובים יותר.
• אנדוספורות קיימים גם בפטריות ובעיקר בגרהאם חיובי. זה בעצם תא נוסף שתא האם יוצר ומתבצעת חלוקה א-סימטרית.
• האנדוספורה בנוי מחומרי התשמורת והמנגנונים המולקולריים של תא האם עד שלבסוף תא האם עובר ליזיסיס ונשאר רק הספורה; הם בנוי מחלבונים שנקראים SSPE שעמידים מאד .

שיעור 2: מבנה חיצוני

• קטבוליזם – ייצור אנרגיה בתהליך מולקולרי (בעיקר ע"י שימוש בATP).
• אנבוליזם – בניה של מולקולות ע"י הפקת אנרגיה מהקטבוליזם.
• אנרגיה חופשית: כמות האנרגיה הזמינה לבצע עבודה.
• בוח מחזר: מקור של אלקטרונים.

ראקציות

• על אותה מערכת של מטבוליזם (של החוק הראשון של התרמו-דינמיקה) אפשר להסתכל דרך הפריזמה של אלקטרונים – מולקולה מחזרת (תורמת אלקטרונים) ומולקולה מחמצנת (מקבל אלקטרונים).
• בתנאים סטנדרטים האנרגיה החופשית של גיבס היא AG°' = -2895 kJ/mol.
• נשימה היא תהליך אקסארגוני, כלומר פולט אנרגיה. תהליך שצורך אנרגיה נקרא תהליך אנדרגוני.

המשך חמצון חיזור

• המחקר Sergei Winogradsky גילה חיידק מסוים וראה שהמטבוליזם שלו הוא ע"י חמצון גופרית (אקסארגוני).
• המושג בימו-ליטו-טרופים (ליטו – מלשון סלעים) שניזונים מראקציות חומרים לא אורגניים אלא מינרלים.

סיווג

• בהקשר של קטבוליזם (במה הם משתמשים כדי לייצר אנרגיה) היצורים הם פוטו/כימו טרופים.
• בהקשר של אנבוליזם (במה הם משתמשים כדי לייצר מולקולות): פוטו-סינטטיים (לייצר חומר לקבע חמצן).
• ניתן לסווג את הפוטוסינטטים לפוטוסינתזה אוקסיגנית או אנ-אוקסיגנית.
• סיווג נוסף אוטו/הטרו-טורפים – האם הם מייצרים בעצמם את המזון שלהם; בימו- טורפים ניזונים מראקציות כימיות בהם החומר המחזר הוא אורגני,או שהחומר המחזר הוא לא ארוגני (מימן, ברזל מחוזר, גופרית). כמעט תמיד הבימו-ליטו-טורפים הם אוטו-טורפים.
• נשימה אירובית – מקבל האלקטרונים הוא חמצן, נשימה אנאירובית כל ראקציה אחרת בה מקבל האלקטרונים הוא לא חמצן.

אנזימים

• התהליך המוגדר כאקסרגוני לא אומר שראקציה תתרחש באופן ספונטני אלא אם ישנו אנזים, קטליסט ביולוגי של תהליכים.
• אנזימים מורידים את אנרגיית האקטיבציה של התהליך.
• ליזוזים (נמצא בדמעות למשל) יודע לפרק את הקשר הגליקוזידי שבין תת היחידות הסוכריות של הפפטידו-גליקן.

מערכת הולכת אלקטרונים

• אחד מחצאי הראקציה ב - Redox tower המשמשים להעברת אלקטרונים בתא לדוגמא NAD+/NADH
• בתא יש המון חומר מחזר ולפיכך בעת שקיימת פעולת חמצון אנזים מסוים תהיה מערכת תלוייה בחיזור NAD.

קטבוליזם בכימו-אורגנו-טורפים

• גליקוליזה (הסובסטרט הוא סובר-גלוקוז ומסיימים בפירובט ובס"ה הכל נוצרות ארבע מולקולות ATP( ומעגל חומצת הלימון המתרחשים בתהליך הנשימה.
• חיידקים יודעים להשתמש לא רק בגלוקוז אלא בחומרים אורגנים אחרים וברוב המקרים יש להם מערכות שיודעות להכניס את הסובסטרט לתוך הגליקוליזה ( Glyoxylate) .
• תסיסה מערכת שמתקיימת בחיידקים של מערכת הגליקוליזה אך הפירובט לא נכנס למעגל חומצת הלימון אלא בסופו של דבר נפלט כפסולת: כוהל או חומצה (חומצה לקטית למשל).
• במקום חמצן אפשר להשתמש בקולט אלקטרונים אחר כמו ניטרט ולקבל נשימה אנאירובית; קיימים e.coli שיכולים לבצע גם נשימה אירובית וגם אנאירובית ולכן יש לו מערכות שרשרת.

אנבוליזם (ביוסינתזה)

• מעגל קלווין תלוי באנזים רוביסקו (RuBisCo) צורך הרבה ΑΤΡ וכוח מחזר.
• קיבוע חנקן: משתמש באנזים בשם ניטרוגינז (Nitrogenase)
• ביוסינתזות נוספות הן כמובן פולי-סברידים (מה שנמצא בדפנות התא), חומצות אמינו, חומצות שומן.
• מפתח ראשיים לקטגוריות הגנים תחת שתי הסווגים כבגרף*

מצעי גידול

• define, שמים כמויות מדודות מראש של מרכיבים לפי מה שידוע שהחיידק צריך בתוך מים מזוקקים.
• complex (לוקחים digest של תאים, כלומר חומר צמחי/יונקי/מיקרוביאלי ומפרקים את התאים ומשתמשים בתכולת התאים כמצע גידול).
• אפשר לבנות מדיום סלקטיבי וגם מדיום מבדל (דיפרנציאלי).

ספירת חיידקים

• מסתכלים מיקרוסקופית על שטח שנפח הנוזל בו ידוע מראש וסופרים את יחס החיידקים לנפח.
• המיהול העשרוני הוא שיטה בה מוהלים את התרבית המקורית ככה שהיא מהווה עשירית מכל דגימה; למדידת חיידקים אופטית מקרינים על חיידקים אור באורך גל מסוים (540-600 ננומטר) והאור מתפזר.
• לכל מכשיר יש טווח תוצאות אמת (dynamic range) – בצפיפות נמוכה אין למכשיר יכולת למדוד את החיידקים באמת וכן הלאה.